王 穩(wěn), 陳 迪, 樸海龍*

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析重點實驗室, 遼寧 大連 116023; 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)因為其纖維化和肝硬化帶來的嚴(yán)重肝損傷,被認(rèn)為是非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver diseases, NAFLD)進(jìn)展中的關(guān)鍵階段[1]且可能發(fā)展為肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)[2],已成為肝臟相關(guān)疾病死亡的重要原因之一。NASH的發(fā)生發(fā)展與導(dǎo)致肝臟中脂質(zhì)沉積的肥胖及其代謝綜合征有較強(qiáng)的關(guān)系[3],而伴隨著肥胖以及相關(guān)代謝疾病越來越全球化的趨勢,NAFLD也已經(jīng)成為很多國家的重要健康問題[4]。研究發(fā)現(xiàn),肝臟特異敲除Pten基因的小鼠后續(xù)會發(fā)生NASH[5],嚴(yán)重者會發(fā)展為肝癌,而蛋白組和代謝組數(shù)據(jù)也表明循環(huán)脂質(zhì)代謝物以及一些基因的變化與該進(jìn)程密切相關(guān)[6]。因此NASH作為嚴(yán)重肝臟疾病發(fā)生的必經(jīng)階段,了解其疾病發(fā)生發(fā)展及炎癥惡性轉(zhuǎn)化過程中相關(guān)生物分子調(diào)控的關(guān)系,對開展有效治療嚴(yán)重肝臟疾病具有重要意義。目前營養(yǎng)誘發(fā)動物模型是展開NASH發(fā)病機(jī)制和治療研究的最有效平臺,如基于蛋氨酸和膽堿缺乏(methionine choline-deficient, MCD)飼料誘導(dǎo)的小鼠NASH模型。

LAMTOR1(全稱為晚期胞內(nèi)體/溶酶體接頭蛋白,MAPK以及mTOR激活蛋白1)在調(diào)控細(xì)胞生長和能量平衡中起重要作用,并參與氨基酸介導(dǎo)的蛋白激酶復(fù)合物mTORC1的激活過程[7]。并在肝臟特異性敲除LAMTOR1的小鼠模型中發(fā)現(xiàn),在能量匱乏時該蛋白參與重要蛋白激酶AMPK的激活[8],以應(yīng)對機(jī)體內(nèi)的營養(yǎng)壓力,表明該蛋白與肝臟的糖脂代謝關(guān)系密切[9]。因此,推斷LAMTOR1在NASH疾病發(fā)展乃至后續(xù)進(jìn)展為肝癌的過程中可能調(diào)控關(guān)鍵代謝通路,占據(jù)重要角色。

隨著近些年功能代謝組學(xué)[10]的興起,代謝組學(xué)技術(shù)在研究基因與疾病進(jìn)展相關(guān)功能時發(fā)揮著越來越出色的作用[11-12]。將基因敲除和代謝組學(xué)技術(shù)聯(lián)合交叉應(yīng)用到生命過程中重要代謝通路的研究中,更利于闡釋代謝疾病進(jìn)展過程中的分子機(jī)制。本研究以MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型為平臺,在肝臟特異性敲除LAMTOR1基因的組織樣品中進(jìn)行關(guān)鍵代謝通路鑒定,結(jié)合基因表達(dá)相關(guān)性分析,期望在NASH疾病進(jìn)程及肝臟炎癥惡性轉(zhuǎn)化中對LAMTOR1蛋白可能發(fā)揮的重要作用給出闡釋,并為NASH及NASH轉(zhuǎn)化的肝癌發(fā)病機(jī)制和治療研究提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

代謝物分析采用Acquity超高效液相色譜(UHPLC)(美國Waters)聯(lián)合四極桿-飛行時間質(zhì)譜(TripleTOF 5600 MS)(美國AB SCIEX)系統(tǒng)。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(western blot, WB)在Fusion Fx化學(xué)發(fā)光儀(法國VILBER)上實現(xiàn)。液相色譜用純甲醇和乙腈購自Merck(德國),超純水由Milli-Q系統(tǒng)制備(美國Millipore)。流動相添加劑甲酸和碳酸氫銨以及提取劑甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether, MTBE)購自Sigma公司(美國),穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)均為Sigma公司產(chǎn)品。穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)有:亮氨酸-d3、苯丙氨酸-d5、色氨酸-d5、乙酰肉堿-d3、癸?；鈮A-d3、棕櫚酰肉堿-d3、硬脂酸-d3、軟脂酸-d3、膽酸-d4和鵝去氧膽酸-d4。Tris-Cl、EDTA、5%(v/v)NP-40水溶液、脫氧膽酸和5%(v/v)Triton水溶液均購買自索萊寶(中國)。NaCl和甘油購買自科密歐(中國)。用于WB實驗的放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay, RIPA)裂解液包含50 mmol/L Tris-Cl(pH=7.4)、150 mmol/L NaCl、1%(v/v)NP-40、0.25%(w/v)脫氧膽酸、10%(v/v)甘油、1 mmol/L EDTA(pH=8.0)和1%(v/v)Triton,使用時按照裂解液體積加入1%(w/v)蛋白酶和磷酸化抑制劑(美國InvivoGen)。兔抗LAMTOR1多抗為廈門大學(xué)林圣彩課題組制備(1-64aa)。兔抗p70S6激酶(p70S6K, cat #2708)、兔抗磷酸化p70S6激酶(phospho-p70S6K, cat #9234)、鼠抗S6核糖體蛋白(S6, cat #2317)、兔抗磷酸化S6核糖體蛋白(phospho-S6, cat #2215)和兔抗磷酸化4E-BP1(phospho-4E-BP1, cat #9955)等抗體購自CST公司(美國)。鼠抗GAPDH單抗(60004-1-Ig)和鼠抗Vinculin單抗(v4505)分別購自美國Proteintech和Sigma公司。

1.2 動物培養(yǎng)與組織蘇木精-伊紅染色

肝臟特異性敲除LAMTOR1的小鼠(LAMTOR1LKO, KO小鼠)由廈門大學(xué)林圣彩課題組采用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)獲得[10],并完成MCD飲食誘導(dǎo)的KO小鼠和野生型小鼠(WT小鼠)的NASH造模實驗、肝臟組織取樣及小鼠肝臟切片的蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin, HE)染色實驗。

1.3 WB分析

在肝臟特異性LAMTOR1敲除KO小鼠和WT小鼠的肝臟組織中加入RIPA裂解液,經(jīng)由氧化鋯小珠在組織研磨器(中國新芝生物科技公司)上獲得組織漿液,經(jīng)過4 ℃、12 000 r/min離心15 min后,取上清進(jìn)行蛋白定量并調(diào)平蛋白濃度后,加入上樣緩沖液變性。使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離。分離完全后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上,并用一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h。最后,通過化學(xué)發(fā)光試劑檢測蛋白表達(dá)情況。

1.4 小鼠肝臟組織代謝物提取

代謝物的提取采用基于MTBE的液液萃取方法進(jìn)行[13]并根據(jù)實驗體系稍作改動[14]。稱取約10 mg新鮮組織,置于加有氧化鋯小珠的圓底離心管中,加入含有內(nèi)標(biāo)的甲醇提取劑后用球磨儀(mixer mill MM400,德國)進(jìn)行組織勻漿,隨后加入MTBE在室溫下振蕩。之后加入純水渦旋振蕩后靜置分層。在10 000 r/min、4 ℃條件下進(jìn)行10 min高速離心使兩相分離。按照5∶3比例[13]分別取上層和下層清液,混合用于代謝組學(xué)分析。制備質(zhì)量控制(quality control, QC)樣本時,從每個提取樣本中等量取上層和下層清液,分別置于兩個離心管中,渦旋,同樣5∶3的比例分別取上層和下層清液制備QC樣本。

1.5 LC-MS分析

LC-MS分析條件參考文獻(xiàn)所述[15]。樣品分析前用20%(v/v)甲醇水溶液進(jìn)行復(fù)溶,正離子模式下,樣品經(jīng)過Acquity C8色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)分離,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量5 μL。流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動相B為0.1%(v/v)甲酸乙腈。洗脫梯度:0～0.5 min, 5%B; 0.5～24 min,由5%B線性升至100%B; 24～28 min, 100%B;然后在0.1 min內(nèi)回到初始比例5%B并平衡色譜柱1.9 min。流動相流速為0.35 mL/min。

負(fù)離子模式下,采用Acquity T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),柱溫50 ℃,進(jìn)樣量5 μL。流動相C為溶解6.5 mmol/L碳酸氫銨的水溶液,流動相D為含有6.5 mmol/L碳酸氫銨的95%(v/v)甲醇水溶液。洗脫梯度如下:0～1 min, 2%C; 1～22 min,由2%C線性升至100%D; 22～26 min, 100%D;然后在0.1 min內(nèi)回到初始比例2%D并平衡色譜柱3.9 min,流動相流速度為0.35 mL/min。

質(zhì)譜分析在全掃獲得一級譜圖的同時進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)采集模式獲得二級譜圖。參數(shù)設(shè)置如下:離子源溫度為500 ℃,離子源電壓在正負(fù)離子分析模式下分別設(shè)為5 500 V和-4 500 V,去簇電壓在正負(fù)離子模式下分別為100 V和-100 V,碰撞能在正負(fù)離子法分析模式下分別為30 eV和-10 eV。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

將代謝組學(xué)平臺采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入儀器自帶的峰匹配軟件Markerview(1.2.1版本,美國AB SCIEX公司)工作站中獲取離子原始峰表?；诰_質(zhì)量數(shù)、保留時間和MS/MS圖譜[16],以及在Peakview(1.2版本,美國AB SCIEX公司)工作站中提取二級碎片信息進(jìn)行核對,進(jìn)一步結(jié)合標(biāo)樣庫、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫等對代謝物進(jìn)行定性。最后在Multiquant(2.1版本,美國AB SCIEX公司)中實現(xiàn)對定性代謝物分子的峰面積提取。代謝組學(xué)分析得到的原始峰面積,經(jīng)由內(nèi)標(biāo)峰面積和組織重量校正后進(jìn)行處理和統(tǒng)計分析。統(tǒng)計學(xué)顯著性采用R語言中的Wilcoxon, Mann-Whitney test進(jìn)行評價,將p<0.05的代謝物歸為顯著性的差異代謝物。組間存在差異的代謝物,數(shù)據(jù)歸一化以后在Multi Experiment Viewer 4.8.1軟件上熱圖可視化并進(jìn)行層次聚類分析。并在開源的MetaboAnalyst網(wǎng)站(http://www.metaboanalyst.ca)進(jìn)行差異代謝物的通路富集分析。使用軟件SIMCA 14.0(Umetrics,瑞典)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA),呈現(xiàn)樣品間代謝特征的差異以及實驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 公共基因組數(shù)據(jù)庫中分析LAMTOR1基因在NASH和肝癌中的表達(dá)情況

已有的報道[7,9]雖然顯示出LAMTOR1基因在機(jī)體內(nèi)的重要調(diào)控作用,但是其與NASH或者炎癥惡性轉(zhuǎn)化成的肝癌的疾病發(fā)生發(fā)展是否存在調(diào)控關(guān)系卻未有明確的機(jī)制闡釋。根據(jù)來源公共開放基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus(GEO)中的一個數(shù)據(jù)集GDS4881(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE48452),通過基因表達(dá)數(shù)據(jù)的分析比較,我們發(fā)現(xiàn)相對于健康人樣本(n=27),LAMTOR1在NASH病人樣本(n=18)中存在高表達(dá)趨勢(見圖1a)。接下來基于TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫中的肝癌相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù),我們在GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia.cancer-pku.cn/)上進(jìn)行了LAMTOR1的差異表達(dá)分析。通過對比TCGA肝癌數(shù)據(jù)庫的正常樣本(n=50)數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)LAMTOR1在肝癌的癌癥樣本(n=369)中是明顯高表達(dá)的(見圖1b)。根據(jù)LAMTOR1在NASH和肝癌中均出現(xiàn)高表達(dá)的異常現(xiàn)象,推測其在NASH的疾病進(jìn)程乃至后續(xù)發(fā)展為嚴(yán)重的肝癌過程中,可能發(fā)揮重要的生物學(xué)調(diào)控功能。

圖1 基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫分析LAMTOR1基因在NASH和肝癌中的表達(dá)情況

2.2 小鼠NASH模型的成功構(gòu)建與蛋白表達(dá)驗證

為了模擬肝臟發(fā)生炎癥性損傷的情況,用MCD飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠構(gòu)建NASH模型,通過HE(hematoxylin-eosin)染色,觀察到無論是肝臟特異性敲除LAMTOR1基因的小鼠(見圖2a)還是野生型小鼠(見圖2b)的肝臟組織中均出現(xiàn)較為明顯的脂質(zhì)沉積,并且鏡下觀察到肝細(xì)胞氣球樣變以及一些炎癥細(xì)胞聚集的現(xiàn)象,這些特征的出現(xiàn)說明小鼠NASH模型的成功構(gòu)建[17]。同時又提取了KO小鼠和WT小鼠肝臟組織中的蛋白,并進(jìn)行了WB分析。如預(yù)期一樣,在KO小鼠的肝臟組織中,由于LAMTOR1的敲除,LAMTOR1蛋白也不再表達(dá)(見圖3a)。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道,LAMTOR1與其他復(fù)合物蛋白共同對mTOR通路及其下游蛋白的影響[18]也得到了驗證,比如磷酸化p70S6k蛋白水平(見圖3a)和磷酸化核糖體蛋白S6蛋白表達(dá)水平(見圖3b)在LAMTOR1敲除小鼠肝臟中明顯下調(diào),而磷酸化4E-BP1[19]的蛋白水平發(fā)生明顯上調(diào)(見圖3b)。這些已知信號通路相關(guān)蛋白的變化說明在小鼠發(fā)生肝臟炎癥性損傷時,LAMTOR1基因參與調(diào)控糖脂代謝,應(yīng)對機(jī)體營養(yǎng)壓力的功能仍然存在。解釋清楚MCD誘導(dǎo)的小鼠NASH模型中,肝臟特異性敲除LAMTOR1具體通過調(diào)控哪些重要代謝通路來參與NASH進(jìn)展中的肝臟功能調(diào)節(jié),對理解NASH的疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制及預(yù)防治療具有重要指導(dǎo)意義。

圖2 誘導(dǎo)NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織的蘇木精-伊紅染色結(jié)果

圖3 免疫印跡分析誘導(dǎo)NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織中LAMTOR1和受LAMTOR1調(diào)控的蛋白質(zhì)水平

2.3 誘導(dǎo)NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織的代謝差異

本研究采用已建立的基于LC-MS的非靶向代謝組學(xué)方法對小鼠肝臟代謝物進(jìn)行分析,該方法建立以后在許多疾病研究中得到了廣泛應(yīng)用[15,20],其建立及考察過程參見文獻(xiàn)[21]。在正離子模式和負(fù)離子模式下共定性到134個代謝物。用質(zhì)控樣本QC中代謝物的RSD分布來評價該方法在本研究中的重復(fù)性,其中正離子模式下檢測的88個代謝物中,58個(65.9%)代謝物分子的RSD小于10%, 25個代謝物分子的RSD在10%～20%之間,5個代謝物分子的RSD在20%～30%之間(見圖4a);負(fù)離子模式下定性到的46個代謝物分子的RSD均小于30%(見圖4b),說明該代謝物分析方法在本研究中得到的數(shù)據(jù)可靠。對誘導(dǎo)NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠肝臟組織、WT小鼠肝臟組織以及QC樣本中檢測到的代謝物進(jìn)行了主成分分析。PCA模型(R2X=0.763,Q2=0.235)得分圖(見圖4c)中,QC樣本緊密地聚集在一起,說明該液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法分析這些小鼠肝臟樣品的結(jié)果穩(wěn)定且重復(fù)性好。并且NASH模型下LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織之間有明顯的分離趨勢,說明在NASH模型中,肝臟特異性敲除LAMTOR1對小鼠肝臟的代謝過程有明顯的擾動。從NASH小鼠肝臟代謝物的火山圖(見圖4d)可以看出,與WT小鼠相比,LAMTOR1LKO小鼠肝臟中有34個代謝物明顯上調(diào),11個代謝物發(fā)生明顯下降。接下來對兩組之間的差異代謝物進(jìn)行熱圖可視化分析(見圖5a),結(jié)果顯示一些氨基酸、脂肪酸等代謝物在肝臟特異性敲除LAMTOR1小鼠肝臟中差異顯著上調(diào),反而N-乙酰谷氨酸、精胺等代謝物顯著下調(diào)。對差異代謝物做通路富集分析(見圖5b),結(jié)果顯示NASH模型下LAMTOR1LKO小鼠肝臟中嘧啶代謝、核黃素代謝、精氨酸生物合成、谷胱甘肽代謝、氨基酰-tRNA生物合成、氮代謝、谷氨酰胺和谷氨酸代謝和beta-丙氨酸代謝等通路發(fā)生不同程度的擾動。

圖5 誘導(dǎo)NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織中差異代謝物(n=7)的(a)熱圖和(b)通路分析

2.4 LAMTOR1基因在肝臟炎癥惡性轉(zhuǎn)化中調(diào)控的代謝通路鑒定與分子機(jī)理

代謝組學(xué)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)小鼠肝臟發(fā)生炎癥性損傷時己糖胺生物合成通路中的中間代謝產(chǎn)物谷氨酰胺、谷氨酸、UDP-GlcNAc等在LAMTOR1LKO小鼠肝臟中明顯上調(diào)(見圖6a)。已知機(jī)體內(nèi)己糖胺的生物合成通路是氨基糖和核苷酸糖代謝的重要分支[22],該通路合成的終產(chǎn)物UDP-GlcNAc在后續(xù)的蛋白糖基化修飾中發(fā)揮重要作用,在癌癥[23]等疾病中參與線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能調(diào)節(jié)。在LAMTOR1LKO小鼠肝臟中UDP-GlcNAc發(fā)生累積,推測可能是己糖胺的生物合成通路被激活,或者可能是蛋白糖基化過程對該化合物的利用受到阻礙。由于公共開放數(shù)據(jù)庫中NASH相關(guān)表達(dá)數(shù)據(jù)有限,接下來我們基于TCGA數(shù)據(jù)庫中肝癌相關(guān)樣本和GTEx(Genotype-Tissue Expression)中肝臟組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù),對LAMTOR1與糖基轉(zhuǎn)移酶之一MGAT1的基因表達(dá)情況進(jìn)行Pearson相關(guān)系數(shù)分析。得到的相關(guān)曲線結(jié)果見(見圖6b),在肝癌中LAMTOR1基因與MGAT1基因可能存在正調(diào)控的關(guān)系(R=0.47),啟示我們在小鼠NASH模型中,肝臟中LAMTOR1的敲除可能通過調(diào)控糖基轉(zhuǎn)移酶MGAT1的表達(dá)減少或者酶活降低,造成上游底物UDP-GlcNAc累積的情況出現(xiàn)。那么在NASH的疾病進(jìn)展中,LAMTOR1與己糖胺合成產(chǎn)物的利用以及后續(xù)一些糖基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控關(guān)系則需要進(jìn)一步的研究。

圖6 表征LAMTOR1在小鼠NASH模型(n=7)中對己糖胺生物合成通路的影響并分析肝癌里L(fēng)AMTOR1與MGAT1的基因表達(dá)相關(guān)性

同時,在KO小鼠的肝臟中也觀測到了甲基化的重要甲基供體----代謝物S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)的上調(diào)。SAM可在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下將甲基轉(zhuǎn)移給DNA和蛋白等生物分子,同時生成S-腺苷高絲氨酸(S-adenosylhomocysteine, SAH)。除了SAH、SAM以外,在賴氨酸殘基上反應(yīng)生成的產(chǎn)物三甲基賴氨酸也在KO小鼠的肝臟中明顯上調(diào)(見圖7)。同樣,對肝癌里L(fēng)AMTOR1與蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶MAT1A的基因表達(dá)情況,進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。分析發(fā)現(xiàn)在肝癌中LAMTOR1基因與MAT1A基因可能存在負(fù)調(diào)控的關(guān)系(R=-0.47)(見圖7),說明在肝癌的進(jìn)展中LAMTOR1的低表達(dá)可能會促進(jìn)蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶MAT1A的高表達(dá)或者酶活上調(diào),從而促進(jìn)甲基化供體SAM的產(chǎn)生。上述結(jié)果啟示在小鼠NASH模型中,LAMTOR1也可能通過對SAM產(chǎn)生的相關(guān)代謝酶的調(diào)控來影響小鼠NASH的進(jìn)程及炎癥惡性轉(zhuǎn)化。

圖7 LAMTOR1在小鼠NASH模型中引起蛋白甲基化相關(guān)代謝物的變化和肝癌里L(fēng)AMTOR1與MAT1A的基因表達(dá)相關(guān)性分析

另外,重要功能代謝物琥珀酰基-腺苷(succinyladenosine, SAdo)在LAMTOR1敲除的小鼠肝臟中也發(fā)生明顯的上調(diào)(見圖8a)。據(jù)文獻(xiàn)報道,腺苷基琥珀酸裂解酶ADSL缺乏的情況下機(jī)體內(nèi)會出現(xiàn)SAdo的累積[24]。在肝癌數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),LAMTOR1與ADSL基因之間存在正向調(diào)控的關(guān)系(R=0.59)(見圖8b)。因此肝臟中LAMTOR1敲除可能會阻礙ADSL對于代謝物SAdo的降解,上調(diào)的SAdo水平將對小鼠肝臟的代謝調(diào)控產(chǎn)生影響從而參與到NASH的疾病進(jìn)程及后續(xù)的炎癥惡性轉(zhuǎn)化中。此外,9-氧代十八碳二烯酸、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid, DHA)等不飽和脂肪酸和甘磷酸膽堿(glycerophosphorylcholine, GPC)在肝臟特異敲除LAMTOR1的NASH模型小鼠肝臟組織中也顯著下降(見圖9)。而已有的文獻(xiàn)報道NAFLD中不飽和脂肪酸水平的降低與肝臟疾病的進(jìn)展程度相關(guān)[25],并檢測了肝臟中相關(guān)基因的表達(dá)情況[26],其中發(fā)現(xiàn)相對于單純脂肪變性樣本,NASH樣本中EPA和DHA占據(jù)肝臟總脂質(zhì)的比例下降,說明這兩個不飽和脂肪酸水平的降低對于NASH的進(jìn)展可能有促進(jìn)作用。本研究建立的小鼠NASH模型中,肝臟特異敲除LAMTOR1的小鼠肝臟中EPA和DHA顯著下降,說明LAMTOR1基因的敲除在小鼠NASH的進(jìn)程中可能發(fā)揮一個消極地促進(jìn)作用。同時,本研究中發(fā)現(xiàn)肝臟特異敲除LAMTOR1的NASH小鼠肝臟中GPC水平降低。此外,基于核磁共振磷譜技術(shù)的NAFLD病人肝臟代謝結(jié)果[27],具有NASH相關(guān)癥狀的NAFLD病人相比無NASH特征的病人,肝臟中GPC水平降低。因此,可以推斷LAMTOR1在NASH發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

圖8 誘導(dǎo)NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織中的琥珀酰腺苷水平變化(n=7)和肝癌里L(fēng)AMTOR1與ADSL的基因表達(dá)相關(guān)性分析

圖9 4個炎癥相關(guān)代謝物在誘導(dǎo)NASH模型后LAMTOR1LKO小鼠和WT小鼠肝臟組織中的變化(n=7)

3 結(jié)論

本研究用MCD飲食誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝臟炎癥性損傷,以此NASH疾病模型為平臺,借助基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的代謝組學(xué)手段,鑒定了肝臟特異性敲除LAMTOR1在小鼠肝臟中調(diào)控的重要代謝通路,并結(jié)合現(xiàn)有公共開放組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測分析,研究了LAMTOR1在NASH疾病進(jìn)展乃至發(fā)展為更嚴(yán)重的肝癌過程中可能參與的分子調(diào)控機(jī)理。其中重要代謝物水平的變化、LAMTOR1與其他相關(guān)基因在肝癌中相關(guān)性預(yù)測結(jié)果都顯示LAMTOR1在NASH疾病及后續(xù)的炎癥惡性轉(zhuǎn)化中可能發(fā)揮著重要作用。但是,肝臟炎癥惡性轉(zhuǎn)化中LAMTOR1與鑒定到的關(guān)鍵代謝通路的直接關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。