王忠 劉坡 王香梅 鄒松云 趙朱云

【摘要】目的?研究富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）對兔耳增生性瘢痕的影響。方法?選取20只成年新西蘭大耳白兔建立兔耳增生性瘢痕動物模型，待傷口上皮化后，將其同體配對對照實驗。實驗組瘢痕內(nèi)注射PRP。觀察記錄術(shù)后20天和50天 2組兔耳瘢痕的發(fā)生和兔耳瘢痕的大小。結(jié)果 對照組兔耳瘢痕的發(fā)生率大于實驗組兔耳瘢痕的發(fā)生率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），對照組兔耳瘢痕大于實驗組兔耳瘢痕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 表明富血小板血漿具有降低兔耳瘢痕發(fā)生的作用;富血小板血漿具有減輕兔耳已發(fā)生瘢痕的作用。

【關(guān)鍵詞】富血小板血漿;增生性瘢痕;兔耳瘢痕模型

【中圖分類號】R644 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A?【文章編號】2026-5328（2021）03-057-04

增生性瘢痕（hyperplastic scar，HS）通常發(fā)生在外傷，尤其是燒傷和外科手術(shù)之后[1]。HS是一種良性的皮膚纖維化病灶，特征是細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白過度沉積和成纖維細(xì)胞過度增殖。發(fā)生機(jī)制是由于細(xì)胞凋亡受阻和成纖維細(xì)胞生成過多，細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白合成增加以及各種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)失調(diào)而形成的。邊界清楚，一般在原創(chuàng)面范圍內(nèi)[2]。由于在生理和心理上不同程度地影響患者，其預(yù)防與治療至今仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的臨床問題。

從20世紀(jì)70年代富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）應(yīng)用于醫(yī)學(xué)。PRP能夠提供自源性生長因子，能夠促進(jìn)組織和細(xì)胞再生，為再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展開辟了一條新途徑，在創(chuàng)面修復(fù)方面報道較多。近年來的報道PRP在疤痕的預(yù)防和治療中有效，尤其面部瘢痕者，措施多為綜合性。PRP對增生性瘢痕直接影響報道較少[3]。

本研究通過檢測PRP注射后兔耳創(chuàng)面HS增生情況，研究PRP對HS形成過程中的直接影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物?實驗選取的新西蘭大白兔均通過了深圳龍華區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。新西蘭大白兔20只，雌性12只，雄性8只，平均體質(zhì)量（2.4±0.43）kg，兔耳健全，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。大白兔喂養(yǎng)于寬敞的籠內(nèi)，單籠單兔，并給予食物和水，自由攝取。養(yǎng)兔的房間保持通風(fēng)。

1.2 方法

1.2.1 兔耳瘢痕動物模型的建立：將20只新西蘭大白兔用30%戊巴比妥鈉做耳緣靜脈麻醉。麻醉成功后，在每只兔做兩個傷口，一個在左側(cè)，一個在右側(cè)。用消毒后的普通外科手術(shù)刀在兔耳中心處無血管的部位，各切一個1 cm×1 cm大小的切口，深至兔耳軟骨，切除皮膚、皮下組織、軟骨表面軟骨膜等，小心搔刮軟骨表面，切好后創(chuàng)口用灼燒后的鐵片進(jìn)行止血，手術(shù)完成[4]。待傷口上皮化后，每只兔雙耳創(chuàng)面隨機(jī)納入對照組或?qū)嶒灲M，作同體配對對照實驗。

1.2.2?PRP準(zhǔn)備：用裝有復(fù)方枸櫞酸鈉抗凝劑的注射器于大白兔耳中央靜脈取新鮮血約4 ml，置入離心管中，使用臺式離心機(jī)（80-2臺式電動離心機(jī)，中國上海）進(jìn)行離心。第一個周期需要10分鐘，轉(zhuǎn)速為2500 rpm，血液分為三層。將上部的兩層轉(zhuǎn)移到其他一次性無菌管中，以3500 rpm的速度再次離心15分鐘。抽出位于底部的PRP，并以1：4的比例添加10%的氯化鈣使其活化。

1.2.3 實驗組每個創(chuàng)面中心及周緣共6個不同部位給予注射PRP0.2mL，對照組給予0.2mL的生理鹽水。每2周進(jìn)行一次PRP注射，直至8周[5]。本實驗嚴(yán)格遵循《實驗動物保護(hù)條例》。

1.3 觀察指標(biāo) 分別觀察20 d時兔耳瘢痕的發(fā)生情況和50 d時兔耳瘢痕的大小情況。以已愈合的創(chuàng)面高出正常皮膚2 mm為標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法?采用軟件SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)計量資料用用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用x2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兔耳瘢痕發(fā)生情況?對照組與實驗組均發(fā)生瘢痕增生，見圖1。鏡下見實驗組真皮層增厚，成纖維細(xì)胞分散分布，中可見膠原纖維增生;對照組真皮層增厚，膠原纖維增生明顯，形成明顯纖維束，粗大致密，束間空隙較大。瘢痕發(fā)生率對照組大于實驗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。表明PRP瘢痕內(nèi)注射抑制兔耳瘢痕增生（表1）。

2.2?2組兔耳瘢痕增生情況?對照組兔耳瘢痕增生量超過1cm3創(chuàng)面數(shù)大于實驗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。表明PRP瘢痕內(nèi)注射可有效抑制兔耳瘢痕增生（表2）。

3討論

實驗室制備PRP一般通過雙離心方案或幾種市售的PRP分離系統(tǒng)。但是，不同實驗室、不同方法生產(chǎn)的PRP細(xì)胞組成存在很大差異[6-7]，相關(guān)文獻(xiàn)中也常常缺乏對這些生物制劑詳細(xì)的描述[8]。由于PRP所含成分的復(fù)雜，很難判斷是單次制備的PRP各種成分實際含量[9]。提高的血小板濃度的一個因素是增加離心時間，另一個因素是離心力增加。但是，過高的力可能會由于血小板的早期活化和破裂而導(dǎo)致上清液血漿中生長因子的損失，意味著PRP的治療效率會下降[10-12]。選擇合理的離心機(jī)、離心時間對PRP的制備至關(guān)重要。目前比較明確的是PRP中生長因子濃度增加了3至5倍有效，更高的濃度并未顯示出有進(jìn)一步改善的作用[13]。而紅細(xì)胞及白細(xì)胞含量增加對PRP中因子的釋放發(fā)揮功能有不利影響。由于以上原因，本文采用的制備方案盡可能多地保留血小板，去除紅細(xì)胞及白細(xì)胞，盡可能保護(hù)血小板內(nèi)部顆粒完整性。采用注射的方法則為了盡可能減少PRP意外流失。

傳統(tǒng)上，兔耳HS模型用于評估針對疤痕形成的各種治療方法[14]。標(biāo)準(zhǔn)兔耳HS模型僅反映瘢痕形成的早期階段組織學(xué)及生化變化：密集的肉芽組織血管化，繼而細(xì)胞漸減少，炎癥減退，膠原束排列發(fā)生變化，瘢痕逐漸增厚;總蛋白和膠原蛋白由起始時降低到增加，纖維化增加。HS的發(fā)病的分子機(jī)制尚未闡明。在此過程中，瘢痕組織非常不穩(wěn)定，反映在膠原蛋白變化上[15]。這也是各種細(xì)胞因子、生長因子等調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的基礎(chǔ)。本文選取兔耳制作標(biāo)準(zhǔn)的瘢痕模型，主要也是針對瘢痕形成早期PRP的作用。

PRP的一個特殊之處是血小板α顆粒內(nèi)含有血管內(nèi)皮生長因子，表皮生長因子（EGF），血小板衍生生長因子（PDGF），胰島素樣生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等生長因子，以“天然”的生理比例存在，且可以通過不同的途徑激活釋放。這些細(xì)胞因子、生長因子等調(diào)節(jié)傷口的恢復(fù)直至痊愈，如：PDGF對傷口巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有強(qiáng)的趨化性，刺激這些細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性生長因子;TGF-β直接刺激新的膠原蛋白合成，并在更長的時間內(nèi)持續(xù)增強(qiáng)[16]。PRP對早期瘢痕形成有抑制作用，推測是在瘢痕形成早期，PRP通過生長因子調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增生及分泌膠原蛋白行為達(dá)到減輕瘢痕增生，尚需進(jìn)一步實驗證實。本文對PRP對瘢痕形成過程的影響作了初步探討，檢測各種細(xì)胞因子、生長因子的含量與反映膠原蛋白沉積指標(biāo)如瘢痕指數(shù)、酶聯(lián)免疫檢測等及反映細(xì)胞增生的指標(biāo)如增殖細(xì)胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA）定量關(guān)系可以進(jìn)一步闡明細(xì)胞因子生長因子調(diào)整細(xì)胞行為，從而更好地理解瘢痕形成過程。

4結(jié)論

富血小板血漿具有降低兔耳瘢痕發(fā)生的作用;富血小板血漿具有減輕兔耳已發(fā)生瘢痕的作用。

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基金項目：深圳市龍華區(qū)2018年科技創(chuàng)新專項資金（2017年第二批醫(yī)療衛(wèi)生項目）資助，（項目編號：2017136）。

作者簡介：王忠，1973.12，男，河北省邢臺市人，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：瘢痕預(yù)防與治療。

深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院燒傷整形科?518110