陳馨 楊武華

摘要：隨著現(xiàn)代生物技術(shù)不斷地發(fā)展，基因工程技術(shù)也越發(fā)成熟，越來越多的應用到了中藥的研究中，主要有中藥藥材基因序列的完善、中藥材的鑒定、中藥藥效評估、調(diào)節(jié)有效成分含量、參與單體化合物的合成等方面。本文將分別論述基因工程在中藥研究中的應用。

關(guān)鍵詞：基因工程;中藥;應用進展

【中圖分類號】R28 ?【文獻標識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）09-321-02

中醫(yī)藥在我國具有悠久的歷史，在治療疾病的過程中有著獨特的理論體系，然而更多的卻并未理解這理論體系，對中醫(yī)藥治療疾病存在著質(zhì)疑和不解，那么中藥的研究就顯得尤為重要，對于中藥的研究也日益增長。傳統(tǒng)中藥的特色和優(yōu)勢與現(xiàn)代生物工程技術(shù)相結(jié)合，為中藥的現(xiàn)代化和國際化提供了契機，有利于推動中草藥的發(fā)展。現(xiàn)代生物技術(shù)以基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程為主，本文中主要對基因工程技術(shù)在中藥中的運用進行概括論述。

1.基因工程

基因工程（或稱遺傳工程、基因重組技術(shù)）是將不同生物的基因在體外剪切組合，并和載體（噬菌體、質(zhì)粒、病毒）的DNA連接，然后轉(zhuǎn)入微生物或細胞內(nèi)，進行克隆，并使轉(zhuǎn)入的基因在細胞或微生物內(nèi)表達，產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)?；蚬こ套鳛楝F(xiàn)代生物工程技術(shù)的核心，在研究中藥的過程中也占據(jù)了主導地位。

1.1基因工程與藥材鑒定

中藥材運用的越來越多，需求越來越多，在這需多供少的時代，藥材的來源也越來越多，對于藥材的質(zhì)量控制，需要更多的技術(shù)鑒定，基因工程技術(shù)的應用更加具體化和可視化。石志剛[1]等人利用 psbA-trntH基因片段的保守區(qū)序列，設(shè)計引物擴增出了整個psbA-trntH基因片段，測定了擴增產(chǎn)物DNA堿基序，獲得7個寧夏枸杞主要品種psbA-trntH基因片段的完整序列，經(jīng)過分析能夠鑒定出不同枸杞之間的差異，或可有利于未來枸杞的鑒定。程方婷[2]等人對不同地區(qū)生長的地黃進行DNA序列測定，選取了3個葉綠體DNA條形碼片段（ psbA-trnH、matK、rbcL）、核基因ITS片段以及進化速率較快的3個候選葉綠體DNA片段（trnL-trnF、trnM-trnV和 trnS-trnG），證明trnS-trnG+ITS共同檢測能夠有效地區(qū)分不同地區(qū)的地黃。

隨著基因技術(shù)的不斷完善，已經(jīng)初步形成某些藥材的DNA檢測試劑盒及DNA條形碼技術(shù)。人參是一味及其珍貴和有效的藥材，其功效甚多，但由于產(chǎn)少需多，人工種植的越來越多，以次充好現(xiàn)象盛行，大大影響了藥效。周雨晴[3]等人研發(fā)了具有DNA提取及PCR鑒定的DNA檢測試劑盒，用于鑒別種植參及其偽品，并發(fā)現(xiàn)正品人參PCR在150-200bp有單一明亮條帶，將其DNA原液稀釋200倍、反復凍融20次、﹣20℃保存一年對檢測效果無任何影響。貝母是臨床最常用的止咳藥之一，川貝母善用于虛癥咳嗽，道地藥材的選擇和準確性對于中醫(yī)治療疾病至關(guān)重要。周亭亭[4]等人運用PCR和RFLP聯(lián)合使用，研制了川貝母DNA檢測試劑盒，RFLP結(jié)果顯示在100-250bp位置有兩條條帶清晰明亮的條帶，準確率和穩(wěn)定性均很高。李蕭涵[5]等人進一步對川貝DNA試劑盒進行完善，采用分子克隆技術(shù)獲得了正品川貝母特異基因序列，且進出現(xiàn)在100-250bp明亮清晰、無亞種條帶的特異性條帶，實現(xiàn)了川貝母特異基因序列大量的分子克隆及保存，免去了每次鑒定均要重新提取標準品的繁冗工作。王俊[6]等人選取26份血竭樣品，檢測ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK、trnL（ UAA） 內(nèi)含子、trnL（ UAA） 內(nèi)含子的P6 環(huán)序列，從而可以鑒定血竭的真?zhèn)?，但因血竭是樹脂類藥材，其DNA含量較少，可能會因為含量過低而無法檢測，影響真?zhèn)蔚谋鎰e，仍需進一步解決。湯歡[7]等人選取90個黃柏樣品，獲取穩(wěn)定的ITS2序列，NJ樹顯示川黃柏和關(guān)黃柏聚為一支，其混偽品各自聚為一支，說明可以通過ITS2序列鑒別川黃柏與關(guān)黃柏及其混偽品。利用基因工技術(shù)，鑒定中藥材，建立DNA條碼鑒定庫已經(jīng)成為目前的研究趨勢，也是中藥材質(zhì)控的重要手段，但由于產(chǎn)地多樣化，建立健全的鑒定庫也是比較困難的，需要不斷地研究探索與完善。

1.2基因工程與藥效評價

中藥在中醫(yī)學臨床應用中，講究配伍運用，君臣佐使即成方，往往不止一味中藥，況且每味中藥的活性成分也是種類繁多，這對于中藥治療疾病的認識以及治療機制的研究造成了很大的困擾?；蚬こ碳夹g(shù)的出現(xiàn)，一定程度上解決了這個問題，例如采用適當?shù)膭游锬Ｐ驮u價藥效、藥代以及毒理、作用機制及靶點?；蚯贸蜣D(zhuǎn)基因動物可以通過動物相關(guān)基因的調(diào)整從而產(chǎn)生適合疾病的動物模型，為中藥藥效評價提供了新的、相對穩(wěn)定方法。目前比較成熟的模型主要有ApoE 基因敲除小鼠動脈粥樣硬化易損斑塊模型、MKR糖尿病小鼠模型、轉(zhuǎn)基因小鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎模型、flk1-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚等。

林海丹[8]等人選用ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化易損斑塊模型，予以溫腎化痰方治療，發(fā)現(xiàn)該復方可明顯下調(diào)Orail、Caspase3、Caspase9、Bax 的基因及蛋白的表達，同時上調(diào)Bcl-2 的基因及蛋白的表達。表明溫腎化痰方可通過降低促凋亡基因的表達及相應蛋白的激活及表達，從而降低細胞凋亡及增殖的幾率，延緩甚至改善動脈粥樣硬化斑塊的進展。

MKR糖尿病小鼠模型是較早且較為成熟的轉(zhuǎn)基因動物模型，喻嶸[9]和成細華[10][11]等人選用該模型研究左歸復方對其代謝及炎癥的調(diào)節(jié)作用、抗氧化應激作用、胰島素表達與分泌的影響。發(fā)現(xiàn)研究表明該方具有顯著的改善MKR鼠糖耐量異常、降低空腹血糖、改善高胰島素血癥的作用、保護胰島B細胞、調(diào)節(jié)胰島素表達和分泌、抑制氧化應激，并具有降低與炎癥反應相關(guān)的細胞間黏附分子-1（ ICAM-1） 和血管細胞黏附分子（ VCAM-1） 水平的作用，從而改善MKR鼠的炎癥損傷和進一步的血管損傷。

張琦[12][13]等人運用轉(zhuǎn)基因小鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎模型，研究桂枝芍藥知母湯對類風濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）的療效及機制，發(fā)現(xiàn)桂枝芍藥知母湯可以改善關(guān)節(jié)炎的病情和癥狀，其機制可能是抑制C-反應蛋白（C-reactive protein， CRP）、白介素-2（Interleukin-2， IL-2）的分泌，同時抑制T淋巴細胞的增殖。

隨著對基因的認識，斑馬魚已廣泛用于血管生成的研究，其中在血管內(nèi)皮細胞中表達增強型綠色熒光蛋白的flk1-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚逐漸被開發(fā)，有助于深入研究血管發(fā)育[14]。張碩[15]等人選用flk1-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎，予以高中低劑量黃芪、莪術(shù)配伍處理，發(fā)現(xiàn)黃芪、莪術(shù)配伍可抑制體節(jié)間血管根數(shù)、長度和面積，且黃芪、莪術(shù)配伍高劑量組抑制作用最強，還采用激光共聚焦成像觀察了體節(jié)間血管頂端細胞的行為發(fā)現(xiàn)黃芪、莪術(shù)配伍通過抑制頂端細胞絲狀偽足的伸展抑制斑馬魚血管生成。蘇梅[16]等人也運用斑馬魚模型，探究腦脈利顆粒對血管新生的促進作用，發(fā)現(xiàn)中高劑量組有明顯的促進作用，其作用機制可能與升高VEGFR1基因表達有關(guān)，腦脈利顆粒還可預防血小板聚集性血栓形成，從而預防血栓。

1.3基因工程與藥材成分

藥材中的有效成分是有一定固定比例的，當某些活性成分大量需求時，如何提高這個成分的含量與產(chǎn)量就是最直接的解決方法，有研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與之相關(guān)基因，并調(diào)節(jié)有效成分的含量。對于某些藥材，學者們也進行人工培育新品種的研究。目前主要有枸杞、枳殼、百合、刺五加、白及等中藥材。

趙亞華[17]等人發(fā)現(xiàn)將小鼠金屬硫蛋白- I cDNA通過根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)入枸杞，mM T- IcDN A成功導入枸杞組織并得到表達，轉(zhuǎn)基因枸杞對鋅離子富集比對照高2倍以上。賀紅[18]等人采用農(nóng)桿菌介導法， 將能抑制病毒侵染的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入枳殼，，成功地獲得了轉(zhuǎn)外殼蛋白基因的枳殼植株。唐東芹[19]等人利用根癌農(nóng)桿菌介導法將pBIXPTA基因?qū)氚俸匣ńz誘導的胚性愈傷組織，成功獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因百合植株。張佳楨[20]等人克隆刺五加香葉基焦磷酸合成酶（geranyl pyrophosphate synthase， GPS）基因的cDNA序列，并分析基因序列特征、不同器官中基因表達水平及其與皂苷含量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其克隆獲得刺五加GPS基因的cDNA全長序列，且明確了刺五加GPS基因的表達量與皂苷含量之間存在正相關(guān)關(guān)系，為未來提高皂苷含量的研究奠定了基礎(chǔ)。許娟[21]等人克隆成功獲得白及磷酸甘露糖變位酶（PMM）基因（BsPMM）cDNA序列，檢測甘露糖合成相關(guān)基因（BsPMM和BsGMP）的表達特性，發(fā)現(xiàn)BsPMM和BsGMP的表達具有品種、組織、時空的特性，或許是調(diào)控多糖合成代謝途徑的關(guān)鍵基因，參與白及甘露糖和多糖的合成過程，為未來提高白及甘露糖及多糖成分奠定基石。

Olsson等[22]利用qPCR分析了青蒿素生物合成下游途徑關(guān)鍵酶基因細胞色素P450氧化酶（cytochrome P450 monooxygenase，CYP71AV1）、紫穗槐二烯羥化酶（amorpha-4， 11-diene synthase，ADS）以及青蒿醛Δ11 （13） 還原酶（artemisinic aldehydeΔ11 （13） reductase， DBR2）僅在腺毛體頂端細胞表達，而MEP途徑關(guān)鍵酶基因5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶（DXR）僅在近頂細胞中表達。將以上基因作為重要的靶點基因，通過基因工程改良青蒿，培育高產(chǎn)青蒿素轉(zhuǎn)基因新品種是研究重點之一，并且取得了良好的效果。

1.4基因工程與生產(chǎn)中藥有效化合物

利用植物作為生物反應器，獲得中藥材中活性成分產(chǎn)生的相關(guān)基因，并獲得外源性基因表達產(chǎn)物的研究日益完善，為藥材中常用活性成分的大量生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)。在我國青蒿治療瘧疾具有很悠久的歷史，隨著時代的發(fā)展，也逐漸為世界所接受，對于青蒿的研究也越來越多。但是由于原材料不足，對于其主要活性成分青蒿素的研究也更為關(guān)鍵，目前也有一些基因技術(shù)合成青蒿素，有望實現(xiàn)青蒿素的批量生產(chǎn)。青蒿素合成的相關(guān)酶主要有以下三種：法尼基焦磷酸合成酶、倍半萜環(huán)化酶、氧化酶和加氧酶。向禮恩[23]等人采用qRT-PCR技術(shù)對不同組織中青蒿素合成途徑涉及到的7個功能基因（ HMGR，DXR，F(xiàn)PS，ADS，CYP71AV1，CPR，AAR） 的表達水平進行分析，同時測定對應組織中青蒿素含量。發(fā)現(xiàn)青蒿素生物合成上游途徑涉及到的3 個關(guān)鍵酶基因HMGR，DXR，F(xiàn)PS在花中的表達量最高;青蒿素生物合成特有途徑涉及到的4個基因功能在根、莖、葉和花中均有表達;ADS表達量在葉中最高，其次為花，在莖中表達量最低; CYP71AV1表達量在花中最高，在葉中最低;CPR的最高表達量也出現(xiàn)在葉中;而AAR在各個組織中表達量相對而言都較低。這些結(jié)果均表明青蒿素的合成收到多基因的雙向協(xié)同作用，需要更加明確調(diào)控路徑，才能高產(chǎn)量青蒿素。夏菁[24]等人成功從青蒿中克隆了兩個新的JA信號通路負調(diào)控因子JAZ （jasmonate ZIM-domain，JAZ）基因家族成員AaJAZ5和AaJAZ6，表明青蒿 JAZ 家族成員存在著功能分化，AaJAZ5 可能是青蒿中真正參與JA信號轉(zhuǎn)導通路的主效基因，對其在 JA 信號介導調(diào)控青蒿素生物合成具有指導意義。

東莨菪堿和莨菪堿主要來源于藥材顛茄，龍世平[25]等人采用基于發(fā)根的基因表達系統(tǒng)，農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化顛茄，潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)顛茄自身PMT和H6H基因發(fā)根;基因組PCR鑒定轉(zhuǎn)基因發(fā)根;液體搖床培養(yǎng)后，HPLC測量莨菪堿和東莨菪堿含量;qPCR檢測顛茄PMT和H6H基因表達水平?；蚪MPCR檢測獲得5個雙基因共轉(zhuǎn)化顛茄發(fā)根系，其中2個發(fā)根系（PH2和PH14）的總生物堿含量得到顯著提高，最高的是PH2;4個轉(zhuǎn)基因發(fā)根系（PH2、PH32、PH14 和 PH20）東莨菪含量都有提高，其中PH2東莨菪堿含量最高?；虮磉_量與生物堿含量結(jié)果基本一致，說明顛茄發(fā)根中PMT和H6H兩者同時維持高水平表達可以極大程度的促進東莨菪堿積累，不僅如此，對于菪堿的合成也具有一定的指導價值。

2.討論

隨著基因工程技術(shù)不斷地進步，對于中草藥的認識也越加的完善，更加完善的基因庫建立，使得藥材的鑒別與質(zhì)量控制更加便捷和準確;對中藥材的藥理研究提供了更加有利的技術(shù)手段，讓中藥材的功效可視化，更加容易理解;利用某些特異基因調(diào)控有效成分含量，提高了藥物的利用度，減少原材料的浪費，同時也解決的供需不平衡的問題;轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決了有效單體產(chǎn)量低，不易種植培育的問題;對中藥材活性成分生物合成相關(guān)基因進行研究，不僅有利于提高有效成分含量，同時還有利于實現(xiàn)活性成分的批量生產(chǎn)。相信隨著時代的進步，基因工程技術(shù)會為中草藥的研究與發(fā)展帶來質(zhì)的飛躍。

參考文獻：

[1] 石志剛，萬如，李彥龍，等. 寧夏枸杞主要品種 psbA-trntH 的 DNA條形碼鑒定的初步研究[J]. 農(nóng)業(yè)科技與裝備， 2016， 6： 5–8.

[2] 程方婷， 李忠虎， 劉春艷， 等. 地黃屬植物的DNA條形碼研究[J]. 植物科學學報， 2015， 33（1）： 25–32.

[3] 周雨晴， 李明， 王雪松， 等. 人參DNA檢測試劑盒的研制與評價[J]. 中國藥學雜志， 2016， 51（21）： 1866–1870.

[4] 周亭亭， 于文靜， 李成明， 等. 川貝母DNA檢測試劑盒的研制與評價[J]. 中國藥學雜志， 2014， 49（6）： 501–504.

[5] 李蕭寒， 李成明， 周亭亭， 等. 中藥材川貝母標準品特異DNA指紋片段的克隆及鑒定[J]. 中國藥學雜志， 2016， 51（8）： 616-.

[6] 王俊， 劉霞， 孫偉， 等. 名貴中藥材血竭的DNA條碼鑒定研究[J]. 中國藥學雜志， 2015， 50（15）： 1261–1265.

[7] 湯歡， 向麗， 趙莎， 等. 應用DNA條形碼ITS2序列對市售藥材黃柏的鑒定研究[J]. 世界科學技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2016， 18（2）： 184–189.

[8] 林海丹， 陳銘泰， 莊震坤， 等. 溫腎化痰方對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化易損斑塊模型Orai1 、Caspase、Bax、Bcl-2等基因及相關(guān)蛋白表達的影響[J]. 云南中醫(yī)學院學報， 2019， 42（1）： 8–12.

[9] 喻嶸， 細成華， 吳勇軍， 等. 左歸復方對MKR轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠糖代謝及相關(guān)炎癥因子的影響[J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志， 2008， 14（8）： 602–604.

[10] 成細華，喻嶸， 吳勇軍， 等. 左歸復方對MKR轉(zhuǎn)基因2型糖尿病小鼠糖代謝及抗氧化應激的影響[J]. 中草藥， 2008， 39（11）： 1675–1679.

[11] 成細華，喻嶸， 李萍， 等. 左歸復方對MKR轉(zhuǎn)基因2型糖尿病鼠胰島素表達與分泌的影響[J]. 中國中醫(yī)急癥， 2008， 17（11）： 1573–1575.

[12] 張琦， 吳轟， 江泳， 等. 桂枝芍藥知母湯對轉(zhuǎn)基因小鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎T淋巴細胞增殖的影響[J]. 成都中醫(yī)藥大學學報， 2006， 29（3）： 24–26.

[13] 張琦， 吳轟， 江泳， 等. 桂枝芍藥知母湯對轉(zhuǎn)基因小鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎CRP、IL-2的影響[J]. 中醫(yī)雜志， 2005， 16（11）： 851–856.

[14] UDVADIA A J， LINNEY E. Windows into development ： historic，current，and future perspectives on transgenic zebrafish[J]. Developmental Biology， 2003， 256： 1–17.

[15] 張碩，唐德才，譚喜瑩，等. 黃芪、莪術(shù)配伍對斑馬魚血管生成的影響[J]. 中華中醫(yī)藥學刊， 2019.

[16] 蘇梅， 婁雅靜， 姜雅瓊， 等. 腦脈利顆粒對斑馬魚血管新生的促進及對血小板聚集性血栓形成的預防作用研究[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐， 2019， 33（5）： 24–29.

[17] 趙亞華， 何平，高向陽. 根癌農(nóng)桿菌介導的mMT+cDNA轉(zhuǎn)化枸杞及其表達的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2000， 33（2）： 92–97.

[18] 賀紅， 韓美麗，李耿光. 農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法構(gòu)建轉(zhuǎn)CTV-cp的枳殼植株[J]. 中國中藥雜志， 2001， 26（1）： 21–23.

[19] 唐東芹， 錢虹妹，唐克軒，等. 根癌農(nóng)桿菌介導半夏凝集素基因pBIXPTA對百合的轉(zhuǎn)化[J]. 上海交通大學學報， 2004， 22（2）： 135–167.

[20] 張家禎， 刑可心， 馮文紹， 等. 刺五加GPS基因克隆及表達特征與皂苷含量相關(guān)性研究[J]. 中草藥， 2019， 50（5）： 1227–1231.

[21] 許娟， 石云平， 蘇祖祥， 等. 白及PMM基因cDNA序列克隆及甘露糖合成相關(guān)基因的表達特性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報， 2019， 50（9）： 1913–1921.

[22] OLSSON M E， OLOFSSON L M， LINDAHL A， et al. Localization of enzymes of artemisinin biosynthesis to the apical cells of glandular secretory trichomes of Artemisia annua L .[J]. Phytochemistry， 2009， 70（9）： 1123–1128.

[23] 向禮恩， 嚴錚輝， 王貴軍， 等. 青蒿素生物合成途徑基因組織表達分析與青蒿素積累研究[J]. 中國中藥雜志， 2012， 37（9）： 1169–1173.

[24] 夏菁， 簡東琴， 曾俊嵐， 等. 青蒿JAZ基因克隆及其功能分析[J]. 藥學學報， 2018， 53（5）： 812–818.

[25]龍世平， 盧 衍， 王亞雄，等. 過表達內(nèi)源PMT和H6H基因?qū)︻嵡寻l(fā)根托品烷類生物堿合成的影響[J]. 藥學學報， 2013， 48（2）： 243–249.