李志明 王彥平 郭勇 王春偉 王相國 倪和民

摘要 [目的]探究整合素αv β3、TGF-β、HSP10、PAG、IL-10等妊娠因子在荷斯坦奶牛早期妊娠過程中的規(guī)律，篩選奶牛早期妊娠診斷標(biāo)志因子。[方法]選取49頭荷斯坦奶牛，在輸精后第7、14、21、28天取外周血，采用熒光定量PCR方法分析整合素αv β3的表達(dá)趨勢和變化規(guī)律，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法分析TGF-β、HSP10、PAG、IL-10的表達(dá)趨勢和變化規(guī)律。60 d后通過直檢對50頭荷斯坦奶牛進(jìn)行懷孕檢測。[結(jié)果]50頭奶牛中有23頭受孕、26頭未受孕。通過分析受孕和未孕奶牛血液中整合素αv β3基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)整合素αv β3基因在受孕奶牛血液中的表達(dá)量高于未孕奶牛，特別是輸精后第21、28天受孕奶牛的表達(dá)量顯著增高（P<0.05）;TGF-β、HSP10、PAG、IL-10蛋白質(zhì)表達(dá)量變化在28 d內(nèi)不能有效區(qū)分懷孕奶牛與未孕奶牛。[結(jié)論]整合素αv β3可作為奶牛早期妊娠診斷標(biāo)志因子，理論上可將孕檢的時間窗口提前到早期妊娠階段的第21天。

關(guān)鍵詞 荷斯坦奶牛;整合素αv β3;血液;早期妊娠;診斷

中圖分類號 S823 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2021）17-0088-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.024

Abstract [Objective] To study the regularity of pregnancy factors such as integrin αv β3， TGF-β， HSP10， PAG， IL-10 in the early pregnancy of Holstein cows， and screen out the marker factors for the early pregnancy diagnosis of dairy cows.[Method] 49 Holstein cows were selected and peripheral blood was taken on the 7th， 14th ， 21st， and 28th days after insemination. Fluorescence quantitative PCR was used to analyze the expression trend and change laws of integrin αv β3， and the enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method was used to analyze the expression trend and change laws of TGF-β， HSP10， PAG， and IL-10. After 60 days， 50 Holstein cows were tested for pregnancy by using rectum examination.[Result] Among 50 detected Holstein cows， 23 cows were pregnant and 26 cows were not. By analyzing the expression of integrin αv β3 gene in the blood of pregnant and non-pregnant dairy cows， it was found that the expression of integrin αv β3 gene in the blood of pregnant dairy cows was higher than that of non-pregnant dairy cows，especially the expression level of dairy cows on the 21st and 28th days after insemination increased significantly（P<0.05） . Through analyzing the expression level changes of TGF-β， HSP10， PAG， IL-10 within 28 days， pregnant cows could not effectively distinguished from non-pregnant cows.[Conclusion] Integrin αv β3 could be used as a diagnostic marker for early pregnancy of dairy cows.In theory， the time window for pregnancy examination could be advanced to the 21st day of early pregnancy.

Key words Holstein cows;Integrin αv β3;Blood;Early pregnancy;Diagnosis

對于奶牛養(yǎng)殖行業(yè)而言，配種效率將直接影響企業(yè)效益[1]，主要表現(xiàn)為產(chǎn)奶量降低、護(hù)理成本增加2個方面。因此，對輸精奶牛是否妊娠作出盡可能早的判斷對于奶牛養(yǎng)殖具有實(shí)際意義。母牛在輸精后應(yīng)盡早確定是否妊娠，這對于養(yǎng)殖場的經(jīng)濟(jì)效益是非常重要的[2]。經(jīng)過早期妊娠診斷，可以給妊娠母牛提供更符合孕期所需要的營養(yǎng)與環(huán)境，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，使胎兒更好地發(fā)育，避免胚胎的早期死亡或流產(chǎn);可以對未妊娠的母牛及時采取措施進(jìn)行二次配種;對于多次配種不孕的母牛及時淘汰，通過縮短產(chǎn)犢間隔來降低奶牛的飼養(yǎng)成本。提前檢測出奶牛受孕情況能夠有效減少孕期奶牛飼料和人工成本，提高經(jīng)濟(jì)效益[3-4]。目前診斷奶牛妊娠的直接方法有直腸觸診法、超聲波檢查法，間接方法有孕酮、早期妊娠因子等[1]。以上診斷方法表現(xiàn)優(yōu)劣各異，但最早精確診斷的窗口時間為輸精后的第28天[5-6]。

因此，越來越多的研究聚焦于尋找新型指示早期妊娠診斷的血液因子。細(xì)胞應(yīng)激源（如熱、炎癥、轉(zhuǎn)化和胚胎分裂）可以迅速誘導(dǎo)熱休克蛋白水平[7]。熱休克蛋白10（HSP10）在懷孕期間定位于細(xì)胞外，細(xì)胞外HSP10通常被稱為早孕因子（EPF），因?yàn)樗趹言械牡谝浑A段釋放，參與妊娠的建立、胚胎發(fā)育以及細(xì)胞的增殖和分化[8]。牛妊娠相關(guān)糖蛋白（PAG）是對奶牛進(jìn)行間接早期妊娠診斷的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的。牛PAG已經(jīng)被免疫定位于胎兒子葉絨毛中存在的滋養(yǎng)層雙核細(xì)胞，并從滋養(yǎng)外胚層向子宮上皮的雙核細(xì)胞遷移，允許含有顆粒的、具有胞吐作用的PAG進(jìn)入母體循環(huán)[9]。TGF-β的生物學(xué)活性極其廣泛，無論是在早期胚胎發(fā)育、胞外基質(zhì)的合成、軟骨和骨的形成過程中，還是在間質(zhì)纖維化、炎癥、免疫和內(nèi)分泌功能的調(diào)節(jié)、腫瘤的形成和發(fā)展階段中都發(fā)揮著重要的作用[10]。白細(xì)胞介素-10（IL-10）在維持免疫耐受方面起到至關(guān)重要的作用。研究表明，通過免疫治療增加 IL-10 的表達(dá)量有利于維持妊娠[11]。整合素αv β3是一種異二聚體的跨膜糖蛋白，可在多種細(xì)胞中表達(dá)，分布較為廣泛[12]，主要參與細(xì)胞黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、血液凝集、腫瘤血管生成等過程。子宮內(nèi)膜容受態(tài)的建立與整合素αv β3在胚胎著床過程中的表達(dá)有關(guān)[13]。研究表明，對人的子宮而言，整合素αv β3與其配體的檢測可以區(qū)別其容受態(tài)和非容受態(tài)[14-16]。在常見動物的早期妊娠研究中也發(fā)現(xiàn)整合素與子宮容受態(tài)的建立有一定的關(guān)聯(lián)[17-18]。

牛胚胎附植過程發(fā)生在輸精后20 d前，在這一時間段體內(nèi)會發(fā)生很多改變，可以通過檢測奶牛外周血液中整合素αv β3、TGF-β、HSP10、PAG、IL-10等在基因和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)差異來診斷奶牛是否妊娠，成為輸精后20 d左右檢測奶牛是否妊娠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器與設(shè)備。RT-PCR儀（Eppendorf，AG00246），電熱恒溫烘箱（上海一恒科技儀器有限公司，DHG-9075A），高壓鍋（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司，AutocLare-G182M），制冰機(jī)（Sanyo），移液槍（GiLson），低溫離心機(jī)（Backman CouLtek，ALLegraTM 64R Centrifuge），微量紫外分光檢測系統(tǒng)（ALphaspec Innotech，ALpha SpecTM），手掌離心機(jī)（Bratt），紫外可見分光光度計（優(yōu)尼科儀器有限公司，WFZ-μ-2000型），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國BIO-RAD公司）。

1.1.2 主要試劑與耗材。TRLzoLReagent總RNA提取試劑（Invitrogen USA LTD，200 mL/瓶），GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Promega），ultra SYBR Mixture（High ROX）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，5 mL/盒），RBC Lysis buffer（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，100 mL/瓶），牛白細(xì)胞介素10（IL-10）ELISA檢測試劑盒（泉州科諾迪生物科技有限公司），牛妊娠相關(guān)糖蛋白（PAG）ELISA檢測試劑盒（泉州科諾迪生物科技有限公司），牛熱休克蛋白10（Hsp-10）ELISA檢測試劑盒（泉州科諾迪生物科技有限公司），牛轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）ELISA檢測試劑盒（泉州科諾迪生物科技有限公司）。

1.2 樣品選取與采血方法

于北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司奶牛中心選取50頭第二次受孕的荷斯坦奶牛，使其同期發(fā)情并后期觀察記錄其受孕情況。

采用牛尾采血法，在距牛尾10 cm處進(jìn)行乙醇消毒、抽血，將血液轉(zhuǎn)移到提前準(zhǔn)備好的抗凝管中保存。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR

1.3.1 引物。使用Primer-BLAST設(shè)計引物，由生工生物工程（上海股份有限公司）北京合成部合成。αv基因的正反向引物分別為CAAGAGCAGCGAGGACTTTG和GCCGATAAACACATATGCGT，合成的片段大小為158 bp;β3基因的正反向引物分別為TGGGGCTGATGACTGAGAGAAG和ACGCACTTCCAGCTCTATT，合成的片段大小為206 bp;β-actin基因的正反向引物分別為CCTGCGGCATTCACGAAACTA和ACTCCTGCTTGCTGATCCACTC，合成的片段大小為148 bp。

1.3.2 TrizoL法提取RNA與反轉(zhuǎn)錄。

1.3.2.1 均質(zhì)化處理。取4 mL新鮮奶牛血液，加入12 mL紅細(xì)胞裂解液，冰上孵育15 min 并混勻，4 ℃下10 000 r/min離心1 min后收集白細(xì)胞，棄上清;于沉淀中加入8 mL紅細(xì)胞裂解液，充分重懸白細(xì)胞，4 ℃下10 000 r/min離心1 min后收集白細(xì)胞，吸棄上清液;加入1 mL TrizoL重懸細(xì)胞。

1.3.2.2 分層。加入Trizol后用渦旋機(jī)振蕩5 min，使樣品完全裂解（在-80 ℃下保存），靜置5 min后加入200 mL氯仿振蕩15 s，充分混合液體，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，溶液分為3層，上層水相為RNA。

1.3.2.3 RNA沉淀。將200 μL 水相小心吸取轉(zhuǎn)移到新的離心管中，避免吸入下層液體，并在室溫下加入 500 μL異丙醇，冰上靜置 10 min。4 ℃下12 000 r/min離心10 min后，棄去上清液，RNA沉淀在管底。

1.3.2.4 RNA漂洗。RNA沉淀中加入85%冰乙醇，并用手指彈起沉淀;4 ℃ 7 500 r/min下離心6 min，棄上清，此操作重復(fù)2次。

1.3.2.5 溶解 RNA。室溫晾干殘余的乙醇，然后加入10 μL無RNA酶水輕彈管壁充分溶解RNA。

1.3.2.6 測定RNA濃度。使用微紫外分光光度檢測系統(tǒng)的OD260/OD280，測定RNA濃度（單位μg/mL）。

1.3.2.7 合成cDNA。分別加入RNA 3 μL、Oligo（dT）15 Primer 1 μL和Random Primers 1 μL后，在70 ℃下溫育5 min后置于冰上5 min。

依次加入GoScriptTM 5X Reaction buffer 4 μL、MgCl2 3 μL、PCR Nucleotide Mix 1 μL、Recombinant RNasinRibonuclease Inhibitor 0.5 μL、GoScriptTM Reverse Transcriptase 0.5 μL和6 μL Nuclease-Free Water并在25 ℃下孵育5 min，于42 ℃下孵育1 h后獲得cDNA。

1.3.3 實(shí)時熒光定量 PCR 反應(yīng) PCR反應(yīng)體系。

①添加1 μL Forward Primer，10 μmol/L 1 μL Reserve Primer、10 μmol/L 2 μL Template DNA，25 μL 2×ultraSYBR Mixture（High ROX），用ddH2O補(bǔ)足50 μL。離心10 s后充分振蕩3 min，再次離心10 s，確保試劑沉于管底并確保液體無氣泡。

②提前打開熒光定量PCR預(yù)熱15 min。

③PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 32 s，循環(huán)40次;第三階段，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s。

1.4 ELISA

從懷孕和未孕奶牛中隨機(jī)選取5頭牛外周血樣，使用ELISA試劑盒分別檢測TGF-β、HSP10、PAG、IL-10的蛋白表達(dá)量。先將用EDTA作為抗凝劑，采集新鮮血液，并將血液在采集后的30 min內(nèi)于4 ℃1 000×g離心15 min，取上清即可檢測。

①所需板條須在室溫平衡60 min后使用。

②設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，分別添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL、待測樣本50 μL和樣本稀釋液50 μL。

③各反應(yīng)孔中加入100 μL辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體，用封板膜封住，于37 ℃恒溫箱中溫育1 h。

④使用洗滌液重復(fù)洗板5次。

⑤顯色：各反應(yīng)孔中加入底物A、B溶液各50 μL，37 ℃下避光孵育15 min。

⑥終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入終止液50 μL，15 min內(nèi)測定各孔在波長450 nm處的OD值。

⑦根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線，計算各樣本濃度值。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 血液中αv基因相對表達(dá)量的變化

如圖1 所示，懷孕奶牛在輸精后的第21、28天時αv基因表達(dá)量顯著高于未孕奶牛，同時懷孕奶牛第21、28天表達(dá)量顯著高于第7天（P<0.05），未孕奶牛αv基因表達(dá)量沒有顯著變化。

2.2 血液中β3基因相對表達(dá)量

如圖2所示，懷孕奶牛在輸精后的第28天時β3基因相對表達(dá)量比未孕奶牛明顯升高，同時未懷孕奶牛第28天β3基因相對表達(dá)量較第21天明顯降低，懷孕奶牛的表達(dá)量沒有顯著變化。

2.3 懷孕與未孕奶牛中HSP10蛋白的相對表達(dá)量

如圖3所示，懷孕奶牛血液中HSP10相對表達(dá)量與未孕奶牛相比無顯著差異（P>0.05）。

2.4 懷孕與未孕奶牛中PAG的相對表達(dá)量

如圖4所示，懷孕奶牛血液中PAG相對表達(dá)量與未孕奶牛相比無顯著差異（P>0.05），并未孕奶牛PAG相對表達(dá)量在第7天顯著低于第14、28天（P<0.05）。

2.5 懷孕與未孕奶牛中TGF-β的相對表達(dá)量

如圖5所示，懷孕奶牛血液中TGF-β相對表達(dá)量與未孕奶牛相比無顯著差異（P>0.05）。

2.6 懷孕與未孕奶牛中IL-10的相對表達(dá)量

如圖6所示，懷孕奶牛血液中IL-10的相對表達(dá)量與未孕奶牛相比無顯著差異（P>0.05）。

3 討論

奶牛的妊娠診斷在實(shí)際畜牧生產(chǎn)中具有重要地位，盡早發(fā)現(xiàn)奶牛妊娠能夠減少其配種次數(shù)、降低胚胎死亡率、提早發(fā)現(xiàn)空懷現(xiàn)象、縮短產(chǎn)犢間隔時間，提高奶牛繁殖率。經(jīng)直腸子宮觸診是目前最廣泛采用的妊娠診斷方法，可在45 d準(zhǔn)確檢出;超聲檢測在人工授精后28～35 d其妊娠診斷的敏感性和特異性才能準(zhǔn)確，因此最早的妊娠檢測窗口為28 d。該研究旨在探究TGF-β、HSP10、PAG、IL-10、整合素αv β3在奶牛妊娠早期表達(dá)量的變化，從而進(jìn)行奶牛早期妊娠診斷分子篩選，使早期妊娠檢測窗口提前至21 d，可及早采取有效措施，提高產(chǎn)犢率和經(jīng)濟(jì)收入。

整合素對胚胎著床時滋養(yǎng)細(xì)胞（囊胚）與子宮上皮的黏附具有重要作用。該試驗(yàn)探究整合素αv β3在奶牛妊娠早期表達(dá)量的變化，探討其與奶牛妊娠率之間的關(guān)系。據(jù)報道，整合素αv表達(dá)減少會使細(xì)胞黏附滋養(yǎng)層球體的能力降低[19]。Tei等[20]研究表明整合素αv β3表達(dá)量與受孕結(jié)果具有相關(guān)性，且整合素αv β3的蛋白表達(dá)量增加，母豬總胎兒數(shù)和活胎數(shù)分別增加[21]。該研究結(jié)果表明，整合素αv β3也呈現(xiàn)相似的結(jié)果，整合素αv在懷孕奶牛輸精后的第21天達(dá)到峰值，因此有可能將檢測窗口提前到21 d。

在基因水平找到了相關(guān)性后，試驗(yàn)將目標(biāo)轉(zhuǎn)向TGF-β、HSP10、PAG、IL-10蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。相關(guān)研究證實(shí)，早孕因子（EPF）最早是由Ohnuma等[22]在母馬中使用玫瑰花樣細(xì)胞團(tuán)的抑制滴度（RIT）確定懷孕和未懷孕母馬的血清EPF水平有顯著差異。Takagi等[23]報道妊娠母馬的EPF水平在胚胎去除后降低，在胚胎成功移植受體母馬后其EPF水平再次上升;1993年，Wegmann等[24]在妊娠大鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，外周血單個核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子中 IL-4、IL-5、IL-10的相對表達(dá)水平提高，而γ-干擾素的相對表達(dá)水平降低。Manjari等[25]研究表明IL-10從懷孕第8天開始呈上升趨勢，并在整個孕期保持高水平表達(dá)。Rappolee等[26]首次證實(shí)轉(zhuǎn)化生長因子-β、轉(zhuǎn)化生長因子-α和血小板衍生生長因子-A在小鼠著床前胚胎中的表達(dá)。Watson等[27]也證實(shí)生長因子TGFα、TGFβ1、TGFβ2、胰島素樣生長因子-I、胰島素樣生長因子-Ⅱ和血小板衍生生長因子-A在反芻動物著床前并且胚胎中在1-細(xì)胞期就有表達(dá)，并持續(xù)表達(dá)到胚胎本身和滋養(yǎng)細(xì)胞中（至妊娠30 d）。在綿羊受孕期，已知可誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）、TGFβ2或TGFβ3的表達(dá)在第18天及以后開始增加[28]。研究表明，與未懷孕的奶牛相比，在懷孕的第24天母體血液循環(huán)中PAG濃度有所增加[29]，在授精后的第24～26天母體血液循環(huán)中PAG增加[30-31]。綜上所述，TGF-β、HSP10、PAG、IL-10的蛋白質(zhì)表達(dá)量會在妊娠早期發(fā)生變化，具有作為早期妊娠診斷分子的潛質(zhì)。該試驗(yàn)結(jié)果表明，TGF-β、HSP10、PAG、IL-10的相對表達(dá)量在懷孕和未孕奶牛輸精后相同時間內(nèi)沒有差異，認(rèn)為在取樣時奶牛的數(shù)量和時間間隔對試驗(yàn)結(jié)果造成了不同程度的影響，在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)擴(kuò)大奶牛品種選擇和奶牛數(shù)量，選擇不同地區(qū)飼養(yǎng)場和縮短采樣時間。

4 結(jié)論

經(jīng)試驗(yàn)初步證實(shí)整合素αv β3可作為有價值的早期妊娠檢測的標(biāo)志因子。

參考文獻(xiàn)

[1] 張飛龍，姚鳳桐.奶牛養(yǎng)殖的成本收益分析：以呼和浩特市為例[J].內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì)，2016（13）：48-49.

[2] 張榆敏，薛翠云.談?wù)劶倚笤缙谌焉镌\斷的意義及方法[J].畜禽業(yè)，2016（2）：40-42.

[3] 馬林，王鳳珍.奶牛繁殖管理的若干措施[J].現(xiàn)代畜牧科技，2018（4）：44.

[4] 甄志剛，王春強(qiáng)，吳思思.三種奶牛早期妊娠診斷方法臨床應(yīng)用效果比較[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015（10）：35-37.

[5] 徐迪.奶牛的配種、妊娠及分娩[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2018（9）：83-84.

[7] POLEJAEVA I A，CHEN S H，VAUGHT T D，et al.Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells[J].Nature，2000，407（6800）：86-90.

[7] CAVANAGH A C.Identification of early pregnancy factor as chaperonin 10：Implications for understanding its role[J].Rev Reprod，1996，1（1）：28-32.

[8] MORTON H.Early pregnancy factor：An extracellular chaperonin 10 homologue[J].Immunol Cell Biol，1998，76（6）：483-496.

[9] WOODING F B.The synepitheliochorial placenta of ruminants：Binucleate cell fusions and hormone production[J].Placenta，1992，13（2）：101-113.

[10] PASCHE B.Role of transforming growth factor beta in cancer[J].J Cell Physiol，2001，186（2）：153-168.

[11] CHENG S B，SHARMA S.Interleukin-10：A pleiotropic regulator in pregnancy[J].Am J Reprod Immunol，2015，73（6）：487-500.

[12] 詹同彤.牛孤雌激活和體外受精囊胚共培養(yǎng)前后IFNAR 和整合素 αvβ3 的表達(dá)變化[D].北京：北京農(nóng)學(xué)院，2018.

[13] LESSEY B A.Implantation defects in infertile women with endometriosis[J].Ann N Y Acad Sci，2002，955（1）：265-280.

[14] MAKKER A，SINGH M M.Endometrial receptivity：Clinical assessment in relation to fertility，infertility，and antifertility[J].Med Res Rev，2006，26（6）：699-746.

[15] STROWITZKI T，GERMEYER A，POPOVICI R，et al.The human endometrium as a fertility-determining factor[J].Hum Reprod Update，2006，12（5）：617-630.

[16] PEDERSEN H G，SCHMIDT M，SANGILD P T，et al.Clinical experience with embryos produced by handmade cloning：Work in progress[J].Mol Cell Endocrinol，2005，234（1/2）：137-143.

[17] MISICA-TURNER P M，OBACK F C，EICHENLAUB M，et al.Aggregating embryonic but not somatic nuclear transfer embryos increases cloning efficiency in cattle[J].Biol Reprod，2007，76（2）：268-278.

[18] DUNNE L D，DISKIN M G，SREENAN J M.Embryo and foetal loss in beef heifers between day 14 of gestation and full term[J].Animal Reprod Sci，2000，58（1/2）：39-44.

[19] PAULE S，ALJOFAN M，SIMON C，et al.Cleavage of endometrial α-integrins into their functional forms is mediated by proprotein convertase 5/6[J].Hum Reprod，2012，27（9）：2766-2774.

[20] TEI C，MARUYAMA T，KUJI N，et al.Reduced expression of αvβ3 integrin in the endometrium of unexplained infertility patients with recurrent IVF-ET failures：Improvement by danazol treatment[J].J Assist Reprod Genet，2003，20（1）：13-20.

[21] ZHU J L，ZENG X F，PENG Q，et al.Maternal N-carbamylglutamate supplementation during early pregnancy enhances embryonic survival and development through modulation of the endometrial proteome in gilts[J].J Nutr，2015，145（10）：2212-2220.

[22] OHNUMA K，YOKOO M，ITO K，et al.Study of early pregnancy factor（EPF）in equine（Equus caballus）[J].Am J Reprod Immunol，2000，43（3）：174-179.

[23] TAKAGI M，NISHIMURA K，OGURI N，et al.Measurement of early pregnancy factor activity for monitoring the viability of the equine embryo[J].Theriogenology，1998，50（2）：255-262.

[24] WEGMANN T G，LIN H，GUILBERT L，et al.Bidirectional cytokine interactions in the maternal-fetal relationship：Is successful pregnancy a TH2 phenomenon[J].Immunol Today，1993，14（7）：353-356.

[25] MANJARI P，REDDI S，ALHUSSIEN M，et al.Neutrophil gene dynamics and plasma cytokine levels in dairy cattle during peri-implantation period[J].Vet Immunol Immunopathol，2016，173：44-49.

[26] RAPPOLEE D A，BRENNER C A，SCHULTZ R，et al.Developmental expression of PDGF，TGF-alpha，and TGF-beta genes in preimplantation mouse embryos[J].Science，1988，241（4874）：1823-1825.

[27] WATSON A J，HOGAN A，HAHNEL A，et al.Expression of growth factor ligand and receptor genes in the preimplantation bovine embryo[J].Mol Reprod Dev，1992，31（2）：87-95.

[28] DOR J J JR，WILKINSON J E，GODKIN J D.Ovine endometrial expression of transforming growth factor beta isoforms during the peri-implantation period[J].Biol Reprod，1996，54（5）：1080-1087.

[29] REESE S T，PEREIRA M H C，EDWARDS J L，et al.Pregnancy diagnosis in cattle using pregnancy associated glycoprotein concentration in circulation at day 24 of gestation[J].Theriogenology，2018，106：178-185.

[30] POHLER K G，GEARY T W，JOHNSON C L，et al.Circulating bovine pregnancy associated glycoproteins are associated with late embryonic/fetal survival but not ovulatory follicle size in suckled beef cows[J].J Anim Sci，2013，91（9）：4158-4167.

[31] GREEN J A，PARKS T E，AVALLE M P，et al.The establishment of an ELISA for the detection of pregnancy-associated glycoproteins（PAGs）in the serum of pregnant cows and heifers[J].Theriogenology，2005，63（5）：1481-1503.