張曉文，呂淵，魯苗苗

（1.商洛學院 健康管理學院，陜西商洛 726000；2.陜西秦嶺健康食品配料及核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)校企聯(lián)合研究中心，陜西商洛 726000）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾病，靜止性震顫、肌肉僵硬、運動緩慢和姿勢反射紊亂為其臨床四大主要癥狀，并伴有精神障礙癥狀，導致認知功能改變，精神狀態(tài)異常[1]。帕金森病發(fā)病的分子機制被認為與線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和凋亡級聯(lián)的激活有關(guān)。在中國，中老年人帕金森患病率高達67%，且每年呈上升趨勢[2]，然而，針對該病的治療目前仍沒有理想方法，因此當前迫切需要探尋有效治療帕金森病的藥物和方法。中國傳統(tǒng)醫(yī)藥被證明可以減輕帕金森病癥狀，對于控制病情發(fā)展，減少治療的多巴胺用量具有一定的效果[3]。香葉木素是一種自豆類和橄欖葉中提取的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗雌激素、抗氧化劑、抗微生物和抗腫瘤等藥理作用[4]。相關(guān)文獻報道香葉木素具有抗細胞凋亡作用，可通過JNK通路誘導MCF-7細胞凋亡[5]，通過活化p38JNK信號通路促進鼻咽癌CNE2細胞凋亡[6]。已有研究表明香葉木素在體外研究中通過靶向α-Syn對帕金森病具有治療潛力[7]。1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenyl pyridinium,MPP+），已被廣泛地用于體內(nèi)或體外建立PD模型[8]。本文旨在研究香葉木素對MPP+誘導損傷的人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞凋亡的影響，為臨床治療帕金森病提供新的思路、方法及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

DHP-9002系恒溫培養(yǎng)箱（上海飛越實驗儀器有限公司）、MoFlo Astrios EQ流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）、MR-96A酶標儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）。

1.2 主要試劑

人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫）、香葉木素（中國食品藥品檢定研究院，化學式：C16H12O6，分子量：300.3， 含量：95.7%， 批號111788-200801）、MPP+（美國Sigma-Aldrich公司，純度≥98%，批號 D048）、Dulbecco's Modified Eagle's Medium培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶和青-鏈霉素（美國Gibco公司，批號分別為12100-046、10082-147、25200-056、15140-122）、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號G020-1-1）、CCK-8試劑盒、辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）、標記山羊抗兔IgG（上海碧云天生物技術(shù)研究所，批號分別為C0037、A0208）、兔抗人α-突觸核蛋白（α-Syn）單克隆抗體（ab6162）、兔抗人cleaved caspase-3單克隆抗體（ab2302）、兔抗人Ki67單克隆抗體（ab15580）、兔抗人STAT3單克隆抗體（ab5073）、兔抗人JAK單克隆抗體（ab47435）和兔抗β-actin單克隆抗體（英國Abcam公司，批號分別為 ab6162、ab2302、ab15580、ab5073、ab47435、ab8227）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基為高糖DMEM，內(nèi)含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素，培養(yǎng)溫度為37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基每2 d更換1次。試驗用細胞為對數(shù)生長期細胞。

1.3.2 MTT檢測細胞活力

96孔板內(nèi)，每空加入細胞100 μL后，再加入香葉木素（0，0.1，0.5，1，2，5，10，20，40，100 μmol·L－1），置于培養(yǎng)箱（溫度37℃，含5% CO2）中持續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔再加入50 μL培養(yǎng)液，孵育4 h后，吸出上清液，再加入DMSO 150 μL/孔，搖勻后在570 nm處檢測各劑量OD值。在前期預(yù)試驗中，當香葉木素劑量≤5 mg·kg－1時，細胞毒性作用不明顯?；诖?，本研究選取最高給藥劑量為5 mg·kg－1， 倍數(shù)遞減劑量確定給藥梯度為5，2.5，1.25 mg·kg－1。

1.3.3 細胞處理與分組

取對數(shù)生長期SH-SY5Y細胞，將細胞隨機分為 5 組：對照組（control）、模型組（MPP+）、香葉木素低劑量組（MPP++0.5）、香葉木素中劑量組（MPP++1）和香葉木素高劑量組（MPP++2）。對照組不作任何處理，MPP+組采用 1 mmol·L－1MPP+處理細胞 24 h，MPP++0.5 組采用 1 mmol·L－1MPP+和0.5 μmol·L－1香葉木素處理細胞 24 h，MPP++1 組采用 1 mmol·L－1MPP+和 1 μmol·L－1香 葉 木 素 處理細胞 24 h，MPP++2 組采用 1 mmol·L－1MPP+和 2 μmol·L－1香葉木素處理細胞 24 h[9]。

1.3.4 CCK-8試劑盒檢測細胞活力

各組細胞處理后，連續(xù)培養(yǎng)SH-SY5Y細胞4 d，每天檢測各組待測細胞的數(shù)量，繪制增殖倍數(shù)曲線。用培養(yǎng)基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用CCK-8溶液將待測細胞調(diào)整為1×106個/mL的細胞懸液，然后在37℃培養(yǎng)4 h，最后在450 nm處檢測吸光度值，計算細胞增殖倍數(shù)。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率

對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞以1×105個/孔的密度接種于6孔板中。37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)24 h后，處理方法同上述步驟1.3.3。收集細胞于1.5 mL EP管中，用預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌 3 次后，以 1000 r·min－1的速率離心5 min，然后棄去上清液，再用50 μL磷脂酰結(jié)合蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）結(jié)合液重懸細胞后，分別加入1 μL（Annexin V-FITC及2 μL碘化丙啶（PI）， 混勻，繼續(xù)避光孵育20 min。各離心管內(nèi)再加入150 μL預(yù)冷的PBS緩沖液，將其混勻后用流式細胞儀進行分析。

1.3.6 Western Blot

將各組細胞接種于6孔板中，每孔細胞加入1 mL RIPA裂解液，分別收集各組細胞，以16000 r·min－1離心 30 min， 再用 BCA 試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。隨后100℃條件煮沸下變性5 min。通過SDS-PAGE凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在4℃條件下加入兔抗人 α-Syn 單克隆抗體（1：1000）、兔抗人cleaved caspase-3單克隆抗體（1：1000）、 兔抗人Ki67單克隆抗體（1：1000）、兔抗人 STAT3單克隆抗體（1：1000）、兔抗人JAK單克隆抗體（1：1000）并孵育過夜，使用TBST清洗3次，每次10 min。在4℃下加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1：2000），孵育1 h后加入發(fā)光液，曝光處理。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對目的蛋白條帶進行灰度分析，計算其與β-actin灰度值的比值，以表示目的蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學分析

本研究所有對比數(shù)據(jù)用SPSS21.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標準差（±s），各組間比較采用方差分析法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 香葉木素不同劑量處理SH-SY5Y細胞24 h細胞活力的變化

采用MTT試劑盒檢測SH-SY5Y細胞活力，香葉木素劑量在 10，40 μmol·L－1下，SH-SY5Y細胞活力極顯著低于 0 μmol·L－1劑量（P＜0.01）。因此選取 0.5，1，2 μmol·L－1劑量香葉木素用于本研究的進一步試驗。香葉木素對SH-SY5Y細胞24 h活力的影響結(jié)果見表1。

表1 香葉木素對SH-SY5Y細胞24h活力的影響

2.2 香葉木素增加細胞活性

采用CCK-8試劑盒檢測各組細胞增殖倍數(shù)。香葉木素對SH-SY5Y細胞增殖活力的影響結(jié)果見表2。與對照組相比較，MPP+組細胞增殖倍數(shù)極顯著降低（P＜0.01）。與MPP+組相比較，MPP++0.5、MPP++1和MPP++2組細胞活性極顯著高于 MPP+組（P＜0.01）。

表2 香葉木素對SH-SY5Y細胞增殖活力的影響

2.3 香葉木素減少MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡

為了檢測香葉木素對MPP+處理的SH-SY5Y細胞凋亡的影響，本研究采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結(jié)果見圖1和表3。與對照組相比較，MPP+組細胞早期凋亡率顯著升高（P＜0.01）。與MPP+組相比較，處理組早期凋亡率依次降低，且極顯著抑制MPP+處理的SH-SY5Y細胞凋亡（P＜0.01）。

圖1 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

表3 香葉木素對SH-SY5Y細胞凋亡率的影響

2.4 香葉木素抑制α-Syn、cleaved caspase-3蛋白表達，促進Ki67蛋白表達

采用 Western Blot檢測 α-Syn、cleaved caspase-3、Ki67蛋白表達水平結(jié)果如圖2和表4所示。與對照組相比較，MPP+組 α-Syn、cleaved caspase-3蛋白水平顯著升高（P＜0.05）。與MPP+組相比較，MPP++0.5、MPP++1 和 MPP++2組α-Syn、cleaved caspase-3蛋白水平顯著低于MPP+組（P＜0.05）；MPP+組 Ki67 蛋白水平顯著低于對照組 （P＜0.05），MPP++0.5、MPP++1 和MPP++2組Ki67蛋白水平顯著高于MPP+組（P＜0.05）。

圖2 Western Blot法檢測 α-Syn,cleaved caspase-3和Ki67蛋白表達水平

表4 α-Syn,cleaved caspase-3及 Ki67蛋白表達的降低情況

2.5 香葉木素激活JAK/STAT3信號通路

采用 Western Blot檢測 JAK、p-JAK、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平，結(jié)果如圖3和表5所示。與對照組相比較，MPP+組p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。與 MPP+組相比較，MPP++0.5、MPP++1、MPP++2組p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3蛋白水平顯著高于 MPP+組（P＜0.05）。

圖3 Western Blot法檢測 JAK、p-JAK、STAT3 和p-STAT3蛋白表達水平

表5 香葉木素對JAK/STAT3信號通路的影響

3 討論與結(jié)論

帕金森病是一種進行性神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為震顫、僵硬、運動遲緩和步態(tài)障礙等形式的運動缺陷，主要歸因于黑質(zhì)致密部中多巴胺能神經(jīng)元的逐漸喪失。因此，帕金森病當前治療的策略主要針對多巴胺系統(tǒng)[10]。多巴胺替代治療，目前在改善多巴胺依賴體征方面非常有效，特別是在疾病早期效果最佳[11]。了解帕金森病的潛在發(fā)病機制是神經(jīng)保護療法發(fā)展的關(guān)鍵，如氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體功能障礙和凋亡性細胞死亡等[12]，針對這些機制的一些藥物已經(jīng)證明在臨床前研究中是有益的，但由于當前治療方式的副作用明顯，仍然需要找到一種藥物或方法能夠成功改變進行性疾病過程的療法。

神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機制非常復(fù)雜，生化途徑中帕金森病存在多種潛在的藥物靶點，因此針對“一種基因，一種藥物，一種疾病”的常規(guī)藥物發(fā)現(xiàn)方法，選取香葉木素作為治療藥物。Gai等[13]研究發(fā)現(xiàn)大補陰丸和牽正散通過促進細胞增殖改善MPP+誘導的帕金森病細胞模型。Ye等[3]研究發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉、黃芪和淫羊藿制作的中藥制劑通過促進MES23.5多巴胺能細胞增殖起保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素高濃度具有抑制SH-SY5Y細胞活力的作用，上調(diào)Ki67蛋白表達，且以劑量依賴的方式促進MPP+誘導的帕金森病細胞模型細胞增殖。

凋亡是一種細胞的程序性死亡過程，其在正常成年組織的早期發(fā)育及生長中發(fā)揮著重要的作用。凋亡是中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育過程中一種普遍存在的現(xiàn)象。然而，成年人大腦神經(jīng)元的存活對其整個生命周期的正常功能更為重要。在帕金森病中，許多患者會出現(xiàn)神經(jīng)元過度丟失或神經(jīng)元死亡，所以，抑制神經(jīng)元細胞凋亡是治療帕金森病的有效方式。Zhao等[14]研究發(fā)現(xiàn)松果菊苷通過ROS/ATF3/CHOP途徑調(diào)節(jié)保護SH-SY5Y細胞免受MPP+誘導的凋亡對帕金森病具有治療作用。Gong等[15]研究鳶尾黃素酮可減弱MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡，表明其對帕金森病有一定抑制作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，香葉木素下調(diào)cleaved caspase-3蛋白表達，抑制MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡。

α-Syn是由SNCA基因編碼的14kDa天然未折疊蛋白，在脊椎動物物種中高度保守，并且小蛋白在大腦以及多個其他中央和外周組織中大量表達[16]。α-Syn是帕金森病的診斷標志物，α-Syn基因中的6個錯義突變與帕金森病的發(fā)病機制有關(guān)， 包括 A30P、A53T、E46K、H50Q、G51D和A53E。這些突變體同種型的表達顯著增加MPP+誘導的細胞毒性，說明α-Syn是帕金森病發(fā)病機制的核心參與者[17]。因此，減少α-Syn的形成或清除α-Syn是帕金森病治療的合理策略。Liu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，天麻鉤藤飲通過降低α-Syn表達在帕金森病模型中具有神經(jīng)保護作用。Hu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，地骨皮甲素降低α-Syn表達對帕金森病具有神經(jīng)保護治療作用。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，香葉木素可下調(diào)α-Syn蛋白表達。

JAK/STAT通路是大多數(shù)細胞傳導細胞因子刺激信號的基本途徑，與細胞增殖及凋亡密切相關(guān)[20]。JAK/STAT通路也是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中神經(jīng)細胞存活的重要蛋白通路，可作為中醫(yī)藥治療帕金森病的重要切入點[21]。馬一聞等[22]研究發(fā)現(xiàn)通過抑制JAK-STATs信號通路中p-STAT1和p-STAT3的激活抑制MPP+誘導的PC12細胞炎性因子的釋放。本研究發(fā)現(xiàn)，香葉木素下調(diào)MPP+誘導損傷的SH-SY5Y細胞p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3蛋白表達，從而激活JAK/STAT3通路。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了香葉木素對MPP+損傷的人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞的影響，香葉木素可以抑制細胞活力，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，下調(diào) α-Syn、cleaved caspase-3蛋白表達，上調(diào)Ki67蛋白表達，下調(diào)p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3蛋白表達。在一定的劑量范圍內(nèi)，隨著香葉木素濃度增加，其對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞凋亡的保護作用顯著增加。這種影響可能是通過激活JAK/STAT3通路實現(xiàn)的，香葉木素治療帕金森病有較大的潛力。