李冬雪 李昕悅 郭婷 梁社往 趙會(huì)玉 郭春平 何忠俊

摘要：明確三七不同器官中碳、氮、氫、氧同位素的變化規(guī)律，以及年限對(duì)三七碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素的影響，為三七不同器官產(chǎn)地溯源提供理論依據(jù)。利用同位素比率質(zhì)譜儀測定來自云南、廣西44個(gè)3年生和7個(gè)2年生春三七各器官花、莖葉、蘆頭、塊根、筋條、須根中的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O，利用獨(dú)立樣本均值檢驗(yàn)以及Duncans法進(jìn)行多重比較分析。不同年限間，三七各器官δ13C、δ15N、δ2H、δ18O均無差異。不同器官間δ13C、δ2H變化規(guī)律基本一致，均為地下部分極顯著高于地上部分，即δ13C表現(xiàn)為蘆頭、塊根、筋條、須根>花、莖葉（P<0.01）;δ2H表現(xiàn)為蘆頭、塊根、筋條>須根>花、莖葉（P<0.01）;δ15N則表現(xiàn)為花、莖葉>蘆頭、塊根、筋條>須根;δ18O表現(xiàn)為塊根>蘆頭>花、須根（P<0.01）。穩(wěn)定同位素碳、氮、氫、氧在三七不同器官中的分餾效果是不一致的，在進(jìn)行三七產(chǎn)地溯源時(shí)，可以不考慮年限因素。在進(jìn)行三七各器官產(chǎn)地溯源時(shí)，應(yīng)根據(jù)其同位素變化規(guī)律選擇有差異的同位素指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：三七;器官;穩(wěn)定同位素;δ13C;δ15N;δ2H;δ18O;變化規(guī)律

中圖分類號(hào)：S567.23+6.01?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）15-0128-04

收稿日期：2020-12-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81860679）;云南省社會(huì)發(fā)展科技計(jì)劃 （編號(hào)：2010CA027） 。

作者簡介：李冬雪（1996—），女，吉林農(nóng)安人，碩士研究生，主要從事藥用植物設(shè)施栽培研究。E-mail：934793809@qq.com。

通信作者：何忠俊，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物栽培和穩(wěn)定同位素生態(tài)研究。E-mail：hezhongjun15@sina.com。

五加科植物三七（Panax notoginseng）為多年生草本，為我國名貴中藥材，被譽(yù)為“金不換”“南國神草”。三七屬主根系植物，主根發(fā)達(dá)，主根和側(cè)根的界限非常明顯，具有止血、活血化瘀、抗氧化、抗衰老、耐缺氧、降血糖、降膽固醇、改善人體免疫功能等作用，三七的藥理作用影響血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、免疫功能等[1]。近年來，由于三七自身的連作障礙越來越嚴(yán)重和價(jià)格的漲幅增高，三七主產(chǎn)區(qū)已由云南文山發(fā)展到周邊的紅河、昆明、曲靖、大理、騰沖等地區(qū)，其他省份貴州、四川、廣東、廣西的部分地區(qū)也有三七種植[2]。

同位素指紋分析是用于農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源的一項(xiàng)有效技術(shù)。采用穩(wěn)定同位素指紋特征對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的真實(shí)性鑒別和產(chǎn)地溯源已經(jīng)發(fā)展成為保護(hù)地理標(biāo)志特色農(nóng)產(chǎn)品的重要手段，可通過同位素比率質(zhì)譜測定農(nóng)產(chǎn)品中總體或各個(gè)特征組分的穩(wěn)定同位素比值（如δ13C、δ15N、δ2H、δ18O）[3]，從而實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品的真實(shí)性鑒別和產(chǎn)地溯源。生物體中穩(wěn)定性同位素組成與其生長環(huán)境關(guān)系密切，可作為區(qū)分物質(zhì)不同來源的一種“自然指紋”，是物質(zhì)的自然屬性。不同的同位素組成會(huì)因生物代謝類型、氣候、土壤及施肥等因素的影響，其變化規(guī)律存在一定差異[4]。

據(jù)報(bào)道，特別是在傳統(tǒng)的分析方法不能提供明確結(jié)果的情況下，穩(wěn)定同位素分析越來越多地應(yīng)用于確定食品的真實(shí)性和原產(chǎn)地鑒別[5-6]，碳、氮、氧、氫同位素技術(shù)在人參[7]、稻米[8-9]、茶葉[3，10]、牛肉[11]、羊肉[12]、牛奶[13]等產(chǎn)地溯源方面顯示了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。近年來，穩(wěn)定同位素在中藥材的地理來源溯源分析中也開始有應(yīng)用的報(bào)道，如Chung等通過實(shí)例研究，闡明了不同栽培區(qū)域的人參根中C、N、O和S穩(wěn)定同位素比值的變化，并認(rèn)為穩(wěn)定同位素比值分析是鑒別韓國人參產(chǎn)地的一種合適工具，在其他國家也有潛在的應(yīng)用前景[7]。

不同類型植物體內(nèi)同位素組成的影響因子較為復(fù)雜，不僅包括地理環(huán)境和栽培方式影響，還與其自身代謝和分餾作用有關(guān)。目前，中藥材中同位素組成與地理環(huán)境關(guān)系及其變化規(guī)律尚未完全揭示，中藥材不同器官同位素組成關(guān)系也不是十分清楚，應(yīng)選用哪些元素、何種器官作為溯源指標(biāo)對(duì)中藥材產(chǎn)品產(chǎn)地鑒別至關(guān)重要。本試驗(yàn)主要探討不同年限春三七碳、氮、氫、氧同位素的異同，以及三七不同器官間碳、氮、氫、氧同位素的變化規(guī)律，旨在為三七產(chǎn)地的同位素溯源技術(shù)提供理論依據(jù)，推動(dòng)我國中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及安全追溯管理體系的建立與完善。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

2012年9—11月采集3年生春三七共44個(gè)樣點(diǎn)，分別采自廣東南雄、廣西靖西、云南（主要選擇文山州、紅河州以及云南新拓展片區(qū)曲靖、昆明、保山、玉溪）。2年生三七7個(gè)點(diǎn)，主要采自廣西靖西、文山硯山、麻栗坡和昆明石林。所有樣品經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學(xué)何忠俊教授鑒定為五加科人參屬植物三七。

三七植株在樣點(diǎn)地塊采用試劑多點(diǎn)取樣法隨機(jī)采集三七整株15～20株，將活體樣本帶回實(shí)驗(yàn)室處理。首先用加入少許洗潔精的自來水洗去泥土，其次再用含1%檸檬酸的蒸餾水漂洗，最后用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，攤開晾去附著的水分后，按三七各個(gè)器官（花、莖葉、蘆頭、塊根、筋條、須根）分開，105 ℃高溫殺青30 min，再60 ℃烘干，粉碎過100目篩，取約2 g供同位素測定，三七各器官穩(wěn)定同位素測定在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 穩(wěn)定碳、氮同位素測定

稱取600～800 μg三七樣品粉末用錫箔杯包好，先經(jīng)過Flash EA1112型元素分析儀轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2氣體，然后通過氣相色譜柱分離出來，最后進(jìn)入DELTAplus Thermo Finnigan質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測[14]。δ13C以國際標(biāo)準(zhǔn)的V-PDB為基準(zhǔn)，δ15N的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為空氣，計(jì)算公式為：δ13C（δ15N）=（R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)-1）×100%，式中：R分別為 13C/12C、15N/14N?？蓪?shí)現(xiàn)1個(gè)樣品δ13C、δ15N同時(shí)測定。

1.3 穩(wěn)定氫同位素測定

稱取1 mg三七粉末樣品放入銀杯中（8 mm×5 mm），放入96孔酶聯(lián)免疫盤中，蓋上蓋子，在室溫環(huán)境下平衡96 h，然后將樣品取出放入高溫裂解爐的旋轉(zhuǎn)自動(dòng)進(jìn)樣盤中，樣品在1 275 ℃高溫下分解為H2、N2和CO氣體。然后經(jīng)過100 ℃的純化柱，利用孔徑為5 nm的分子篩除去N2和CO氣體，得到純凈的H2，然后進(jìn)入DELTAPlus Thermo Finnigan連續(xù)流動(dòng)的同位素比率質(zhì)譜儀中進(jìn)行測定。載氣He氣流量為100 mL/min，樣品在載氣作用下的流量為50 mL/min[14]。δ2H以平均海洋水為基準(zhǔn)（VSMOW），計(jì)算公式為：δ2H=（R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)-1）×100%，式中：R為 2H/1H。

1.4 穩(wěn)定氧同位素測定

取大約1.0 mg三七粉末樣品放入錫箔杯中，密封，通過自動(dòng)采樣器送入高溫元素分析儀（TC-EA）。樣品在1 430 ℃的高溫下電離的CO氣體，經(jīng)過柱溫為90 ℃的氣相色譜柱，最后進(jìn)入同位素比率質(zhì)譜儀（IRMS）中進(jìn)行測定[14]。δ18O的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為SMOW（標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水），計(jì)算公式為：δ18O=（R樣品/R標(biāo)準(zhǔn)-1）×100%，式中：R為18O/16O。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本均值檢驗(yàn)和Duncans多重比較分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七各器官碳同位素特征

從表1可見，在不同年限（2、3年）間，春三七6個(gè)器官的δ13C值均無顯著差異。2年春七和3年春七δ13C變化規(guī)律一致，均為塊根、筋條較高，莖葉最低。說明種植年限對(duì)春三七碳同位素組成無影響。

忽略種植年限差異，考察不同器官中的δ13C，結(jié)果見圖1。不同器官間，筋條δ13C值最大，平均為 -2.583%，莖葉最小，平均為-2.810%。蘆頭、塊根、筋條、須根間均無顯著差異，花、莖葉間無顯著差異，蘆頭、塊根、筋條、須根極顯著高于花、莖葉（P<0.01）。

2.2 三七各器官氮同位素特征

從表2可以看出，各器官δ15N變幅較大，3年春三七花中的δ15N顯著高于2年春三七（P<0.05），而其他器官間相比， 年際間均無顯著差異。三七不

同器官中δ15N變化規(guī)律（圖2）為：花中δ15N最高，為0.334%，莖葉次之，而須根最低（0.007%），地上部分花和莖葉間差異不顯著，和地下部分蘆頭、塊根、筋條、須根差異極顯著，地下部分蘆頭、塊根、筋條和須根之間存在顯著差異，塊根、筋條和須根之間存在極顯著差異。

2.3 三七中各器官氫同位素特征

由表3可知，花、莖葉、蘆頭、塊根、筋條、須根的δ2H值在種植年限間無顯著差異。由圖3可知，三七不同器官間δ2H值最大為-6.968%，最小為-9.879%，部分器官間達(dá)到極顯著差異（P<0.01），蘆頭、塊根、筋條極顯著高于須根，極顯著高于花、莖葉，蘆頭、塊根、筋條間無顯著差異，花和莖葉間無顯著差異。

2.4 三七中各器官氧同位素特征

由表4可知，春三七各器官不同種植年限間 δ18O 均無顯著差異。從圖4可以看出，以塊根中的δ18O最大，平均為2.20%。以花和須根的δ18O值最低，二者極顯著低于其他器官的δ18O值（P<0.01）。然而， 塊根和莖葉、筋條，蘆頭和莖葉、筋條中的δ18O值無顯著差異。

3 討論與結(jié)論

研究表明，除花δ15N外，不同年際間三七各器官的δ13C、δ15N、δ2H、δ18O沒有顯著差異，后續(xù)三七δ13C、δ15N、δ2H、δ18O穩(wěn)定同位素研究中可以不考慮年際因素。

忽略年限差異，考察不同器官中的δ13C，三七地上部分花、莖葉與地下部分蘆頭、塊根、筋條、須根存在極顯著差異，塊根、筋條>蘆頭、須根>花、莖葉（P<0.01）。洪偉等對(duì)不同品種桉樹（10個(gè)）的葉、枝干和根的δ13C值進(jìn)行研究，結(jié)果表明同種桉樹的葉、枝干、根的δ13C值差異顯著，且依次降低[15]。董星彩等對(duì)五味子生果實(shí)、果梗和葉片進(jìn)行穩(wěn)定碳同位素組成進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，不同器官δ13C值間有顯著差異，表現(xiàn)為果實(shí)>果梗>葉片[16]。影響植物不同器官的δ13C值的差異主要來自2個(gè)方面：

一是植物運(yùn)輸過程中的分餾、不同器官化學(xué)組成成分與生化過程、植物器官形成時(shí)間與發(fā)展階段存在差異;二是不同器官呼吸速率不同，植物器官在呼吸過程中利用了比較多的δ12C物質(zhì)，從而導(dǎo)致δ13C值存在差異[15-16]。

植物對(duì)氮素的吸收征調(diào)能力在不同部位也不盡相同，本研究表明，δ15N以花、莖葉極顯著高于地下部分，地下部分塊根、筋條>蘆頭>須根（P<0.01）。王志鵬等研究發(fā)現(xiàn)，不同組織氮代謝過程與光合過程中對(duì)穩(wěn)定性同位素的代謝存有差異，植物地上部分 δ15N 與地下部分相比高（0.006±0.184）%，表明植物吸收的氮素在莖和葉中的分配比例較高，而在根中的分配比例較小[17]。王紅云等研究發(fā)現(xiàn)，植物不同器官的δ15N存在顯著差異，植物不同器官的δ15N差異沒有統(tǒng)一規(guī)律[18]，Evans總結(jié)認(rèn)為，不同植物器官間存在δ15N差異規(guī)律不同，主要是因?yàn)橹参飳?duì)氮源的利用率不同以及對(duì)氮源的同化模式不相同而造成的[19]。而植物生長過程中的氮再分配以及不同植物器官的氮的同化和氮的損失造成不同器官和物質(zhì)成分間存在差異。除植物自身對(duì)氮的生理代謝過程控制外，土壤類型、有機(jī)質(zhì)含量、肥料類型、前茬施肥、施肥使其乃至灌溉等在很大程度上都影響植物δ15N值[18-19]。

植物組織中的氫、氧穩(wěn)定同位素受到農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)部代謝變化的影響，也與其生長地域的降水同位素特征以及生態(tài)環(huán)境因素密切相關(guān)[20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，δ2H地上部分與地下部分差異極顯著，蘆頭、塊根、筋條>須根>花、莖葉（P<0.01）;不同器官δ18O表現(xiàn)為塊根>蘆頭>花、須根（P<0.01）。龐榮麗等研究總結(jié)，一般而言，在植物生長過程中，進(jìn)入葉片表面水分的蒸騰作用、光合作用過程中發(fā)生的一系列生化反應(yīng)可以導(dǎo)致同位素分餾，而水分在植物本身運(yùn)輸過程中不會(huì)發(fā)生同位素分餾現(xiàn)象[21]。植物穩(wěn)定性氫、氧同位素主要受溫度狀況、降水同位素、植物生理生化過程分餾等因素的影響[21-22]。

除花δ15N外，年限因素不影響三七各器官中碳、氮、氫、氧同位素組成。三七地上部分花、莖葉與地下部分蘆頭、塊根、筋條、須根δ13C、δ15N、δ2H存在極顯著差異，地下部分須根與其他器官蘆頭、塊根、筋條δ15N、δ2H存在極顯著差異;塊根、蘆頭與花、須根之間δ18O存在極顯著差異，其余器官間規(guī)律不明顯。在進(jìn)行三七各器官產(chǎn)地溯源研究時(shí)，應(yīng)根據(jù)其同位素變化規(guī)律選擇有差異的同位素指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]崔秀明，陳中堅(jiān). 三七藥材的道地性研究[M]. 昆明：云南科技出版社，2007.

[2]何忠俊，梁社往，丁 穎，等. 三七主根穩(wěn)定碳同位素組成與生態(tài)因子的關(guān)系[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2015，24（4）：561-568.

[3]劉 志，張永志，周鐵鋒，等. 不同烘干方式對(duì)茶葉中穩(wěn)定同位素特征及其產(chǎn)地溯源的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2018，32（7）：1408-1416.

[4]郭波莉，魏益民，潘家榮. 同位素指紋分析技術(shù)在食品產(chǎn)地溯源中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2007，23（3）：284-289.

[5]彭凱秀，劉 歡，劉 鴿，等. 穩(wěn)定同位素技術(shù)在動(dòng)植物源食品溯源中的應(yīng)用研究[J]. 食品工業(yè)科技，2021，42（8）：338-345.

[6]郭蓮仙，麥展華，趙 行，等. 穩(wěn)定碳同位素技術(shù)在食品摻雜和溯源檢測的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代食品科技，2016，32（3）：281-290.

[7]Chung I M，Kim J K，Lee J H，et al. C/N/O/S stable isotopic and chemometric analyses for determining the geographical origin of Panax ginseng cultivated in Korea[J]. Journal of Ginseng Research，2018，42（4）：485-495.

[8]Chung I M，Kim J K，Lee K J，et al. Geographic authentication of Asian rice （Oryza sativa L.） using multi-elemental and stable isotopic data combined with multivariate analysis[J]. Food Chemistry，2018，240（1）：840-849.

[9]公維民，馬麗娜，王 飛，等. 我國大米碳氮穩(wěn)定同位素比率特征及溯源應(yīng)用[J]. 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2019（4）：9-12，40.

[10]夏 魏，劉 志，邵圣枝，等. 茶葉與產(chǎn)地環(huán)境中穩(wěn)定同位素和礦物元素特征及其相關(guān)性研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2020，34（3）：573-581.

[11]孫豐梅，石光雨，王慧文，等. 牛不同組織中穩(wěn)定性同位素氫、氧、硫組成探討[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，26（8）：1148-1153.

[12]郭 莉，張 寰，王 燕，等. 基于碳、氮穩(wěn)定同位素技術(shù)的羊肉產(chǎn)地溯源可行性研究[J]. 肉類工業(yè)，2020（2）：25-30.

[13]Zhao S S，Zhao Y，Rogers K M，et al. Application of multi-element （C，N，H，O） stable isotope ratio analysis for the traceability of milk samples from China[J]. Food Chemistry，2020，310：125826.

[14]梁社往，何忠俊，熊俊芬，等. 基于穩(wěn)定同位素指紋的春三七主根產(chǎn)地判別研究[J]. 中國中藥雜志，2021，46（3）：560-566.

[15]洪 偉，黃錦湖，李 鍵，等. 不同桉樹品種穩(wěn)定碳同位素研究[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，28（3）：193-197.

[16]董星彩，王顏紅，李國琛，等. 五味子穩(wěn)定碳同位素分布特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2010，29（12）：2353-2357.

[17]王志鵬，楚 彬，周 睿，等. 祁連山東段高寒草甸常見植物穩(wěn)定性同位素特征[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，54（1）：175-183，189.

[18]王紅云，高占鋒，付 才，等. 大棗不同組織氮穩(wěn)定同位素變化規(guī)律研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，30（增刊1）：429-434.

[19]Evans R D. Physiological mechanisms influencing plant nitrogen isotope composition[J]. Trends in Plant Science，2001，6（3）：121-126.

[20]Kim K，Song J H，Heo S C，et al. Discrimination of ginseng cultivation regions using light stable isotope analysis[J]. Forensic Science International，2015，255：43-49.

[21]龐榮麗，王書言，王瑞萍，等. 同位素技術(shù)在水果及制品產(chǎn)地溯源中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2018，35（6）：747-759.

[22]何忠俊，梁社往，丁 穎，等. 三七主根穩(wěn)定氧同位素δ18O與生態(tài)因子關(guān)系的研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2016，30（3）：556-564.