韓凱凱 嚴(yán)若峰 劉青濤 劉宇卓 李銀 趙冬敏 黃欣梅 楊婧

摘要：甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase，MTase）是鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）非結(jié)構(gòu)蛋白5的重要功能基團(tuán)，在病毒復(fù)制及致病過程中發(fā)揮重要作用。為了對(duì)鴨坦布蘇病毒甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行真核表達(dá)，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定，以GenBank中收錄的DTMUV JS804株基因序列為模板，設(shè)計(jì)針對(duì)MTase的特異性引物，提取TMUV RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以其為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到MTase的基因片段，然后亞克隆至pCMV-Flag真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Flag-MTase，提取去除內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，通過間接免疫熒光觀察和Western Blot鑒定該蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，質(zhì)粒pCMV-Flag-MTase經(jīng)雙酶切鑒定證明構(gòu)建正確，通過間接免疫熒光與Western Blot檢測，重組質(zhì)粒在BHK-21細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，表達(dá)的蛋白與天然坦布蘇病毒MTase具有相同的反應(yīng)原性。

關(guān)鍵詞：鴨坦布蘇病毒;甲基轉(zhuǎn)移酶;真核表達(dá)

中圖分類號(hào)：S852.65+7?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）15-0147-03

收稿日期：2020-12-16

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31502101）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（20）3093]。

作者簡介：韓凱凱（1983—），男，河南新鄉(xiāng)人，博士，副研究員，主要從事水禽疫病防控相關(guān)研究。E-mal：hankk0917@126.com。

坦布蘇病毒屬于黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒類的恩塔亞病毒群，是一種具有包膜的單股正鏈RNA病毒，通過節(jié)肢動(dòng)物的叮咬進(jìn)行傳播而導(dǎo)致宿主發(fā)病，主要引起20日齡以內(nèi)的雛鴨出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，死淘率增高及產(chǎn)蛋鴨的產(chǎn)蛋大幅下降[1]。坦布蘇病毒基因組是單股正鏈RNA，含有一個(gè)大型開放閱讀框，可編碼7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）和3種結(jié)構(gòu)蛋白（C、PM和E）[2]。NS5在這幾種蛋白中分子量是最大的，大約100 ku，整個(gè)NS5蛋白具有2個(gè)功能域，分別是N端的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域和C端的RNA依賴的聚合酶結(jié)構(gòu)域。NS5蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶功能基團(tuán)同時(shí)具有N-7和2′-O這2種甲基化功能，可以催化病毒遺傳物質(zhì)RNA的5′端形成一型的RNA帽子[3]，這一帽子結(jié)構(gòu)對(duì)病毒具有重要作用，可以防止病毒遺傳物質(zhì)被宿主細(xì)胞內(nèi)的核酸外切酶降解，輔助病毒完成免疫逃逸。

目前，在黃病毒屬其他病毒，如登革病毒、西尼羅河病毒、黃熱病毒、寨卡病毒上均有甲基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)報(bào)導(dǎo)[4-5]，但在鴨坦布蘇病毒上卻鮮有研究。本研究構(gòu)建了鴨坦布蘇病毒甲基轉(zhuǎn)移酶基因的真核表達(dá)系統(tǒng)，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)MTase重組蛋白，旨在為進(jìn)一步研究其功能、研發(fā)坦布蘇病毒病的診斷、治療方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和載體

坦布蘇病毒分離株（JS804）、BHK-21細(xì)胞株、真核表達(dá)載體pCMV-Flag，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購于TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等，購自寶生物工程（大連）有限公司;體液病毒RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購自Axygen生物科技有限公司;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000，購自Invitrogen公司;FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，購于碧云天公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，購于中杉金橋公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清，購自Gibco公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的坦布蘇病毒JS804株（GenBank登錄號(hào)JF895923） NS5基因序列，設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物，其中上游引物為MTase-F：5′-CAGGGACCCTCGAGATGGGAGGGGGAACT-3′，劃線部分為引入的XhoⅠ酶切位點(diǎn)。下游引物為MTase-R：5′-CCAAGTCTTCCGCGGATTGTCTTGGTCAT-3′，劃線部分為引入的SacⅡ酶切位點(diǎn)。以上引物由南京金斯瑞生物有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為900 bp。

1.4 DTMUV MTase基因的擴(kuò)增

按照Axygen公司體液病毒RNA提取試劑盒要求提取DTMUV JS804株的總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書，合成反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。以cDNA為模板，MTase-F和MTase-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系（25.0 μL體系）：其中雙蒸水15.0 μL，10×Ex PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上、下游引物（25.0 pmol/μL）各1.0 μL，cDNA產(chǎn)物1.5 μL，Ex Taq （5 U/μL） 0.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，30 次循環(huán);72 ℃總延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確后按照瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒操作說明進(jìn)行產(chǎn)物回收純化?；厥盏钠伟凑誴MD19-T載體說明書進(jìn)行連接，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)LB固體培養(yǎng)基37 ℃倒置過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落振蕩培養(yǎng)3 h，并對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確的菌液取500 μL送至南京生工生物科技有限公司進(jìn)一步測序，鑒定正確后按照質(zhì)粒提取試劑盒操作說明提取質(zhì)粒。

1.5 重組質(zhì)粒pCMV-Flag-MTase的構(gòu)建

用XhoⅠ、SacⅡ?qū)χ亟M克隆質(zhì)粒及pCMV-Flag載體雙酶切，電泳切膠回收，將2種酶切后回收的片段按照適宜比例與T4 DNA 連接酶16 ℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于卡那霉素的平板，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定正確的菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用XhoⅠ、SacⅡ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送至南京擎科生物科技有限公司測序，鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pCMV-Flag-MTase。

1.6 BHK-21細(xì)胞的轉(zhuǎn)染

按照質(zhì)粒小量提取試劑盒要求提取pCMV-Flag-MTase，分光光度計(jì)測定其濃度。取處于對(duì)數(shù)生長期的BHK-21細(xì)胞，接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞鋪至細(xì)胞板約90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑操作說明書制備DNA-脂質(zhì)體混合物，其中轉(zhuǎn)染的DNA用量為2.5 μg?；靹蚝笫覝胤跤?0 min，將DNA-脂質(zhì)體混合物均勻鋪到細(xì)胞中。

1.7 間接免疫熒光鑒定

取質(zhì)粒pCMV-Flag-MTase轉(zhuǎn)染24 h后的BHK-21細(xì)胞，PBS洗滌3次，采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min;PBS洗滌3次，每次5 min，采用0.5% triton X-100對(duì)細(xì)胞透化處理10 min;PBS洗滌3次，5 min/次，加入1% BSA，室溫封閉30 min;PBS洗滌3次，5 min/次，然后加入事先制備的坦布蘇病毒陽性小鼠血清（1 ∶1 000），室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，5 min/次，最后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1 ∶400），室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，5 min/次，倒置熒光顯微鏡下觀察，照相記錄。

1.8 Western Blot鑒定

pCMV-Flag及pCMV-Flag-MTase分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，測定蛋白濃度后經(jīng)Western Blot檢測該蛋白的表達(dá)情況。先進(jìn)行SDS-PAGE電泳，再經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，然后以抗坦布蘇病毒陽性小鼠血清體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行反應(yīng)，ECL顯影觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨坦布蘇病毒MTase基因的PCR擴(kuò)增

由圖1可知，以含有鴨坦布蘇病毒JS804株全長基因的cDNA為模板，采用所設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增MTase基因全長，結(jié)果擴(kuò)增的片段大小約為900 bp，與預(yù)期片段大小相符。

2.2 重組質(zhì)粒pCMV-Flag-MTase的PCR和雙酶切鑒定

由圖2可知，菌液PCR結(jié)果顯示，挑取的單克隆均為陽性，可擴(kuò)增得到與MTase大小一致的DNA片段。利用XhoⅠ、SacⅡ?qū)χ亟M質(zhì)粒pCMV-Flag-MTase進(jìn)行雙酶切，結(jié)果顯示出現(xiàn)2條特異性的條帶，一條大小約為4 300 bp，為pCMV-Flag載體條帶，另一條大小為900 bp，與MTase大小一致。測序結(jié)果顯示，MTase基因序列與GenBank發(fā)布的序列同源性達(dá)99%。結(jié)果表明真核質(zhì)粒pCMV-Flag-MTase構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒pCMV-Flag-MTase的轉(zhuǎn)染效果

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000介導(dǎo)pCMV-Flag-MTase轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞，24 h固定間接免疫熒光檢測表達(dá)情況。通過倒置熒光顯微鏡觀察，由圖3可知，正常未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無綠色熒光，而重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞能觀測到綠色熒光，熒光多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)中，表明重組質(zhì)粒pCMV-Flag-MTase能成功轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)染效率未受外源插入蛋白的影響。

2.4 DTMUV MTase在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)

由圖4可知，經(jīng)Western Blot檢驗(yàn)，重組DTMUV MTase蛋白與坦布蘇病毒陽性小鼠血清能發(fā)生特異性結(jié)合，條帶分子量大小約30 ku，表明重組DTMUV MTase蛋白具有免疫反應(yīng)活性。

3 討論

鴨坦布蘇病毒作為黃病毒科、黃病毒屬、恩塔亞病毒群的重要成員，自2010年4月來，該病迅速傳播到我國絕大部分養(yǎng)鴨地區(qū)，不僅給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了很大經(jīng)濟(jì)損失，而且極大地影響和制約了我國養(yǎng)鴨業(yè)乃至畜牧業(yè)的穩(wěn)定健康發(fā)展[2]。因此，除了快速研制針對(duì)性的疫苗外，深入探索坦布蘇病毒致病性、病毒蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能及快速簡便的臨床檢測方法，也成為現(xiàn)階段防控坦布蘇病毒病發(fā)生的重要技術(shù)手段。

NS5蛋白是坦布蘇病毒基因組編碼最大的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)分子量可達(dá)100 ku，是黃病毒中最為保守的蛋白。而坦布蘇病毒NS5蛋白的N端前900 bp為甲基轉(zhuǎn)移酶活性的主要活性區(qū)，同時(shí)具有N-7和2′-O這2種甲基轉(zhuǎn)移酶活性且對(duì)RNA序列有依賴性，參與病毒基因組RNA復(fù)制。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MTase的甲基化位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，其病毒復(fù)制的能力將顯著降低[6]。同時(shí)，MTase蛋白對(duì)宿主抗病毒反應(yīng)也有拮抗作用，西尼羅病毒MTase蛋白的 2′-O甲基化功能區(qū)可以下調(diào)一種干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生蛋白的表達(dá)，進(jìn)而使病毒逃避宿主的天然免疫反應(yīng)，具體作用機(jī)制和生物學(xué)反應(yīng)過程迄今尚不明確[7]。鑒于此，MTase作為DTMUV的主要蛋白酶，與其他非結(jié)構(gòu)蛋白共同作為病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的承載體，負(fù)責(zé)蛋白翻譯后的切割、修飾等重要過程，在DTMUV病毒粒子成熟和復(fù)制過程中承擔(dān)重要角色。又由于MTase在黃病毒屬病毒中具有高度保守的氨基酸序列[7]，因此可以作為研究抗坦布蘇病毒相關(guān)藥物和疫苗的關(guān)鍵靶標(biāo)。目前，關(guān)于坦布蘇病毒MTase蛋白相關(guān)研究較少，本研究通過克隆DTMUV MTase蛋白編碼基因，并成功克隆至pCMV-Flag真核表達(dá)載體，通過間接免疫熒光和Western Blot試驗(yàn)檢測，發(fā)現(xiàn)MTase蛋白表達(dá)成功。本研究獲得的重組坦布蘇病毒MTase蛋白可作為包被抗原，建立ELISA方法來檢測血清中的抗體水平，亦可以用來篩選具備診斷功能/中和活性的單克隆抗體，此外，還為研究坦布蘇病毒的感染致病機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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