梁英琴，徐萬鵬，王紅園，韋秀桂，孫雪梅，周煥芳，張 華，林 軍

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部,南寧 530021）

肝臟是人體的重要器官，具有代謝、解毒和免疫等功能。當(dāng)肝臟受到病毒、酒精和藥物等毒素和外源性物質(zhì)刺激時，可引起肝細(xì)胞損傷，從而觸發(fā)炎癥導(dǎo)致細(xì)胞壞死，構(gòu)成肝臟疾病的重要發(fā)病基礎(chǔ)[1]。肝損傷是一種嚴(yán)重的臨床綜合征，預(yù)后較差，可導(dǎo)致極高的死亡率，嚴(yán)重危害人民群眾的生命健康。脂多糖（LPS）是革蘭陰性細(xì)菌產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素，具有引起巨噬細(xì)胞活化和強(qiáng)致炎作用，是造成肝臟損傷的重要藥物之一。研究表明，LPS 可引起小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥，造成肝臟損害[2]。

肝臟中富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER），ER 是細(xì)胞加工脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和貯存鈣離子的主要場所，也負(fù)責(zé)細(xì)胞外空間中蛋白的合成、修飾和釋放[3]。當(dāng)肝臟受到損傷時，肝細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡遭到破壞，蛋白質(zhì)的正確折疊受阻，未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，從而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）。近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ERS 可能是多種肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制之一，受損的肝細(xì)胞可觸發(fā)ERS 并導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡[4]。因此，尋找減輕或者抑制ERS的有效藥物，對于肝臟疾病的治療具有重要意義。

老鼠簕生物堿A（4-羥基苯并噁唑-2-酮，HBOA）是本課題組從藥用紅樹林植物老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）中提取出的一種活性單體[5]。本課題組前期研究結(jié)果表明，HBOA 具有良好的減輕炎癥、抗肝纖維化的作用[6]，但對于LPS所致小鼠急性肝損傷ERS的作用還不明確。因此，本研究采用LPS建立小鼠急性肝損傷模型，從而評估HBOA對肝損傷所致的EPS的潛在影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑 HBOA 由廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室合成，純度＞98%。LPS（北京索萊寶科技有限公司）；聯(lián)苯雙酯滴丸（北京協(xié)和藥廠）。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、谷胱甘肽（GSH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；增強(qiáng)型BCA蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、C/EBP 同源體蛋白（CHOP）、半胱天冬酶12（Caspase-12）抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）抗體、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）（博士德生物工程有限公司）；二抗（美國LICOR公司）。

1.2 主要儀器 連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國Odyssey LI-COR公司）；MICRO17R小型離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；SWB-20L-1恒溫?fù)u床（美國Major Science 公司）；Olympus BX53 正置熒光顯微鏡；Nanodrop3000 微量核酸蛋白分析儀（美國Thermo Fisher 公司）；MP-300V 電泳儀（美國Major Science 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級健康KM 雄性小鼠，體重18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為：SCXK（桂）2020-0003，使用許可證號為：SYXK（桂）2020-0004。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境控制溫度為（23±2）℃，相對濕度為50%～70%，12 h/12 h光/暗循環(huán)。

1.4 分子對接 先從PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取HBOA的三維分子結(jié)構(gòu)，RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）獲取GRP78、IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)PDB格式。通過Pymol 2.4軟件對各分子進(jìn)行去掉水分子、計(jì)算電荷等操作。其次使用Auto Dock Tools 1.5.6 軟 件將HBOA 和GRP78、IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白結(jié)構(gòu)的PDB 格式文檔均轉(zhuǎn)化為PDBQT 格式后進(jìn)行分子對接。最后通過Pymol 軟件分析對接結(jié)果并進(jìn)行可視化分析，篩選出最優(yōu)對接構(gòu)象。

1.5 動物分組及急性肝損傷模型的建立 將小鼠隨機(jī)分為6 組：正常組、模型組（LPS，10 mg/kg）、聯(lián)苯雙酯陽性藥組（150 mg/kg）及HBOA 高、中、低劑量組（200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg），每組10 只。藥物采用0.6%CMC-Na助溶，正常組和模型組小鼠用溶劑CMC-Na 灌胃，其余各組用相應(yīng)藥液灌胃，1 次/d，連續(xù)灌胃10 d。末次給藥禁食不禁水12 h，除正常組外，其余各組均腹腔注射LPS（10 mg/kg）建立肝損傷模型。

1.6 樣本采集與處理 腹腔注射LPS 6 h 后，乙醚麻醉并頸椎脫臼處死小鼠，取出肝臟并用預(yù)冷的生理鹽水洗凈表面，濾紙吸干表面液體，稱取濕重量。切取每只小鼠的同一位置的肝臟小葉固定于4%多聚甲醛溶液中，剩下的肝臟分為4 份，保存于-80 ℃冰箱中。

1.7 肝臟LDH、GSH含量檢測 將肝臟從-80 ℃冰箱取出，解凍，用預(yù)冷的生理鹽水將其洗滌干凈。用濾紙將黏附在組織上的生理鹽水吸干后，切取適量組織，嚴(yán)格按照試劑盒說明書，對小鼠肝組織中LDH、GSH含量進(jìn)行測定。

1.8 免疫組化法檢測肝組織中IL-1β水平 肝組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，加入檸檬酸修復(fù)液，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，10%山羊血清封閉，滴加一抗IL-1β（1:500），4 ℃條件下孵育過夜；次日加入二抗（1:10 000），37 ℃下孵育0.5 h，隨后滴加DAB 顯色液，蘇木精復(fù)染，封片，置于顯微鏡下觀察、拍照，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒表示蛋白陽性表達(dá)。用Image Pro plus 6.0 軟件分析IL-1β 蛋白表達(dá)量，以平均光密度值表示蛋白的相對定量（平均光密度值=累積光密度值/陽性面積）。

1.9 Western blotting 法檢測肝組織中GRP78、CHOP、Caspase-12、TNF-α 和IL-6 的表達(dá) 采用液氮從小鼠肝組織中提取出蛋白液，BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。按蛋白樣本：SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）=1∶4 的比例將其混勻后，沸水中煮5 min變性。蛋白樣品采用10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離1.5 h，后轉(zhuǎn)膜1.5 h 使蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將PVDF 膜置于TBST 中洗滌3 次，每次5min，然后轉(zhuǎn)移到一抗中4 ℃下孵育過夜：GAPDH（1∶1 000）、GRP78（1∶1 000）、CHOP（1∶800）、Caspase-12（1∶800）、TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）。孵育過夜的膜再用TBST 洗滌3 次后，放于二抗（1:10 000）中室溫孵育1 h，最后再用TBST 洗滌3 次，立即用Odyssey 掃膜儀進(jìn)行掃膜，用Image J2X 軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH 為內(nèi)參，目的蛋白條帶與相應(yīng)內(nèi)參條帶灰度值的比值為蛋白相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分子對接結(jié)果 HBOA 與ERS 標(biāo)志性蛋白GRP78 之間的結(jié)合能為-5.77 kcal/mol，HBOA 可與活性位點(diǎn)附近的GLU-202、ASP-35、THR-230、GLY-229、GLY-228、THR-38 這6 個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到GRP78；HBOA 與TNF-α 之間的結(jié)合能為-5.83 kcal/mol，其可與活性位點(diǎn)附近VAL-150、LEU-93、HIS-15 這3 個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到TNF-α；而HBOA與IL-1β之間的結(jié)合能為-5.48 kcal/mol，其可與活性位點(diǎn)附近LEU-26、LEU-82 這2 個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到IL-1β；HBOA 與IL-6 之間的結(jié)合能為-5.36 kcal/mol，其可與活性位點(diǎn)附近VAL-154、PRO-152、LYS-85 這3 個氨基酸形成氫鍵結(jié)合到IL-6，見圖1。

圖1 HBOA與GRP78、IL-1β、TNF-α、IL-6對接后的最優(yōu)構(gòu)象圖

2.2 HBOA 對小鼠肝組織中LDH、GSH 水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟中LDH含量顯著升高，GSH水平顯著降低（均P＜0.01）；與模型組比較，陽性藥組和HBOA 高、中劑量組中LDH 含量顯著降低（P＜0.01），而陽性藥組和HBOA各劑量組中GSH含量顯著升高（P＜0.01），見表1。

表1 HBOA 對LPS 誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織LDH、GSH水平的影響，n=10

表1 HBOA 對LPS 誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織LDH、GSH水平的影響，n=10

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

2.3 HBOA對急性肝損傷小鼠肝組織中IL-1β蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織中出現(xiàn)大量的棕黃色顆粒，表明IL-1β 蛋白水平明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，HBOA 給藥組棕黃色顆粒顯著減少，表明IL-1β 蛋白表達(dá)水平明顯受到了抑制（P＜0.01），見圖2。2.4 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織TNF-α、IL-6表達(dá)水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，HBOA高、中、低劑量組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見圖3、表2。2.5 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織GRP78、CHOP和Caspase-12蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組肝組織中的GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，HBOA 高、中劑量組均顯著降低小鼠肝組織中GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），見圖4、表3。

圖3 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)的影響

表2 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)的影響，n=3

表2 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)的影響，n=3

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

圖4 HBOA 對急性肝損傷小鼠肝組織GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)的影響

表3 HBOA對急性肝損傷小鼠肝組織GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)的影響，n=3

表3 HBOA對急性肝損傷小鼠肝組織GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)的影響，n=3

與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

3 討論

結(jié)合能反映受體與配體之間結(jié)合的可能性，結(jié)合能的高低能直接反映出受體與配體之間的親和力和構(gòu)象穩(wěn)定性。一般情況下，兩分子間的結(jié)合能小于0 kcal/mol時，視為有效對接。結(jié)合能越低，說明兩個分子在自然狀態(tài)下結(jié)合釋放的能量越低，即更易于結(jié)合。分子對接結(jié)果表明，HBOA與ERS標(biāo)志蛋白GRP78 和炎癥相關(guān)蛋白（TNF-α、IL-1β、IL-6）之間的結(jié)合能均低于-5 kcal/mol，則具有良好的結(jié)合能力。以上提示了當(dāng)炎癥和ERS 發(fā)生時，HBOA 可能通過抑制GRP78、TNF-α、IL-1β、IL-6 的表達(dá)來減輕ERS 和炎癥，但需要實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。

LPS 是革蘭陰性菌外細(xì)胞壁的主要糖脂成分，通常情況下，部分釋放的LPS 被門脈循環(huán)吸收，繼而傳遞到肝臟后被迅速清除。因此，肝臟在LPS進(jìn)入機(jī)體和代謝調(diào)節(jié)過程中起著中心作用。LPS可誘導(dǎo)急性炎癥及一系列生化變化，如細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激增加，線粒體功能障礙，以及器官功能障礙等，與在人體中觀察到的變化高度相似，因此LPS常被用于誘導(dǎo)嚙齒類動物建立急性肝損傷模型[7]。

LDH水平是肝細(xì)胞毒性的一種酶標(biāo)志物[8]。當(dāng)肝細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致LDH 泄漏增加，因此LDH水平高低在一定程度上反映肝臟的受損程度。本研究中，HBOA 高、中劑量可降低LDH水平，說明HBOA可以對抗LPS對肝臟的毒性作用而達(dá)到保肝效果。

抗氧化劑防御系統(tǒng)的損傷是LPS 誘導(dǎo)肝臟損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有研究表明，LPS 對肝臟的損傷以特征組織病變和循環(huán)中抗氧化酶、抗氧化分子水平的變化為特征，如谷胱甘肽(GSH)。GSH 因具有清除自由基和抗氧化的特性，因此被認(rèn)為是一種高效的抗氧化化合物。GSH對于活性氧具有中和作用，在多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)過程中至關(guān)重要。有研究表明，持續(xù)充足的GSH水平可以減輕LPS誘導(dǎo)的肝損傷[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝組織中GSH 含量顯著降低，表明LPS可使小鼠肝臟抗氧化能力降低；與模型組相比，HBOA 各給藥組GSH 含量顯著升高，提示HBOA在一定程度上逆轉(zhuǎn)了LPS對肝臟抗氧化系統(tǒng)的損害。

LPS引起的肝損傷也與炎癥介質(zhì)緊密相關(guān)。據(jù)研究，LPS 可能激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 導(dǎo)致許多炎癥因子的激活,如TNF-α，IL-1β[10]。TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子通過加速肝細(xì)胞凋亡而加重肝損傷，并與肝損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[11]。分子結(jié)果提示HBOA 可能通過與IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白結(jié)合，從而抑制炎癥反應(yīng)。免疫組化結(jié)果顯示，HBOA 預(yù)處理可以降低LPS 誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠肝組織中IL-1β蛋白水平；此外，Western blotting結(jié)果也表明HBOA 可降低模型組小鼠肝組織中TNF-α、IL-6 蛋白表達(dá)水平。提示HBOA 可能通過抑制炎癥反應(yīng)從而對肝臟起到保護(hù)作用。

當(dāng)氧化應(yīng)激、缺氧、細(xì)胞毒性物質(zhì)等不利因素作用于細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)遭受破壞，未折疊或錯誤折疊的蛋白積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，誘發(fā)ERS。ERS介導(dǎo)的凋亡是細(xì)胞內(nèi)源性凋亡途徑之一，有研究表明ERS 在急性肝損傷小鼠模型中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[12]。當(dāng)發(fā)生ERS 時，未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）被激活以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，并降低機(jī)體損傷。適度的ERS 對細(xì)胞具有保護(hù)作用，但是，若應(yīng)激信號嚴(yán)重或延長，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)就會觸發(fā)細(xì)胞死亡途徑[13]。持續(xù)的ERS 會導(dǎo)致UPR 下游的促凋亡分子Caspase-12、CHOP 表達(dá)增加，引發(fā)細(xì)胞凋亡[14]。本實(shí)驗(yàn)中，分子對接結(jié)果表明HBOA與GRP78之間具有較強(qiáng)的結(jié)合力。此外，急性肝損傷小鼠肝組織中GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表達(dá)均上調(diào)，說明肝損傷過程中伴隨著ERS的發(fā)生；而HBOA可以抑制這些蛋白的升高，提示HBOA 可以啟動UPR 反應(yīng)，減少未折疊或錯誤折疊的蛋白在ER 腔內(nèi)累積，從而恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡。

綜上所述，HBOA 對LPS 所致的小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與恢復(fù)肝臟穩(wěn)態(tài)、提高肝臟的抗氧化能力、抑制ERS、減輕炎癥、減少肝細(xì)胞凋亡等相關(guān)。