劉鵬 劉萬禮 郭佳 王鴻發(fā)

摘要：目的：研究泰樂菌素發(fā)酵中的雜質(zhì)DMT在一定程度上對放罐組分A含量的影響。方法：通過高效液相色譜檢測組分含量變化，并對雜質(zhì)DMT的結(jié)構(gòu)及生物合成通路進(jìn)行理論分析。結(jié)果：雜質(zhì)DMT亦稱脫阿洛糖泰樂菌素，是由于生物合成通路中阿洛糖基轉(zhuǎn)移酶的活性過低或阿洛糖的底物濃度過低，產(chǎn)生的一種代謝副產(chǎn)物;放罐時DMT的面積含量為1.7%。結(jié)論：在發(fā)酵過程中可以通過添加相應(yīng)基礎(chǔ)料來提高阿洛糖的底物濃度，或通過細(xì)化工藝調(diào)控來提高阿洛糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，進(jìn)而保證生物合成路徑正常進(jìn)行，提高泰樂菌素放罐組分，為后提煉產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量奠定了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：泰樂菌素 ;雜質(zhì)DMT;阿洛糖;放罐組分

泰樂菌素（Tylosin，簡稱TL） 又稱泰樂霉素，是一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由弗氏鏈霉菌（S.fradiae）發(fā)酵代謝產(chǎn)生 [1-3]，天然TL中含有四種具備生物活性的組分，即A、B、C和D（圖1）。由于泰樂菌素具備抗菌譜廣、生物利用度高和促生長等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中的支原體疾病治療和飼料添加劑[4]。

目前，泰樂菌素發(fā)酵中的雜質(zhì)DMT在一定程度上影響放罐組分A含量，仍是現(xiàn)今社會研究的熱點(diǎn)方向之一。因此，本論文通過研究分析發(fā)酵中的雜質(zhì)DMT變化對放罐組分A的影響，來指導(dǎo)調(diào)控發(fā)酵工藝過程。

1. 器材與試劑

器材：高效液相色譜儀、分析天平、布氏漏斗、無油隔膜真空泵、燒杯、玻璃棒和濾紙。

試劑：泰樂菌素發(fā)酵液、高氯酸鈉溶液、乙腈溶液和純化水（所有有機(jī)試劑均為分析純）。

2.方法與內(nèi)容

方法：采用C18（4.6×150 mm，5μm）色譜柱;流動相A：0.5 mol/L高氯酸鈉溶液、流動相B：乙腈，以A-B混合流動相進(jìn)行梯度洗脫;流速為1.5m L/min;檢測波長為290nm[5]。

內(nèi)容：隨機(jī)選3批泰樂菌素發(fā)酵液作為實(shí)驗樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，分別取127h、158h、164h和放罐時的四個時間段樣品，用高效液相色譜法檢測其組分和雜質(zhì)DMT含量。

3.結(jié)果與分析

3.1含量分析

以EP9.0的檢測方法為標(biāo)準(zhǔn)，雜質(zhì)DMT的相對保留時間為0.51，組分C、組分B、組分D和組分A的相對保留時間分別為0.55、0.69、0.83和1.00，具體含量如表1所示：

根據(jù)表1結(jié)果顯示，從組分C轉(zhuǎn)化到組分A的過程中，組分C的面積含量由31.1%轉(zhuǎn)化為0.0%，組分A的面積含量由58.0%轉(zhuǎn)化為86.8%;組分B和組分D的面積含量呈遞增趨勢;雜質(zhì)DMT的面積含量呈遞減趨勢;并且，放罐時組分A面積含量較高的批數(shù)，所對應(yīng)的雜質(zhì)DMT面積含量也相對較低。

根據(jù)圖 2 結(jié)果顯示，從轉(zhuǎn)化開始到放罐時，組分C的面積含量逐漸降低至0.0%，組分A的面積含量逐漸遞增，表明C組分轉(zhuǎn)化至A組分相對較為徹底;組分B和組分D的面積含量呈遞增趨勢，雜質(zhì)DMT的面積含量呈遞減趨勢，說明在生物合成通路中，雜質(zhì)DMT在一定條件下會轉(zhuǎn)化至組分中去，從而提高產(chǎn)品的放罐質(zhì)量。

3.2 結(jié)構(gòu)分析

雜質(zhì)DMT是一種泰樂菌素代謝產(chǎn)物，具體化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3所示：

根據(jù)圖3結(jié)構(gòu)顯示，雜質(zhì)DMT在泰樂菌素的基礎(chǔ)上只脫掉一個阿洛糖，碳霉糖未脫落，說明雜質(zhì)DMT是生物合成通路中產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物。

3.3 代謝通路分析

泰樂菌素的生物合成途徑主要是在大環(huán)內(nèi)酯的基礎(chǔ)上，接上了三個糖基：泰內(nèi)酯在碳霉胺糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成碳霉胺糖-泰內(nèi)酯，碳霉胺糖-泰內(nèi)酯在阿洛糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成碳霉胺糖-阿洛糖-泰內(nèi)酯，碳霉胺糖-阿洛糖-泰內(nèi)酯最終在碳霉糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成泰樂菌素A，即泰樂菌素。

雜質(zhì)DMT是脫阿洛糖泰樂菌素，在泰樂菌素的生物合成過程中，碳霉胺糖-泰內(nèi)酯正常應(yīng)該在阿洛糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成碳霉胺糖-阿洛糖-泰內(nèi)酯，但是并未這樣進(jìn)行生物合成，而是在阿洛糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成雜質(zhì)DMT，即碳霉胺糖-碳霉糖-泰內(nèi)酯。因此，說明在碳霉胺糖-泰內(nèi)酯合成后，可能由于阿洛糖基轉(zhuǎn)移酶的活性過低或阿洛糖的底物濃度過低，致使未能合成碳霉胺糖-阿洛糖-泰內(nèi)酯，而是合成了碳霉胺糖-碳霉糖-泰內(nèi)酯（雜質(zhì)DMT）。

4. 小結(jié)

本論文主要研究了泰樂菌素發(fā)酵中的雜質(zhì)DMT在一定程度上對放罐組分A含量的影響。初步推斷：泰樂菌素放罐時，雜質(zhì)DMT的面積含量是隨泰樂菌素組分的含量增加而降低，充分表明雜質(zhì)DMT的含量降低在一定程度上可以提高泰樂菌素的含量。雜質(zhì)DMT亦稱脫阿洛糖泰樂菌素，是由于生物合成通路中阿洛糖基轉(zhuǎn)移酶的活性過低或阿洛糖的底物濃度過低，產(chǎn)生的一種代謝副產(chǎn)物。因此，在發(fā)酵過程中可以通過添加相應(yīng)基礎(chǔ)料來提高阿洛糖的底物濃度，或通過細(xì)化工藝調(diào)控來提高阿洛糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，進(jìn)而保證生物合成路徑正常進(jìn)行，提高泰樂菌素放罐組分，為后提煉產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量均奠定了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]閔勇， 劉曉艷， 楊自文， et al. 泰樂菌素及其衍生物研究進(jìn)展[J]. 知識經(jīng)濟(jì)， 2010（01）：127-128.

[2]劉鵬， 徐雪風(fēng)， 陸建中， et al. 泰樂菌素高產(chǎn)菌株誘變選育[J]. 當(dāng)代化工研究， 2019，000（015）：P.111-112.

[3]徐紹玉， 于新令， 劉祎禎，等. 泰樂菌素提取過程中乙酸丁酯回收方法的研究[J]. 山東化工， 2013， 42（12）：47-49.

[4]徐紅梅. 泰樂菌素高產(chǎn)菌株的推理選育及發(fā)酵工藝優(yōu)化[D]. 華東理工大學(xué)， 2013.

[5]任玉琴， 裘丞軍， 吳望君. HPLC法同時測定磺胺二甲嘧啶含量和泰樂菌素組分[J]. 中國獸藥雜志， 2018（7）：64-71.

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