謝海呈， 譚清群， 徐 婭， 劉 霞， 楊學(xué)輝*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水稻研究所，貴州 貴陽(yáng) 550009；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550009；3.湄潭縣植保植檢站，貴州 湄潭 564100)

0 引言

【研究意義】由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)侵染引起的水稻紋枯病是水稻產(chǎn)區(qū)的常發(fā)性病害，以往發(fā)生對(duì)產(chǎn)量的影響不大，近年來(lái)隨著高產(chǎn)、矮稈、多蘗品種以及高肥密植栽培技術(shù)的推廣應(yīng)用，該病的危害程度日益加重，危害最高損失可達(dá)50%[1-2]。在我國(guó)部分地區(qū)，其危害已超過(guò)稻瘟病而居首位[3]。該病為土傳病害，病菌長(zhǎng)期存于土壤中，寄主范圍廣，重要寄主作物有水稻、玉米、大麥、高粱、豆類(lèi)、花生等，其在田間的發(fā)病程度與初始菌量相關(guān)[4]。開(kāi)展病原菌遺傳多樣性研究有助于了解病害在田間的流行趨勢(shì)和防控策略的制定。【前人研究進(jìn)展】目前，有關(guān)水稻紋枯病菌遺傳多樣性研究多采用分子標(biāo)記技術(shù)，易潤(rùn)華等[5]采用RAPD標(biāo)記廣東省病菌群體遺傳多樣性在不同水平上的分布；李挺丹等[6]基于ISSR明確了福建不同水稻紋枯病菌群體間存在明顯的遺傳分化且與菌株的地理來(lái)源相關(guān)；王愛(ài)軍等[7-8]采用rDNA-ITS序列對(duì)水稻紋枯病菌進(jìn)行了融合群鑒定、融合群組成與分布等研究；王玲等[2]采用SSR分析了廣東等8個(gè)省水稻紋枯病菌的遺傳多樣性的形成與遺傳分化；朱明海等[9]采用AFLP解析了海南南繁區(qū)核心區(qū)與非核心區(qū)的遺傳變異。水稻紋枯病是影響貴州水稻生產(chǎn)的主要病害之一，近2年田間病株率達(dá)5%～86%，局部重發(fā)或部分田塊全發(fā)病?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)該病的研究主要集中于品種選育和病害防治，對(duì)病原菌群體遺傳結(jié)構(gòu)特征研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用SSR標(biāo)記對(duì)貴州省不同地區(qū)的水稻紋枯病菌進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在揭示病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的組成和群體間的遺傳分化，為水稻紋枯病防控措施的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2018—2019年從貴州省9個(gè)地區(qū)(州、市)26個(gè)縣(區(qū))采集的水稻紋枯病標(biāo)樣277個(gè)，其中黔南州38株，黔東南州27株，黔西南州36株，銅仁地區(qū)41株，畢節(jié)地區(qū)28株，貴陽(yáng)市15株，安順市24株，遵義市30株，六盤(pán)水市38株。

1.2 基因組DNA提取

將經(jīng)過(guò)活化的水稻紋枯病菌的菌絲體接種于裝有50 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL)的三角瓶中，28℃恒溫下180～200 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，收集菌絲提取菌株DNA。采用索萊寶的真菌基因組DNA提取試劑盒(Cat#D2300)，提取步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 SSR-PCR擴(kuò)增

利用11對(duì)SSR熒光標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SSR-PCR反應(yīng)體系為20 μL，含有dNTP 0.4 μL，Buffer 2 μL，前后引物各0.3 μL(20 μmol/L)，DNA模板2 μL，Taq 0.2 μL及ddH2O 14.8 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，65℃到50℃降落復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸3 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳抽檢合格后進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。

1.4 毛細(xì)管電泳檢測(cè)

將甲酰胺與分子量?jī)?nèi)標(biāo)按體積比100∶1的混勻后，取15 μL加入上樣板中，再加入1 μL稀釋10倍的PCR產(chǎn)物，然后使用ABI 3730XL測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。利用Genemarker V2.2.0中的Fragment(Plant)片段分析測(cè)序儀得到的原始數(shù)據(jù)，將各泳道內(nèi)分子量?jī)?nèi)標(biāo)的位置與各樣品峰值的位置比較分析后得到片段大小。

1.5 數(shù)據(jù)處理

每對(duì)引物檢測(cè)1個(gè)等位基因位點(diǎn)，將每個(gè)樣品在各等位基因位點(diǎn)的不同片段用Convert1.31轉(zhuǎn)化成POPGENE能識(shí)別的格式。使用POPGENE32計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’基因多樣性指數(shù)(He)、遺傳分化系數(shù)(Fst)及基因流(Nm)，NTSYS對(duì)Nei’s遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。GenAlEx進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，明確各群體每個(gè)位點(diǎn)的遺傳分化。

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州水稻紋枯病菌群體的SSR位點(diǎn)多樣性

11個(gè)SSR位點(diǎn)均表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)百分率(P)為100%。全部位點(diǎn)在277個(gè)水稻紋枯病菌菌株中共檢測(cè)到92個(gè)等位基因，分子量變異范圍為124～283 bp，圖1所示為毛細(xì)管電泳檢測(cè)的引物RH2對(duì)2個(gè)菌株的擴(kuò)增片段，在225 bp處均有1個(gè)峰值。由表1可見(jiàn)，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為4～14個(gè)，平均8.363 6個(gè)；平均有效等位基因數(shù)為2.277 7個(gè)，變幅為1.115 0～3.552 9；平均Shannon’s信息指數(shù)為1.066 4。

圖1 水稻紋枯病菌在RH2位點(diǎn)上的毛細(xì)管電泳峰型圖

表1 水稻紋枯病菌SSR位點(diǎn)多樣性參數(shù)

2.2 不同地區(qū)水稻紋枯病菌群體的遺傳多樣性

從表2可知，對(duì)于不同地區(qū)來(lái)源的水稻紋枯病菌群體，其遺傳多樣性有一定差異，9個(gè)地區(qū)的水稻紋枯病菌群體中，觀測(cè)的等位基因數(shù)在3.090 9～5.636 4，銅仁群體最高，貴陽(yáng)群體最低；有效等位基因數(shù)為1.864 3～2.611 4，最高和最低群體分別是銅仁和安順；Shannon’s信息指數(shù)最高為銅仁群體(1.102 6)，最低是安順群體(0.762 4)；而Nei’基因多樣性指數(shù)的變幅為0.545 9(銅仁)～0.398 8(畢節(jié))。綜合以上4個(gè)參數(shù)分析，銅仁地區(qū)水稻紋枯病菌群體的遺傳多樣性最為豐富，其次是黔西南州、黔東南州和黔南州，貴陽(yáng)、安順和畢節(jié)群體的相對(duì)較低。

表2 貴州9個(gè)地區(qū)水稻紋枯病菌群體的遺傳多樣性參數(shù)

2.3 不同地區(qū)水稻紋枯病菌群體的分子方差

貴州9個(gè)地區(qū)紋枯病菌群體的分子方差分析顯示(表3)，不同地區(qū)群體間的變異占9%，而地區(qū)內(nèi)菌株間遺傳變異為91%，說(shuō)明省內(nèi)水稻紋枯病菌的遺傳變異主要是由不同群體內(nèi)菌株間差異引起。比較不同地區(qū)來(lái)源水稻紋枯病菌群體的遺傳分化值(表4)，群體間已有遺傳分化，其中，畢節(jié)-安順紋枯病菌群體間的遺傳分化值最大，為0.176，其次是貴陽(yáng)-黔東南(0.174)、畢節(jié)-黔東南(0.171)和安順-黔南(0.170)，較低的群體是六盤(pán)水-遵義(0.028)和六盤(pán)水-畢節(jié)(0.050)，各群體間的遺傳分化均達(dá)顯著差異(P<0.05)。

表3 不同地區(qū)水稻紋枯病菌群體的分子方差分析

表4 貴州9個(gè)地區(qū)水稻紋枯病菌群體的遺傳分化值及概率

2.4 不同地區(qū)水稻紋枯病菌的聚類(lèi)樹(shù)

由圖2可見(jiàn)，從遺傳距離和遺傳相似度分析，貴州9個(gè)地區(qū)的菌株群體間遺傳上均較接近，遺傳相似度的變幅為0.859 5～0.973 2。兩兩群體間遺傳相似度最大(GI=0.973 2)、遺傳距離最小(GD=0.027 1)的群體是遵義與六盤(pán)水的菌株群體，而遺傳相似度最小(GI=0.859 5)、遺傳距離最大(GD=0.154 1)的是貴陽(yáng)與黔東南的菌株群體。在遺傳相似系數(shù)0.91處，9個(gè)水稻紋枯病菌群體可以分為明顯的2個(gè)類(lèi)群，安順、黔東南、黔西南聚為一個(gè)類(lèi)群，其余6個(gè)地區(qū)的菌株群體聚另一類(lèi)群。在第二類(lèi)群中，黔中的貴陽(yáng)、黔北的遵義和黔西北的畢節(jié)與六盤(pán)水聚為亞群一，銅仁和黔南聚為亞群二。

圖2 9個(gè)地區(qū)水稻紋枯病菌群體聚類(lèi)樹(shù)

對(duì)于全部菌株群體(圖3)，在0.58處可將277個(gè)菌株劃分為9類(lèi)群，其中，類(lèi)群1、2包括了大部分菌株(155株、107株)，其余7個(gè)類(lèi)群均為僅含個(gè)別菌株的小類(lèi)群，而兩個(gè)大類(lèi)群又各自聚為不同的亞群。第1類(lèi)群分為2個(gè)亞群，各有19個(gè)、136個(gè)菌株；第2類(lèi)群的2個(gè)亞群各有79個(gè)和28個(gè)菌株。經(jīng)分析菌株其遺傳相似性與地理來(lái)源無(wú)直接關(guān)系?？傮w來(lái)看，以0.37和0.53的遺傳相似系數(shù)，全部群體均是劃分為占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的大類(lèi)群和個(gè)別菌株的小類(lèi)群?？梢?jiàn)，貴州省水稻紋枯病菌存在較為豐富的遺傳多樣性，既有明顯的主體類(lèi)群，又有多樣性各異的小類(lèi)群。

圖3 277株水稻紋枯病菌SSR分子指紋UPGMA聚類(lèi)樹(shù)

3 結(jié)論

貴州近幾年水稻紋枯病的危害趨于嚴(yán)重，但對(duì)其病原菌的遺傳多樣性研究至今未有報(bào)道，加強(qiáng)基于分子標(biāo)記技術(shù)的水稻紋枯病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)特征和變異特點(diǎn)研究，有利于了解病害的發(fā)生流行進(jìn)程并對(duì)病害的防治具有重要的指導(dǎo)作用。研究結(jié)果表明，源于貴州9個(gè)地(州、市)的277個(gè)水稻紋枯病菌菌株在11個(gè)SSR位點(diǎn)上全部為多態(tài)位點(diǎn)，共檢出92個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)8.36個(gè)，平均期望雜合度(He)和Shannon’s信息指數(shù)(I)分別為0.511 2、1.064 6，與王玲等[2]關(guān)于中國(guó)南方八省水稻紋枯病菌群體的同類(lèi)研究(He=0.472，I=0.859)相比，貴州的病菌群體具有較高的遺傳多樣性。

在不同地理來(lái)源上，貴州省不同地區(qū)來(lái)源的水稻紋枯病菌群體遺傳多樣性存在一定差異，黔東南、黔西南、黔南、銅仁等少數(shù)民族地區(qū)紋枯病菌群體的遺傳多樣性明顯高于貴陽(yáng)、安順和遵義等地區(qū)(市)，這是否與少數(shù)民族地區(qū)至今擁有較為豐富的品種類(lèi)型有關(guān)有待進(jìn)一步研究。從分子方差分析結(jié)果來(lái)看，不同地區(qū)的病菌群體存在遺傳分化，但其變異的91%是由不同群體內(nèi)菌株間差異引起，說(shuō)明了貴州水稻紋枯病菌的遺傳分化與其地理來(lái)源關(guān)系不明顯，而與病害發(fā)生地的寄主和環(huán)境生態(tài)有著較大的關(guān)系。

4 結(jié)論

采用SSR熒光標(biāo)記方法對(duì)貴州水稻紋枯病菌遺傳多樣性的分析表明，貴州省內(nèi)水稻紋枯病菌群體具有較為豐富的遺傳多樣性，檢測(cè)的11個(gè)位點(diǎn)均為多態(tài)性位點(diǎn)，共檢測(cè)到92個(gè)等位基因，平均等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)分別為8.363 6、2.277 7、1.064 6和0.510 2。銅仁地區(qū)水稻紋枯病菌群體的遺傳多樣性稍高于其他地區(qū)，不同地區(qū)間病菌群體存在一定的遺傳分化，但其變異主要由群體內(nèi)菌株間差異引起，基于Nei’s遺傳相似系數(shù)將貴州省水稻紋枯病菌劃分為2個(gè)主體類(lèi)群和7個(gè)小類(lèi)群，不同群體的遺傳分化及菌株間的親緣關(guān)系與地理來(lái)源不明顯。