薛娣

摘要：目的觀察針?biāo)幝?lián)合療法對(duì)糖尿病大鼠腎臟功能的影響。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、電針組、藥物組和針?biāo)幝?lián)合組5組，每組10只。采用鏈脲佐菌素60μg/g腹腔注射的方法建立糖尿病大鼠模型，48h后葡萄糖氧化酶法測(cè)血糖，空腹血糖≥16.9mmol/L為糖尿病造模成功。電針組給予足三里、內(nèi)庭穴電針治療，1d1次;藥物組給補(bǔ)氣化瘀藥物（處方組成：黃芪12g，赤芍25g，當(dāng)歸20g，紅花15g，川芎15g，地龍20g，桃仁15g）0.015mL/g灌胃，1d1次;針?biāo)幝?lián)合組采用電針和補(bǔ)氣化瘀藥物相結(jié)合的聯(lián)合療法。蘇木蘇-伊紅、過(guò)碘酸-希夫染色腎組織，觀察其形態(tài)學(xué)變化;心臟取血，測(cè)空腹血糖（fastingbloodglu-cose，F(xiàn)BG）、血肌酐（serumcreatinine，SCr）、尿肌酐（urinecre-atinine，UCr）和內(nèi)生肌酐清除率（creatinineclearance，Ccr）;一氧化氮（nitricoxide，NO）、內(nèi)皮素（endothelin，ET）、一氮化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）水平;免疫組化染色測(cè)定腎組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）蛋白的表達(dá)和定位。結(jié)果：與模型對(duì)照組對(duì)比，電針組、藥物組和針?biāo)幝?lián)合組大鼠FBG、SCr、Ccr、NO、NOS和TGF-β1水平明顯降低，UCr升高，NO與ET比值增高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與藥物組和電針組對(duì)比，針?biāo)幝?lián)合組大鼠FBG、SCr、Ccr、NO、NOS和TGF-β1水平降低，UCr升高，NO與ET比值增高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：中醫(yī)針?biāo)幝?lián)合能明顯改善糖尿病大鼠的腎臟功能，能抑制腎臟TGF-β1水平，對(duì)糖尿病大鼠早期腎臟損害有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：針?biāo)幝?lián)合;電針;補(bǔ)氣化瘀藥物;糖尿病/治療;腎功能;動(dòng)物模型，大鼠

糖尿病腎?。╠iabeticnephropathy，DN）是糖尿病最常見(jiàn)的一種并發(fā)癥，常引起腎功能衰竭，是患者致死的主要原因。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病以陰虛為本、燥熱為標(biāo)，治療多采用滋陰清熱、生津、滋腎等方法。近年來(lái)，針刺、艾灸等方法治療糖尿病取得了較好的療效。研究報(bào)道，針?biāo)幗Y(jié)合在糖尿病的治療及其并發(fā)癥的防治方面具有較好的效果。本研究采用針刺加補(bǔ)氣化瘀中藥的聯(lián)合方法治療糖尿病腎病大鼠，通過(guò)觀察大鼠空腹血糖（fastingblood-glucose，F(xiàn)BG）、血肌酐（serumcreati-nine，SCr）、尿肌酐（urinecreatinine，UCr）、內(nèi)生肌酐清除率（creatinineclearance，Ccr）、一氧化氮（nitricoxide，NO）、一氮化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）等指標(biāo)，研究其對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物

雄性SD大鼠，50只，清潔級(jí)，3月齡，體質(zhì)量150～200g，購(gòu)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK豫2010-0002。將大鼠喂養(yǎng)在室溫20～25℃的清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，普通飼料喂飼，自由飲水。

1.2藥品、試劑與儀器

補(bǔ)氣化瘀藥物處方組成：黃芪12g，赤芍25g，當(dāng)歸20g，紅花15g，川芎15g，地龍20g，桃仁15g。藥材購(gòu)自河南省醫(yī)藥藥材有限公司，水煎制劑濃縮至每毫升藥液含生藥1g，高壓滅菌后存放于4℃冰箱內(nèi)備用。鏈脲佐菌素（STZ），Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)20120907;TGF-β1多克隆抗體，北京博奧森生物科技有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20150219;血糖測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程公司產(chǎn)品，批號(hào)20141209。血糖測(cè)試儀，南京建成生物工程公司產(chǎn)品;G6805-2A型低頻電針儀，上海華誼醫(yī)用儀器有限公司產(chǎn)品;PUZS-300全自動(dòng)生化分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3動(dòng)物分組與模型的建立

喂養(yǎng)大鼠1周后，將其隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、電針組、藥物組和針?biāo)幝?lián)合組5組，每組10只。禁食、不禁水12h后，除正常對(duì)照組外，其余4組均一次性腹腔注射STZ60μg/g建立糖尿病模型;正常對(duì)照組注射等體積檸檬酸緩沖液。48h后采用葡萄糖氧化酶法測(cè)血糖，血糖≥16.9mmol/L為糖尿病造模成功。

1.4給藥方法

造模成功后第7天，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組予生理鹽水0.015mL/g灌胃，1d1次;藥物組給予補(bǔ)氣化瘀藥物0.015mL/g灌胃，1d1次;電針組給予電針治療[5]（強(qiáng)度1mA，頻率160～180次/min），取穴足三里、內(nèi)庭，每次30min，1d1次;針?biāo)幝?lián)合組采用電針和補(bǔ)氣化瘀藥物相結(jié)合的聯(lián)合療法。各組均連續(xù)治療6周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1一般情況藥物干預(yù)結(jié)束后觀察大鼠的一般情況，包括體質(zhì)量、毛色、精神狀態(tài)、飲食等。

1.5.2FBG、NO、UCr、SCr和CcrFBG測(cè)定：治療停止前1d尾靜脈采血，采用血糖測(cè)試儀測(cè)量FBG。NO、UCr測(cè)定：治療停止前1d收集24h尿液，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)NO、UCr。SCr測(cè)定：治療停止24h后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50g/L的水合氯醛10μL/g腹腔注射麻醉，心臟取血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。采用生化分析儀檢測(cè)SCr。Ccr測(cè)定：根據(jù)生化檢測(cè)數(shù)值計(jì)算Ccr數(shù)值。Ccr=尿肌酐濃度（mg/L）×尿量（L/24h）/血漿肌酐濃度（mg/L）

1.5.3腎臟肥大指數(shù)心臟取血后處死大鼠，取雙側(cè)腎臟，清洗干凈，用濾紙吸干腎表面血液，稱量質(zhì)量并計(jì)算腎臟肥大指數(shù)，甲醛固定，備用。腎臟肥大指數(shù)=雙側(cè)腎質(zhì)量總和（g）/體質(zhì)量（kg）×100%

1.5.4腎組織病理改變和腎小球TGF-β1表達(dá)取甲醛固定24h的腎組織，流水沖洗，用體積分?jǐn)?shù)為70，80，90，95，100mL/L的乙醇梯度依次脫水各30min，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，切片（厚度約為2μm），蘇木蘇-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）、過(guò)碘酸-希夫（periodicacidschiff，PAS）染色，光鏡下觀察腎組織病理改變。免疫組織化學(xué)法測(cè)定TGF-β1表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)（x）±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩間比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況對(duì)比

正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤，行動(dòng)敏捷。模型對(duì)照組大鼠精神萎靡，毛發(fā)干枯、發(fā)黃，行動(dòng)遲緩，多飲、多食、多尿、體質(zhì)量減輕的“三多一少”癥狀明顯。藥物組、電針組及針?biāo)幝?lián)合組大鼠的一般狀態(tài)均較模型對(duì)照組有不同程度的改善。

2.2各組大鼠FBG、SCr、UCr和Ccr對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠FBG、SCr、和Ccr均升高，UCr降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型對(duì)照組對(duì)比，藥物組、電針組和針?biāo)幝?lián)合組大鼠FBG、SCr、和Ccr均降低，UCr升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與藥物組和電針組分別對(duì)比，針?biāo)幝?lián)合組大鼠FBG、SCr、Ccr均下降，UCr升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3各組大鼠腎臟肥大指數(shù)、NOS、NO和NO/ET對(duì)比

與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組腎臟肥大指數(shù)、NOS水平和NO活性升高，NO/ET降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型對(duì)照組對(duì)比，藥物組、電針組和針?biāo)幝?lián)合組大鼠腎臟肥大指數(shù)、NO水平和NOS活性均顯著降低，NO/ET明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與藥物組及電針組分別對(duì)比，針?biāo)幝?lián)合組腎臟肥大指數(shù)、NOS水平和NO活性均降低，NO/ET升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4各組大鼠腎組織病理改變和腎小球TGF-β1表達(dá)對(duì)比光鏡下：正常對(duì)照組大鼠腎臟腎小球結(jié)構(gòu)完整，腎小球毛細(xì)血管基底膜均勻，無(wú)增厚，未見(jiàn)腎小球肥大。模型對(duì)照組大鼠腎臟腎小球腫脹增大，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，系膜區(qū)增寬，腎小管腫脹明顯。藥物組和電針組大鼠腎臟有不同程度的病理改變，但較模型對(duì)照組輕，表現(xiàn)為腎小球輕度肥大，少量的系膜細(xì)胞和基質(zhì)的增多，腎小管腫脹不明顯。與藥物組、電針組對(duì)比，針?biāo)幝?lián)合組腎小球體積明顯減小，病理改變減輕。與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠TGF-β1表達(dá)明顯增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型對(duì)照組對(duì)比，藥物組、電針組和針?biāo)幝?lián)合組大鼠TGF-β1表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與藥物組及電針組分別對(duì)比，針?biāo)幝?lián)合組大鼠TGF-β1表達(dá)下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3討論

糖尿病腎病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”并發(fā)“水腫”范疇，是一種以腎小球肥大、腎小球?yàn)V過(guò)減少、腎纖維化和腎功能損害為特征的慢性病。根據(jù)治病求本、兼治其標(biāo)的中醫(yī)治療原則，中醫(yī)藥在臨床癥狀改善率、降低SCr、改善腎功能等方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)針?lè)ㄖ委熖悄虿∫踩〉昧溯^好的療效。本研究采用針?biāo)幝?lián)合治療，發(fā)現(xiàn)其對(duì)糖尿病腎病大鼠有減輕腎臟損傷的保護(hù)作用。NO為內(nèi)皮細(xì)胞舒血管因子，可降低血管張力，造成腎細(xì)胞損害，促進(jìn)炎癥產(chǎn)生與發(fā)展。NOS為一氧化氮合成酶，可促進(jìn)NO的合成。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病患者腎臟表達(dá)高水平內(nèi)皮型NOS，激活NO活性，引起腎小球高濾過(guò)狀態(tài)及系膜基質(zhì)的增生。因此NO作為血管活性物質(zhì)參與了腎小球高灌注、高濾過(guò)的發(fā)生、發(fā)展和腎細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量下降，腎臟肥大指數(shù)、FBG、Ccr、SCr均顯著升高，UCr數(shù)值降低，提示糖尿病大鼠腎臟功能受損。同時(shí)模型對(duì)照組大鼠腎臟肥大指數(shù)、NO水平和NOS活性升高較明顯，NO/ET顯著降低，表明此模型可能處于DN早期。針?biāo)幝?lián)合治療后，大鼠腎臟肥大指數(shù)顯著降低，NO水平、NOS活性也降低，NO/ET卻明顯升高，證實(shí)針?biāo)幝?lián)合治療通過(guò)影響大鼠體內(nèi)NO水平、NOS活性和NO/ET，使腎小球的高濾過(guò)降低，對(duì)早期DN腎臟起到保護(hù)作用。TGF-β是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化功能的活性多肽，機(jī)體內(nèi)以TGF-β1含量最高。在腎臟中，TGF-β廣泛分布于腎小管、腎小球與腎間質(zhì)中，TGF-β在DN的發(fā)生與發(fā)展中扮演著非常重要的角色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在DN發(fā)生早期，TGF-β1及TGF-β1mRNA表達(dá)就明顯升高，血糖水平隨著TGF-β1水平升高而升高。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也顯示TGF-β1具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用。RNA測(cè)序技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TGF-β1介導(dǎo)了腎纖維化和DN的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：糖尿病模型組大鼠較正常對(duì)照組大鼠不僅血糖升高，而且Ccr升高、TGF-β1表達(dá)增多。提示糖尿病腎病的病理過(guò)程可能與這些因素的參與有關(guān)。針?biāo)幝?lián)合組大鼠在6周的干預(yù)治療后，F(xiàn)BG、SCr、Ccr均明顯低于模型對(duì)照組，特別是TGF-β1表達(dá)顯著降低，說(shuō)明了針?biāo)幝?lián)合治療能夠降低腎臟TGF-β1表達(dá)而使血糖水平降低，從而改善DN大鼠的腎臟功能。綜上所述，中醫(yī)針?biāo)幝?lián)合療法可有效改善DN大鼠的腎功能并降低血糖水平，有望在治療糖尿病及其并發(fā)癥方面發(fā)揮重要作用。

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南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部?河南南陽(yáng)?473000