徐仕琴 欒文杰 張永福 莫麗玲 楊硯斌 徐金會(huì)

摘要 為探討農(nóng)用酵素處理對(duì)提高葡萄耐鋁性的作用及相關(guān)機(jī)制，以2個(gè)砧木品種“貝達(dá)”和“通化-3”葡萄為材料，采用管道無(wú)土栽培的方法研究鋁脅迫下農(nóng)用酵素對(duì)葡萄膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物及耐鋁毒相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明，農(nóng)用酵素處理后，葡萄的SOD活性與POD活性、氧自由基產(chǎn)生速率以及MATE相對(duì)表達(dá)量低于脅迫處理前1 d;H2O2含量、丙二醛含量以及STOP1相對(duì)表達(dá)量低于鋁脅迫處理14 d，根系活力高于鋁脅迫處理14 d。農(nóng)用酵素處理后葡萄膜脂過(guò)氧化系統(tǒng)的受害程度和耐鋁毒相關(guān)基因表達(dá)量均下降，可見(jiàn)農(nóng)用酵素在緩解鋁毒對(duì)葡萄的傷害方面起著重要作用，能夠有效提高葡萄的耐鋁性。

關(guān)鍵詞 農(nóng)用酵素;葡萄;鋁脅迫;膜脂過(guò)氧化系統(tǒng);耐鋁毒基因;表達(dá)量

中圖分類(lèi)號(hào) S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2021）17-0015-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.004

Abstract In order to explore the effect of agricultural enzyme treatment on improving aluminum tolerance of grape and its related mechanism， two rootstock varieties ‘Beta and ‘Tonghua-3 grape were used as materials，the effects of agricultural enzymes on the expression of membrane lipid peroxidation products and aluminum tolerance related genes in grape under aluminum stress were studied by means of pipe soilless cultivation. The results showed that the activity of SOD and POD， the production rate of oxygen free radicals and the relative expression of MATE in grape after agricultural enzyme treatment were lower than those one day before stress treatment， the contents of hydrogen peroxide， malondialdehyde and the relative expression of STOP1 were lower than those of aluminum stress for 14 days，the root activity was higher than that of aluminum stress for 14 days. The damage degree of grape membrane lipid peroxidation system and the expression of genes related to aluminum tolerance decreased after agricultural enzyme treatment， which showed that agricultural enzyme played an important role in alleviating the damage of aluminum toxicity to grapes and could effectively improve the aluminum tolerance of grapes.

Key words Agricultural enzyme;Grape;Aluminum stress;Membrane lipid peroxidation system;Aluminum tolerance gene;Expression quantity

在土壤呈非酸性時(shí)，植物不會(huì)因?yàn)殇X產(chǎn)生毒害現(xiàn)象，但當(dāng)土壤呈酸性時(shí)，大量鋁溶于土壤溶液而形成對(duì)植物具有毒害作用的Al3+，植物根系的發(fā)育被抑制，從而影響根系吸收水分和養(yǎng)分[1]，因此在酸性土壤中，制約植物產(chǎn)量最關(guān)鍵的是鋁毒[2]。葡萄（Vitis spp.）原產(chǎn)中亞，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有抗癌、抗衰老等作用[3]。我國(guó)南方酸性土壤上種植的葡萄極易受鋁毒害，葡萄生長(zhǎng)危害嚴(yán)重，其超氧化物歧化酶（SOD）活性與過(guò)氧化物酶（POD）活性加強(qiáng)，根系活力降低等，使其漿果產(chǎn)量和品種大幅度下降[4]。

泰國(guó)的Rosukun利用有機(jī)固體廢物發(fā)酵獲得了一種溶液形式的產(chǎn)品，稱(chēng)為酵素（enzyme）[5]。酵素富含有機(jī)酸、有益微生物以及SOD等生物催化酶，因此具有抑制病原菌和生物催化的雙重作用[6]。研究表明，農(nóng)用酵素能長(zhǎng)期分泌抗生物質(zhì)，也能長(zhǎng)期分泌天然植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[7]。亦有研究表明，農(nóng)用酵素能夠使植物體內(nèi)與抗逆性相關(guān)的關(guān)鍵生理生化指標(biāo)大幅度提高[8]。此外，農(nóng)用酵素抗氧化活性物質(zhì)豐富[9]，具備較強(qiáng)清除超氧自由基等的能力[10]。在逆境脅迫下，活性氧產(chǎn)生和清除是不均衡，引發(fā)植物細(xì)胞損傷，而農(nóng)用酵素保護(hù)細(xì)胞免受損傷，提高其抗氧化能力[11]。

近年來(lái)，農(nóng)用酵素在提高農(nóng)作物抗氧化能力方面的研究成為熱點(diǎn)，但農(nóng)用酵素對(duì)鋁脅迫下葡萄膜脂過(guò)氧化系統(tǒng)及耐鋁毒相關(guān)基因表達(dá)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。我國(guó)南方土壤由于遭受農(nóng)業(yè)和工業(yè)過(guò)程的影響，其酸化程度日益加劇，鋁毒對(duì)葡萄的傷害日趨嚴(yán)重。通過(guò)利用農(nóng)用酵素處理來(lái)提高葡萄的耐鋁性為酸性土壤地區(qū)解決葡萄生產(chǎn)中的鋁毒問(wèn)題提供一條行之有效的途徑。為此，該研究采用無(wú)土栽培的方法，先進(jìn)行鋁脅迫處理14 d后，再用稀釋100倍的農(nóng)用酵素處理鋁脅迫下的葡萄，然后測(cè)定葡萄抗氧化系統(tǒng)的相關(guān)生理指標(biāo)及耐鋁相關(guān)基因（STOP1、MATE）的表達(dá)情況，探討鋁脅迫下農(nóng)用酵素對(duì)葡萄膜脂過(guò)氧化系統(tǒng)及耐鋁毒相關(guān)基因表達(dá)的影響，為使用農(nóng)用酵素來(lái)提高葡萄耐鋁毒能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試葡萄品種為美洲種內(nèi)雜種品種“貝達(dá)”（Vitis riparia × V.labrusca ‘Beta）和山葡萄品種“通化-3”（Vitis amurensis ‘Tonghua-3）的1年生扦插苗，二者均為砧木品種，由云南省彌勒市東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)管理局提供。農(nóng)用酵素的制作按水∶ 果蔬殘?jiān)ㄇ兴楹蟮姆压麑?shí)和枝葉）∶糖蜜=10∶3∶1（質(zhì)量比）比例混合后，裝入50 L塑料桶中，蓋好桶蓋，室溫避光發(fā)酵180 d以上，期間時(shí)常進(jìn)行攪動(dòng)，使其充分發(fā)酵，并排出發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，防止塑料桶被撐裂。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考以前不同鋁濃度對(duì)葡萄生長(zhǎng)脅迫影響研究的結(jié)果[12]，設(shè)置5 mmol/L鋁[Al2（SO4）3·18H2O，pH = 4.5]，進(jìn)行脅迫處理。采用PVP管進(jìn)行管道栽培，PVP管長(zhǎng)220 cm、直徑20 cm，管壁上有6個(gè)排成一排直徑為12 cm的圓孔，孔間距為40 cm。把栽培基質(zhì)裝入上口直徑35 cm、下口直徑10 cm、高28 cm的PVP塑料栽培容器中，然后挑選健康、無(wú)病蟲(chóng)害的1年生葡萄扦插苗定植于栽培容器中，每個(gè)栽培容器定植1株，之后把塑料栽培容器的下口8 cm插入管培的管道上的圓孔中進(jìn)行管培。移栽后，在管培的管道中加滿(mǎn)改良Hoaglands營(yíng)養(yǎng)液（pH 4.5），進(jìn)行緩苗10 d再開(kāi)始鋁脅迫處理。鋁脅迫處理分為2個(gè)階段，第1階段為處理的第1～14天，僅在Hoaglands營(yíng)養(yǎng)液中加入5 mmol/L鋁進(jìn)行脅迫處理;第2階段為處理的第15～28天，在用Hoaglands營(yíng)養(yǎng)液配制的5 mmol/L鋁處理液中加入稀釋100倍的農(nóng)用酵素進(jìn)行復(fù)合處理。在整個(gè)試驗(yàn)期間，根據(jù)天氣，每周添加處理液2～3次，管道中處理液每天用通氣泵進(jìn)行通氣1 h。在處理的第0天、第7天、第14天、第21天和第28天進(jìn)行采樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，其中，處理的第0天為鋁脅迫處理的前1 d，處理的第7天和第14天為單獨(dú)鋁脅迫處理，處理的第21天和第28天為鋁脅迫和農(nóng)用酵素復(fù)合處理。樣品是健壯且無(wú)病蟲(chóng)害的植株中部葉片和白色根尖。用于檢測(cè)耐鋁基因的葉片，立刻用液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

葡萄SOD活性采用氮藍(lán)四唑光氧化法;氧自由基產(chǎn)生速率采用羥胺法;過(guò)氧化氫（H2O2）含量采用硫酸鈦-濃氨水法;丙二醛（MDA）含量采用雙組分光光度法[13]。POD活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法;根系活力采用TTC還原法[14]。

葡萄STOP、MATE基因表達(dá)分析：采用Biozol試劑法，將采樣的葡萄葉片進(jìn)行總RNA的提取，純化，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋至70 ng/μL。IQTM 5 實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（BIO-RAD），熒光定量PCR;SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，試劑盒;GAPDH，UBQ，內(nèi)參基因，引物序列如表1。25 μL的反應(yīng)體系：1.0 μL稀釋好的cDNA模板，上下游引物 各1 μL，9.5 μL的RNase-free H2O，12.5 μL的SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ。PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 5 s、72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、0.3 ℃ 20 s，熔解階段。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，選用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行鄧肯式新復(fù)極差檢驗(yàn)（P<0.05），比較平均值之間的參數(shù)差異。選用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁脅迫下農(nóng)用酵素對(duì)葡萄膜脂過(guò)氧化系統(tǒng)的影響

2.1.1 葡萄在鋁脅迫下農(nóng)用酵素對(duì)其SOD和POD活性的影響。

從圖1可看出，“貝達(dá)”和“通化-3”在鋁脅迫后，SOD活性和POD活性明顯上升，在使用農(nóng)用酵素處理后又明顯下降。其中，從脅迫前到第7天時(shí)，“貝達(dá)”和“通化-3”的SOD活性分別上升了25.12%和21.65%，POD活性分別上升了162.23%和146.34%。從脅迫前到第14天時(shí)，二者的SOD活性分別上升了94.36%和83.68%，POD活性上升了30440%和243.90%，達(dá)到了差異顯著性水平。從第14天到第21天時(shí)，“貝達(dá)”和“通化-3”的SOD活性下降幅度不大，但二者的POD活性分別下降了86.26%、54.61%。從第14天到第28天時(shí)，“貝達(dá)”和“通化-3”的SOD活性分別下降了55.10%、56.34%，POD活性分別下降了91.43%、75.18%，達(dá)到了差異顯著性水平。這些結(jié)果表明，農(nóng)用酵素可能通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄體內(nèi)抗氧化酶的活性，清除鋁脅迫下產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)，減輕活性氧對(duì)細(xì)胞膜的氧化破壞程度，從而提高其耐鋁性。

2.1.2 葡萄在鋁脅迫下農(nóng)用酵素對(duì)其氧自由基產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響。

由圖2可知，鋁脅迫下，葡萄的氧自由基產(chǎn)生速率持續(xù)上升，H2O2含量也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)。從鋁脅迫前到第14天，“貝達(dá)”的氧自由基產(chǎn)生速率上升了6272%，H2O2含量上升了105.34%，而“通化-3”分別上升了31.97%和49.85%。農(nóng)用酵素處理后，從第14天到第21天“貝達(dá)”和“通化-3”氧自由基產(chǎn)生速率顯著降低，分別下降了71.17%和50.46%，H2O2含量持續(xù)增加。從第14天到第28天時(shí)，“貝達(dá)”氧自由基產(chǎn)生速率和H2O2含量分別下降了80.29%和28.43%，“通化-3”的氧自由基產(chǎn)生速率和H2O2含量分別下降了68.54%和30.42%?？梢?jiàn)，鋁脅迫下，葡萄氧自由基產(chǎn)生速率和H2O2含量增加，但加入農(nóng)用酵素后，二者均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

49卷17期 徐仕琴等 鋁脅迫下農(nóng)用酵素對(duì)葡萄膜脂過(guò)氧化系統(tǒng)及耐鋁毒相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.1.3 葡萄在鋁脅迫下農(nóng)用酵素對(duì)其MDA含量和根系活力的影響。

由圖3可知，鋁脅迫導(dǎo)致“貝達(dá)”和“通化-3”的MDA含量顯著增加，從脅迫前到第14天，二者的MDA含量分別上升了89.51%和140.83%。加入農(nóng)用酵素后，從第14天到第28天時(shí)“貝達(dá)”和“通化-3”MDA含量分別降低了31.69%和31.14%。說(shuō)明農(nóng)用酵素可以有效降低鋁脅迫對(duì)葡萄細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的破壞程度，有效提高了葡萄耐鋁性。

鋁脅迫下，“貝達(dá)”和“通化-3”的根系活力不斷下降，從鋁脅迫前到第14天時(shí)，二者的根系活力分別下降了69.14%和66.39%，且均達(dá)到差異顯著性水平，說(shuō)明此時(shí)葡萄根系受到了傷害。加入農(nóng)用酵素后，二者的根系活力逐漸增強(qiáng)，從第14天到第28天時(shí)，二者的根系活力分別提高了93.84%和380.61%。

2.2 葡萄在鋁脅迫下農(nóng)用酵素對(duì)其葉片STOP1和MATE基因相對(duì)表達(dá)量的影響

STOP1和MATE基因已經(jīng)被證實(shí)對(duì)提高植物耐鋁毒能力起著重要作用。從圖4可以看出，“貝達(dá)”和“通化-3”隨鋁處理時(shí)間延長(zhǎng)，其基因表達(dá)量上升，但農(nóng)用酵素處理后，基因表達(dá)量急速下降。從脅迫前到第14天，STOP1基因的表達(dá)量在“貝達(dá)”和“通化-3”分別上調(diào)了704.11%和504.10%，MATE基因的表達(dá)量在“貝達(dá)”和“通化-3”分別上調(diào)了331.19%和56.46%，這說(shuō)明葡萄通過(guò)調(diào)控相應(yīng)耐鋁毒基因的上調(diào)表達(dá)來(lái)提高耐鋁毒能力。

加入農(nóng)用酵素處理后，“貝達(dá)”和“通化-3”的STOP1和MATE基因的表達(dá)量均有所下降。從第14天到第28天時(shí)，二者的STOP1基因的表達(dá)量分別下降了80.27%和77.69%，二者的MATE基因的表達(dá)量分別下降了92.36%和91.59%，且均達(dá)到差異顯著性水平。

可見(jiàn)，STOP1基因和MATE基因均參與了鋁脅迫的響應(yīng)過(guò)程，同時(shí)加入農(nóng)用酵素后，STOP1和MATE基因的表達(dá)量下降，表明酵素對(duì)提高葡萄耐鋁性具有積極作用。

3 討論與結(jié)論

我國(guó)南方大部分土壤呈酸性，大量鋁元素會(huì)被溶解，毒害了植物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致植物營(yíng)養(yǎng)缺乏和生長(zhǎng)受阻甚至產(chǎn)量下降[15]。在我國(guó)南方酸性土壤中種植的葡萄極其容易受到鋁毒的危害，鋁脅迫下其植株生長(zhǎng)受抑、果實(shí)品質(zhì)差、樹(shù)勢(shì)衰弱、品種退化等[16]。

當(dāng)植物受到鋁脅迫時(shí)，多余活性氧無(wú)法清除，氧化損傷加重。該研究發(fā)現(xiàn)，5 mmol/L鋁脅迫下，為減少葡萄產(chǎn)生過(guò)量活性氧，“貝達(dá)”和“通化-3”的SOD和POD活性均增強(qiáng)，從而保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)免受損傷，這與彭艷等[17]的研究結(jié)果相似，鋁不僅誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，而且還誘導(dǎo)抗氧化酶增加，植物的抗性也增加[18];但在加入稀釋100倍的農(nóng)用酵素后，“貝達(dá)”和“通化-3”的SOD和POD活性顯著下降，說(shuō)明農(nóng)用酵素對(duì)緩解鋁脅迫下葡萄的氧化損傷具有一定的作用，保護(hù)其膜脂過(guò)氧化系統(tǒng)，從而提高了葡萄耐鋁性。

5 mmol/L的鋁脅迫下，“貝達(dá)”和“通化-3”的氧自由基產(chǎn)生速率上升，二者的H2O2含量也增加，對(duì)生物膜造成氧化傷害[19]，鋁毒造成的膜損傷與劇毒氧自由基的產(chǎn)生增加有關(guān)[20]，但農(nóng)用酵素處理后，二者的氧自由基產(chǎn)生速率顯著下降，農(nóng)用酵素處理時(shí)間增加自由基清除率不斷上升，與賈麗麗等[21]的研究結(jié)果相符合;農(nóng)用酵素處理后二者的H2O2含量也顯著下降，農(nóng)用酵素能夠增加土壤氮[22]、磷[23]、鉀[24]的含量，氮、磷、鉀的增加能夠提高抵抗鋁毒的能力[25]，說(shuō)明農(nóng)用酵素在緩解鋁脅迫下葡萄膜脂過(guò)氧化有著積極作用。

MDA含量反映植物體內(nèi)氧化應(yīng)激的程度[26]，5 mmol/L鋁脅迫下，“貝達(dá)”和“通化-3”的MDA含量均增加，這與Tewari等[27]的研究結(jié)果一致;在農(nóng)用酵素處理后，二者的MDA含量便大幅度下降，說(shuō)明農(nóng)用酵素在清除活性氧并減輕細(xì)胞膜受到的氧化受害中起關(guān)鍵作用。根系活力是反映植物根系生理特性的重要指標(biāo)，與植物根系呼吸有關(guān)?！柏愡_(dá)”和“通化-3”的根系活力隨著鋁脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而降低，農(nóng)用酵素處理后，二者的根系活力均有所上升，根系活力增強(qiáng)是耐鋁性提高的具體表現(xiàn)，因?yàn)楦祷盍υ鰪?qiáng)后可向地上部分提供更多的養(yǎng)分和水分，以確保植物在鋁脅迫環(huán)境中正常生長(zhǎng)。鋁中毒關(guān)鍵部位根尖，為阻礙Al3+侵入其細(xì)胞，會(huì)分泌有機(jī)酸。有機(jī)酸、蛋白質(zhì)鏈（酶）、無(wú)機(jī)鹽組成了酵素，由此可見(jiàn)，酵素處理在提高葡萄耐鋁性中有極其重要的作用。

STOP1基因能抵抗非生物脅迫。在該研究中，鋁脅迫下葡萄STOP1基因被激活，增強(qiáng)了植株的抗性從而誘導(dǎo)其他的耐鋁基因，轉(zhuǎn)錄分泌更多的有機(jī)酸[28]。但加入農(nóng)用酵素以后STOP1基因的表達(dá)量下降，這是由于農(nóng)用酵素富含有機(jī)質(zhì)和有機(jī)酸等成分，具有酸堿緩沖能力改善土壤和根際pH，從而降低了鋁的活性阻礙鋁對(duì)葡萄的毒害。MATE基因是植物中通過(guò)分泌有機(jī)酸而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在鋁誘導(dǎo)下，MATE轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)檸檬酸的分泌，將Al3+離子螯合成無(wú)毒化合物，防止Al3+進(jìn)入植物體內(nèi)。鋁脅迫能顯著誘導(dǎo)葡萄MATE基因表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了抵御鋁毒害的能力，其中MATE基因的表達(dá)量升高促進(jìn)了檸檬酸分泌;同時(shí)提高SOD與POD 的活性來(lái)減弱鋁脅迫對(duì)質(zhì)膜造成的氧化損傷，這與前人在大豆[29]和甘藍(lán)[30]的研究結(jié)果一致。但加入農(nóng)用酵素后MATE基因的表達(dá)量下降，農(nóng)用酵素中的微生物自身代謝產(chǎn)生乙酸、檸檬酸和氨基酸，這些酸性物質(zhì)具有螯合、酸溶和抑菌作用[31]，其能夠與鋁螯合，鋁離子活性被降低，從而減輕鋁脅迫對(duì)葡萄的毒害。

綜上所述，鋁毒脅迫對(duì)葡萄產(chǎn)生了氧化傷害，并誘導(dǎo)了抗氧化酶和激活耐鋁毒相關(guān)基因（STOP1和MATE）的表達(dá)，酵素能夠有效提高葡萄耐鋁性。鋁脅迫下，提高SOD和POD活性及氧自由基產(chǎn)生速率，MDA和H2O2含量增加，并且STOP1基因和MATE基因表達(dá)量上調(diào)，根系活力下降，說(shuō)明葡萄受到了鋁毒的影響，不能正常生長(zhǎng)發(fā)育。然而，農(nóng)用酵素處理后，降低SOD和POD活性及氧自由基產(chǎn)生速率，MDA和H2O2含量減少，STOP1基因和MATE基因的表達(dá)下調(diào)，根系活力上升，說(shuō)明農(nóng)用酵素在清除葡萄活性氧中發(fā)揮著重要作用，降低其膜脂過(guò)氧化水平，有效緩解了鋁毒對(duì)葡萄的生理傷害。

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