陳士亮, 孫亞倩, 邵振啟, 李文龍, 孔佑賓,杜匯, 李喜煥*, 張彩英

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 華北作物改良與調(diào)控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071001)

大豆[Glycinemax(L.) Merr.]是重要的糧食與油料作物，籽粒富含蛋白、脂肪、異黃酮、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，在人們膳食結(jié)構(gòu)中占有不可替代的重要地位[1-2]。同時(shí)，大豆還可進(jìn)行鮮莢采摘，作為鮮食毛豆豐富人們餐桌[3-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，鮮食毛豆單位面積經(jīng)濟(jì)效益約為普通粒用大豆的2倍以上，因而對于提高大豆經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。然而，鮮食大豆產(chǎn)量與鮮莢、鮮粒性狀關(guān)系密切。大豆籽粒產(chǎn)量與其莢長性狀呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)[4]；改良大豆莢長和莢寬性狀不僅有利于增大籽粒，并且有利于提高其單位面積產(chǎn)量[5]。并且，鮮莢和籽粒性狀是鮮食大豆品種審定和出口的重要參考依據(jù)。因此，改良大豆鮮莢和籽粒相關(guān)性狀，對于鮮食大豆品種審定、產(chǎn)品出口和經(jīng)濟(jì)效益提升均具有重要意義[6]。

目前，已有少數(shù)學(xué)者針對大豆莢粒相關(guān)性狀開展研究。王珍[7]利用大豆重組自交系(recombinant inbred line, RIL)獲得多個控制二粒莢長、莢寬、粒長和粒寬加性數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait loci，QTL)，分別位于9條染色體(4、5、6、7、8、10號染色體等)上。趙晉銘等[8]分析大豆RIL群體百粒鮮重，獲得1個位于18號染色體，可解釋7.64%～12.7%表型變異加性QTLs。牛遠(yuǎn)[9]鑒定了257份大豆資源籽粒相關(guān)性狀，獲得多個控制粒長、粒寬、粒厚加性QTLs。Kenichiro等[10]鑒定大豆RIL群體單株莢數(shù)、每莢粒數(shù)和單粒重等，獲得4個穩(wěn)定QTLs。由此可見，盡管目前已有少數(shù)關(guān)于大豆莢粒相關(guān)性狀遺傳位點(diǎn)研究報(bào)道[11-16]，但多是利用成熟籽粒針對單一加性QTLs進(jìn)行研究，很少有利用鮮莢和鮮粒、針對上位性QTLs及其互作效應(yīng)開展研究的報(bào)道。

然而，上位性QTLs及其互作效應(yīng)作為數(shù)量性狀遺傳結(jié)構(gòu)重要組成部分，其對復(fù)雜數(shù)量性狀的影響與簡單性狀相比更為重要，因而在育種工作中的作用不容忽視[17-18]。由于自花授粉作物較異花授粉作物具有較強(qiáng)的非等位基因之間的互作，因而若檢測到加性×加性上位性互作效應(yīng)，則可以通過人工選擇實(shí)現(xiàn)其穩(wěn)定遺傳，進(jìn)而產(chǎn)生額外的遺傳收益[19]；并且，在上位性效應(yīng)存在時(shí)，僅考慮加性效應(yīng)將會嚴(yán)重影響高世代材料的選擇效率[19]。有學(xué)者在研究水稻種子活力相關(guān)性狀時(shí)發(fā)現(xiàn)，對于水稻種子發(fā)芽率、苗長和干物重而言，上位性效應(yīng)的作用高于加性效應(yīng)[20]。另外，對于異花授粉作物而言，上位性效應(yīng)還是其雜種優(yōu)勢形成的重要遺傳基礎(chǔ)?？梢?，在研究數(shù)量性狀單個加性QTL的同時(shí)，挖掘控制其上位性QTL及其互作效應(yīng)對于今后實(shí)現(xiàn)數(shù)量性狀精準(zhǔn)遺傳改良具有重要意義。

鑒于此，本研究利用大豆重組自交系群體，2年4種不同環(huán)境條件下分別鑒定其鮮莢、鮮粒共8個相關(guān)性狀，在前期已明確其在鮮莢、鮮粒等相關(guān)性狀存在廣泛遺傳變異，并已揭示其在不同環(huán)境條件下存在許多一致性加性主效QTLs基礎(chǔ)上，繼續(xù)挖掘控制其鮮莢籽粒性狀上位性QTLs，并分析其互作效應(yīng)，對今后結(jié)合利用加性和上位性QTLs，實(shí)現(xiàn)大豆鮮莢籽粒性狀分子遺傳改良以及進(jìn)一步解析大豆莢粒性狀分子遺傳機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以大豆重組自交系群體(C813×墾農(nóng)7號，193個家系)為材料，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種課題組構(gòu)建并提供。

1.2 供試大豆RIL群體田間種植與管理

供試大豆重組自交系群體分別于2019、2020年種植于河北省4種環(huán)境條件下(E1～E4)，以鑒定供試群體在不同年度、不同地點(diǎn)的遺傳變異，其中E1為2019年保定環(huán)境(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物育種中心)、E2為2020年保定環(huán)境(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物育種中心)、E3為2020年文安環(huán)境(廊坊文安)、E4為2020年鹿泉環(huán)境(石家莊鹿泉)。從地理位置看，鹿泉試點(diǎn)較保定試點(diǎn)偏西偏南、文安試點(diǎn)較保定試點(diǎn)偏東，4個試點(diǎn)在溫度、水分和土壤地力等方面存在一定差異。4個試點(diǎn)均采用完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，行長3 m，行距0.5 m，3次重復(fù)，田間管理同一般大田管理方法。

1.3 供試大豆RIL群體鮮莢籽粒相關(guān)性狀測定

供試大豆RIL群體生長至R6～R7期，參照國家鮮食大豆區(qū)域試驗(yàn)調(diào)查方法并結(jié)合前人研究進(jìn)展[7, 11]，分別檢測供試群體鮮莢與籽粒相關(guān)性狀，具體包括標(biāo)準(zhǔn)二粒莢長(fresh pod length, FPL)、二粒莢寬(fresh pod width, FPW)、鮮莢重量(fresh pod weight, FPWT)、鮮粒重量(fresh seed weight, FSWT)、鮮粒長度(fresh seed length, FSL)、鮮粒寬度(fresh seed width, FSW)、長寬比(fresh seed length/width, FSLW)、鮮粒面積(fresh seed area, FSA)共8個性狀。

1.4 供試RIL群體上位性QTLs及其互作效應(yīng)分析

利用供試大豆RIL群體上述8個鮮莢籽粒相關(guān)性狀，結(jié)合前期已構(gòu)建的群體單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)標(biāo)記遺傳連鎖圖譜(含2 234個SNP標(biāo)記)，采用IciMapping V4.2軟件MET模塊[21]，將不同環(huán)境設(shè)為因子，通過完備區(qū)間作圖法，對8個性狀進(jìn)行上位性QTLs及其互作效應(yīng)分析，其中檢測步長設(shè)為5.0 cM，若臨近QTL間的遺傳距離小于5.0 cM，則將其認(rèn)定為相同QTL；隨后，參照McCouch等[22]提出的QTL命名方法進(jìn)行命名。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆鮮莢籽粒上位性QTLs及其染色體分布

通過分析供試大豆RIL群體8個鮮莢籽粒相關(guān)性狀上位性QTLs(表1)發(fā)現(xiàn)，共獲得321對鮮莢籽?！凹有浴良有浴鄙衔恍訯TLs，涉及大豆所有染色體，其中以13號染色體分布的上位性QTLs數(shù)量最多，其次為6號染色體，而以1號和16號染色體分布數(shù)量最少。由此可見，控制大豆鮮莢籽粒的上位性QTLs數(shù)量較多，且在染色體上的分布范圍較廣，除以往報(bào)道的單個加性QTLs外，“加性×加性”上位性QTLs在大豆鮮莢籽粒形成和發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用。進(jìn)一步分析上述測試性狀檢測到的上位性QTLs還發(fā)現(xiàn)，以鮮粒長寬比定位到的上位性QTLs最多，其次為鮮粒寬度，而以鮮莢寬度定位到的上位性QTLs最少。

表1 大豆鮮莢籽粒上位性QTLs染色體分布Table 1 Distribution of epistatic QTLs of fresh pod and seed related traits on soybean chromosomes

另外，上述上位性QTLs互作關(guān)系如圖1所示，可以看出，大豆鮮莢籽粒性狀存在復(fù)雜的QTLs互作網(wǎng)絡(luò)，并以7號、13號染色體與其他染色體間的互作關(guān)系較多，其中7號染色體與其余18條染色體間存在互作關(guān)系(除3號和17號染色體外)，而13號染色體則與除1號和19號染色體外的18條染色體存在互作關(guān)系。由此推測，7號和13號染色體可能在大豆鮮莢和籽粒形成與發(fā)育過程中處于較為重要的“核心”位置，其通過與較多的染色體間的互作來影響鮮莢和籽粒形成。

圖1 大豆鮮莢籽粒性狀上位性QTLs染色體互作網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Interaction network of epistatic QTLs associated with soybean fresh pod and seed related traits

2.2 大豆鮮莢籽粒上位性QTLs效應(yīng)分析

通過分析供試大豆群體鮮莢籽粒性狀上位性QTLs遺傳效應(yīng)(表2)發(fā)現(xiàn)，在定位到的321對上位性QTLs中，有144對上位性QTLs為正向效應(yīng)(加性效應(yīng)為正值)，表明兩基因座位間的互作基因型與具有正向效應(yīng)的加性基因型作用方向相同；有177對上位性QTLs為負(fù)向效應(yīng)(加性效應(yīng)為負(fù)值)，說明兩基因座位間的互作基因型與具有正向效應(yīng)的加性基因型作用方向相反。在144對正向效應(yīng)QTLs中，有37對QTLs效應(yīng)為“++”型，70對效應(yīng)為“+-”型，另有37對效應(yīng)表現(xiàn)為“--”型；而在177對負(fù)向效應(yīng)QTLs中，有45對效應(yīng)為“++”型，99對效應(yīng)為“+-”型，33對效應(yīng)為“--”型。

同時(shí)分析不同莢粒相關(guān)性狀連鎖QTLs(表2)發(fā)現(xiàn)，控制鮮莢長度的36對上位性QTLs中，有19對表現(xiàn)為正向效應(yīng)，17對表現(xiàn)為負(fù)向效應(yīng)，其中8對為“++”型，22對為“+-”型，6對為“--”型；控制鮮莢寬度的8對上位性QTLs中，2對表現(xiàn)為正向效應(yīng)，均為“--”型，6對表現(xiàn)為負(fù)向效應(yīng)?？刂契r莢重量的16對QTLs中有6對表現(xiàn)為正向效應(yīng)，10對表現(xiàn)為負(fù)向效應(yīng)；控制鮮粒長度的52對QTL中有21對正向效應(yīng)，31對負(fù)向效應(yīng)；鮮粒寬度的68對QTLs中，29對表現(xiàn)為正向效應(yīng)，39對表現(xiàn)為負(fù)向效應(yīng)。上述上位性QTLs及其遺傳效應(yīng)分析可為今后改良大豆莢粒相關(guān)性狀提供一定參考。

表2 大豆鮮莢籽粒性狀上位性QTLs遺傳效應(yīng)分析Table 2 Genetic effect analysis of epistatic QTLs controlling soybean fresh pod and seed related traits

2.3 大豆鮮莢籽粒性狀“一因多效”上位性QTLs分析

2.3.1“一因多效”上位性QTLs染色體分布與效應(yīng)分析 通過分析不同鮮莢籽粒性狀定位到的“加性×加性”上位性QTLs(表3)發(fā)現(xiàn)，檢測到34對“一因多效”上位性QTLs，其貢獻(xiàn)率分布在1.98%～6.58%之間，且“加性×加性”上位性QTLs間互作貢獻(xiàn)率為1.89%～4.85%(PVE-AA)，明顯高于其與環(huán)境互作間的貢獻(xiàn)率(PVE-AAE)，說明這些上位性QTLs主要由遺傳因素決定，而環(huán)境因素影響較小。

表3 大豆鮮莢籽粒性狀一因多效上位性QTLsTable 3 Pleiotropism epistatic QTLs associated with soybean fresh pod and seed related traits

同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在上述34對“一因多效”QTLs中，有23對QTLs定位區(qū)間完全一致，11對QTLs定位區(qū)間距離較近(< 5 cM)，涉及18條染色體，并以13號染色體數(shù)量最多，該染色體分別與6號、7號、8號、11號、12號、13號、14號、15號和16號染色體發(fā)生互作；6號染色體存在6對“一因多效”QTLs，其分別與2號、3號、10號、13號、14號和18號染色體發(fā)生互作?？梢?，由于大豆鮮莢籽粒相關(guān)性狀間存在一定相關(guān)性，這些相關(guān)性不僅與單個加性QTLs的一因多效有關(guān)，而且與上位性QTLs的一因多效密切相關(guān)。上述一因多效位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)可為今后進(jìn)一步揭示大豆莢粒性狀間的相關(guān)關(guān)系提供分子依據(jù)。

另外還發(fā)現(xiàn)，上述34對“一因多效”上位性QTLs中，有12對QTLs效應(yīng)值為正值，另有22對QTLs效應(yīng)值為負(fù)值；并且，上述“一因多效”上位性QTLs在不同性狀間的效應(yīng)值同時(shí)為正值或負(fù)值，一方面揭示了上述性狀間的正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)為今后實(shí)現(xiàn)上述性狀同步遺傳改良提供了依據(jù)。

2.3.2“一因多效”上位性QTLs互作方式分析

在上述34對“一因多效”QTLs中，包含6組“一對多”上位性QTLs互作方式(圖2)和16組“一對一”上位性QTLs互作方式。在6組“一對多”上位性QTLs中，包括2組“一對三”上位性QTLs和4組“一對二”上位性QTLs，其中8號染色體(ss715599311～ss715599334)與15號染色體(ss715620169～ss715620185)和19號染色體2個區(qū)間(ss715635403～ss715635406、ss715635454～ss715635575)存在互作；11號染色體(ss715610473～ss715609111)與1號染色體(ss715579338～ss715579578)、15號染色體2個區(qū)間(ss715620881～ss715620795、ss715621359～ss715621034)存在互作。

同時(shí)，1號染色體(ss715579338～ss715579578)與11號染色體2個區(qū)間(ss715610473～ss715609111、ss715610967～ss715608805)存在互作；4號染色體(ss715589651～ss715588054)與10號(ss715608544～ss715608493)、19號染色體(ss715635403～ss715635406)存在互作；6號染色體(ss715594872～ss715595080)與2號(ss715581593～ss715581908)、13號染色體(ss715615941～ss715615853)存在互作；19號染色體(ss715635403～ss715635406)與4號(ss715589651～ss715588054)、18號染色體(ss715632987～ss715632577)存在互作關(guān)系。

注：*為“一對多”類型上位性QTL。Note: * indicates the “single to multiple” QTL interaction mode.圖2 大豆鮮莢籽粒性狀“一因多效”上位性QTLs互作分析Fig.2 Interaction analysis of pleiotropism epistatic QTLs associated with soybean fresh pod and seed related traits

3 討論

莢粒性狀對于鮮食大豆品種審定、產(chǎn)品出口以及產(chǎn)量和品質(zhì)形成等至關(guān)重要，而且是普通粒用大豆產(chǎn)量性狀重要構(gòu)成因素，因而已成為大豆育種重要目標(biāo)性狀。大豆莢長、莢寬、莢重、籽粒長度、寬度等性狀與產(chǎn)量關(guān)系密切[23]；并且，莢長、莢寬、莢重和鮮百粒重等性狀間存在顯著相關(guān)[24]。然而，大豆莢粒性狀屬于多基因控制數(shù)量性狀，因而發(fā)掘控制其遺傳位點(diǎn)成為實(shí)現(xiàn)性狀分子遺傳改良重要前提。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，有關(guān)大豆不同莢粒相關(guān)性狀遺傳位點(diǎn)發(fā)掘研究最早可追溯到20世紀(jì)初，到目前為止，已報(bào)道的10余個莢粒相關(guān)性狀加性QTLs約400多個，分布范圍涉及大豆所有染色體。截至2018年，國內(nèi)外已報(bào)道的154個大豆莢粒性狀加性QTLs，經(jīng)元分析(meta-analysis)等方法最終獲得13個有效加性QTLs，分別位于2號、3號、4號、5號、6號、7號和14號染色體，其中5個QTLs區(qū)間縮小到0.5 Mb以內(nèi)，同時(shí)在上述QTLs區(qū)間尋找到11個與莢粒性狀相關(guān)候選基因[25]。

與上述莢粒相關(guān)加性QTLs相比，目前有關(guān)莢粒性狀上位性QTLs及其互作效應(yīng)分析研究報(bào)道甚少，發(fā)掘到的上位性遺傳位點(diǎn)數(shù)量也屈指可數(shù)。梁慧珍等[26]對大豆RIL群體6個籽粒性狀進(jìn)行分析，檢測到3對影響粒寬和寬厚比的上位性QTLs。楊振等[17]利用大豆RIL群體定位到9對控制二粒莢長的加性×加性上位性QTLs，涉及1號、2號、3號、5號、6號、11號、14號、16號和20號染色體，可解釋莢長性狀9.02%表型變異，并提出上位性QTLs在大豆莢長、莢寬性狀遺傳中起著至關(guān)重要的作用。由此可見，在已獲得加性QTLs基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析控制大豆莢粒性狀上位性QTLs才能更充分地揭示莢粒性狀分子遺傳基礎(chǔ)，也才能更準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)性狀分子遺傳改良。

鑒于此，本研究利用前期獲得的大豆RIL群體，在2年4種不同環(huán)境條件下鑒定其8種鮮莢籽粒相關(guān)性狀，獲得321對性狀連鎖上位性QTLs，分布于所有染色體；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中包含34對“一因多效”上位性QTLs，涉及18條染色體，且有6組“一對多”類型的上位性QTLs，說明大豆莢粒性狀除與已報(bào)道的單個加性QTLs有關(guān)外，還受多個上位性QTLs調(diào)控，且這些上位性QTLs形成了復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步揭示這些QTLs互作網(wǎng)絡(luò)是實(shí)現(xiàn)性狀分子遺傳改良的重要前提。

進(jìn)一步分析本研究定位到的上位性QTLs可以發(fā)現(xiàn)，與前人報(bào)道具有一定程度的一致性。本研究在3號染色體ss715585969～ss715585473區(qū)間和18號染色體ss715632041～ss715631972區(qū)間檢測到大豆粒長、粒寬和籽粒面積“一因多效”上位性QTLs，其中3號染色體ss715585969～ss715585473區(qū)間與Cui等[27]獲得的粒長與粒寬加性QTLs以及Li等[28]獲得的莢重加性QTL重疊。同時(shí)，本研究在10號染色體和7號染色體檢測到控制籽粒面積的上位性QTLs，其中10號染色體的定位區(qū)間與梁慧珍等[26]獲得的籽粒長寬比QTL距離較近。并且，本研究在13號染色體ss715614097～ss715614125區(qū)間與ss715614050 ～ss715614188區(qū)間定位到粒長和籽粒面積的“一因多效”上位性QTLs，該QTLs與Hina等[29]定位的籽粒長寬比加性QTL重疊。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，11號染色體ss715610795～ss715610804區(qū)間與13號染色體ss715614663～ss715614511區(qū)間存在一個粒長、粒寬和籽粒面積“一因多效”上位性QTLs，該QTL的11號染色體區(qū)間與楊振等[17]定位的莢長上位性QTLs距離較近，且與Soybase中公布的大豆粒重遺傳位點(diǎn)Seedweight49-2[30]一致。同時(shí)，6號染色體ss715594872～ss715595080區(qū)間與13號染色體ss715615941～ss715615853區(qū)間檢測到的莢重、粒重和粒長“一因多效”上位性QTLs，與楊振等[17]定位的莢長上位性QTL重疊，且與Soybase中公布的莢寬遺傳位點(diǎn)Podwallwidth1-2[31]、Podwallwidth1-3[31]，粒重位點(diǎn)Seedweight36-2[32]、Seedweight49-4[30]和Seedweight49-5[30]重疊。這些一致性QTLs一方面驗(yàn)證了本研究結(jié)果可靠性，另一方面也說明大豆莢粒加性QTLs除自身主效應(yīng)外，還可通過與其他位點(diǎn)的互作來調(diào)控莢粒形成與發(fā)育過程。

除上述與前人報(bào)道的一致性加性或上位性位點(diǎn)外，本研究還發(fā)現(xiàn)了一些未報(bào)道的上位性遺傳位點(diǎn)；同時(shí)，通過對比本課題組前期已發(fā)現(xiàn)的大豆莢粒相關(guān)性狀加性QTLs可以發(fā)現(xiàn)，有很多上位性QTLs并未在加性QTLs中檢測到，比如本研究在大豆3號、4號、12號、17號和18號染色體檢測到多對上位性QTLs，而在上述染色體中并未檢測到有加性QTLs存在。由此可見，并未引起顯著加性效應(yīng)的單個QTL有時(shí)可以通過與其他位點(diǎn)的互作來形成顯著的上位性效應(yīng)，進(jìn)而影響大豆莢粒相關(guān)性狀。因此，在大豆莢粒性狀分子遺傳改良中，一方面要考慮加性QTLs，另一方面還應(yīng)充分考慮上位性QTLs作用。

另外，上位性QTL應(yīng)用價(jià)值還體現(xiàn)在能夠揭示已有功能基因分子作用機(jī)制方面。艾麗娟等[33]在大豆2號染色體(qHS-2-1)和6號染色體(qHS-6-1)之間檢測到一對控制籽粒硬實(shí)現(xiàn)象的上位性QTL，通過查閱文獻(xiàn)得知，2號染色體存在2個控制種皮滲透性的相關(guān)基因，而關(guān)于這2個基因的分子作用機(jī)制尚不清楚，因而認(rèn)為可以將這2個功能基因作為出發(fā)點(diǎn)，通過尋找與其相關(guān)的調(diào)控因子或酶類，進(jìn)而確定6號染色體qHS-6-1區(qū)間與其互作的基因，實(shí)現(xiàn)解析上述功能基因分子作用機(jī)制的目的。因此，上位性QTL的挖掘還可為揭示已有功能基因分子作用機(jī)制提供參考。