武麗霞 韓麗 趙宜婷 周璇 杜云龍

摘 要：生長素輸出載體在植物發(fā)育中起非常重要的作用。然而，生長素輸出載體蛋白PIN1在農(nóng)作物水稻、小麥、玉米和大豆的根和胚中的亞細胞定位尚不清楚。該研究首先分析了OsPIN1b和它的同源物的氨基酸序列特征，發(fā)現(xiàn)小麥（TaPIN1）、玉米（ZmPIN1b）和大豆 （GmPIN1b）中的PIN1序列與水稻的OsPIN1b序列分別具有61.5%、62.5%、61.9%的相似性。然后根據(jù)水稻‘日本晴（‘Nipponbare）的OsPIN1b的氨基酸序列，人工合成OsPIN1b多肽并注射健康的新西蘭白兔獲得了抗兔的OsPIN1b多克隆抗體，在通過免疫印跡方法檢測抗兔的OsPIN1b多克隆抗體的有效性后，發(fā)現(xiàn)可以利用該抗體有效檢測到水稻葉片及根中OsPIN1b的表達。為檢測OsPIN1及其同源物在不同作物胚根和胚中子葉細胞的定位，利用制備的抗兔的OsPIN1b多克隆抗體并通過免疫組化實驗，發(fā)現(xiàn)水稻的OsPIN1b、小麥的TaPIN1和玉米的ZmPIN1b非極性定位在早期的胚根和胚中子葉表皮細胞的細胞質(zhì)膜上，大豆中的GmPIN1b非極性定位在胚根表皮細胞的質(zhì)膜上，而在胚的子葉細胞中是胞質(zhì)定位。為進一步檢測水稻中OsPIN1b的亞細胞定位，對水稻根分生區(qū)表皮細胞用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑BFA （Brefeldin A）及抗兔的OsPIN1b多克隆抗體處理后，進行免疫組化實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻中的OsPIN1b可以通過胞吞轉(zhuǎn)運途徑從水稻根表皮細胞膜進入細胞質(zhì)中。該研究利用抗兔的OsPIN1b多克隆抗體有效檢測了OsPIN1b及其同源物在水稻、小麥、玉米和大豆的胚根表皮細胞及胚中子葉表皮細胞的亞細胞定位，這將有助于進一步揭示生長素輸出載體OsPIN1b及其同源物通過調(diào)控生長素極性運輸而參與作物發(fā)育的作用機制。

關(guān)鍵詞：生長素輸出載體，PIN1，水稻，小麥，玉米，大豆

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）08-1219-07

Abstract： Auxin efflux carrier plays an extremely important role in plant development. However， the subcellular localization of auxin efflux carrier PIN1 in the roots and embryos of crops rice， wheat， maize and soybean remains unclear. In this study， the characterization of OsPIN1b and its homologous amino acid sequence were analyzed， and it showed that the PIN1 sequences of wheat （TaPIN1）， maize （ZmPIN1b） and soybean （GmPIN1b） shared 61.5%， 62.5% and 61.9% similarities with rice OsPIN1b， respectively. Next， an artificial OsPIN1b polypeptide was synthesized based on the OsPIN1b amino acid sequence of rice ‘Nipponbare and injected it into healthy New Zealand white rabbits to obtain anti-rabbit OsPIN1b polyclonal antibody. The effectiveness of the prepared polyclonal antibody against OsPIN1b was detected by immune blot method， and the expression of OsPIN1b was found to be effectively detected in rice leaves and roots. Furthermore， the subcellular localization of OsPIN1b and its homologous in primary roots and cotyledon cells of embryos in different crops was detected with anti-rabbit OsPIN1b polyclonal antibody by immunohistochemistry assay. The results showed that rice OsPIN1b， wheat TaPIN1 and maize ZmPIN1b apolarly localized on the plasma membrane of epidermal cells of primary roots and cotyledon of embryo in rice， wheat and maize grown in early development stages， and soybean GmPIN1b apolarly localized on the plasma membrane of primary root epidermal cells， but was cytosolic localization in the cotyledon cells of embryo. To further detect the subcellular localization of OsPIN1b， epidermal cells of rice primary root meristem region were treated with protein transport inhibitors BFA （Brefeldin A） and anti-rabbit OsPIN1b polyclonal antibody and detected by immunohistochemistry assay. It showed that OsPIN1b localized on cytoplasma membrane of rice root epidermal cells could enter into the cytoplasm via endocytic trafficking manner. In this study， the subcellular localization of OsPIN1b and its homologous in the epidermal cells of primary roots and cotyledons of embryos of rice， wheat， maize and soybean were effectively detected with the anti-rabbit OsPIN1b polyclonal antibody， and it will facilitate us to reveal the molecular mechanism of auxin efflux carrier OsPIN1b and its homologous by regulating polar auxin transport to involve in crops development.

Key words： auxin efflux carrier，PIN1，rice，wheat，maize，soybean

生長素輸出載體蛋白在調(diào)節(jié)植物生長素極性運輸中起重要作用。生長素極性運輸參與胚胎形態(tài)發(fā)生（Blilou et al.， 2005）和側(cè)生器官的形成（Casimiro et al.， 2001）。擬南芥基因組中的PIN基因家族編碼PIN1-8的8種生長素輸出載體蛋白（Friml et al.， 2003; Benjamins & Scheres， 2008）。PIN蛋白可以通過內(nèi)吞作用轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，并形成循環(huán)小泡返回質(zhì)膜（Geldner et al.， 2001）。 Atpin1 突變體植株表現(xiàn)出針狀花序并且花和維管組織發(fā)育表現(xiàn)明顯缺陷（Glweiler et al.， 1998）。AtPIN1的極性定位還影響胚胎的發(fā)育（Friml et al.， 2003）。AtPIN1分布于維管組織（Glweiler et al.， 1998）、木質(zhì)部薄壁組織（Glweiler et al.， 1998; Palme & Glweiler， 1999）、根表皮和皮層細胞（Blilou et al.， 2005）、分生組織表皮和原基表皮 （Guenot et al.， 2012）的細胞質(zhì)中。但是，目前人們對單子葉植物和雙子葉植物之間PIN1蛋白的亞細胞定位差異仍不清楚。

AtPIN1的同源基因可以存在于水稻（Xu et al.， 2005; Li et al.， 2019）、小麥（Singh et al.， 2018）、玉米（Gallavotti et al.， 2008）和大豆（Wang et al.， 2015）的基因組中。在水稻的維管組織和根原基中可以檢測到OsPIN1的表達（Xu et al.， 2005），OsPIN1以生長素依賴性的方式參與水稻根、莖、花序和分蘗的發(fā)育（Xu et al.， 2005; Li et al.， 2019）。ZmPIN1a主要定位在玉米幼苗的上葉原基（Gallavotti et al.， 2008）、根中的中柱鞘細胞和內(nèi)皮層細胞（Carraro et al.， 2006）、胚芽鞘（Kamada et al.， 2018）和葉片（Moon et al.， 2013）的表層細胞。此外，ZmPIN1a在根冠細胞中顯示為胞質(zhì)定位（Forestan et al.， 2012），在花序初生原基細胞中顯示為非極性定位 （Skirpan et al.， 2009）。但是，目前尚不清楚PIN1在不同作物的根和胚中的亞細胞定位，包括水稻、小麥、玉米和大豆。

在這項研究中，我們基于水稻‘日本晴（‘Nipponbare）的OsPIN1b氨基酸序列，制備了抗兔的OsPIN1b多克隆抗體，利用該抗體開展的免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)水稻的OsPIN1b及小麥和玉米中的同源蛋白可以非極性定位在根和胚中子葉表皮細胞的細胞質(zhì)膜上，而大豆的GmPIN1b可以非極性地定位在根中表皮細胞的質(zhì)膜上，但是，在胚的子葉表皮細胞中是細胞質(zhì)定位。此外，水稻根表皮細胞質(zhì)膜上的OsPIN1b可以通過內(nèi)吞運輸途徑進入到細胞質(zhì)中。這些PIN1定位結(jié)果將有助于我們研究生長素極性運輸在水稻、小麥、玉米和大豆作物發(fā)育中的作用。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料為水稻品種‘Nipponbare和‘麗江新團黑谷（‘LTH）（Oryza sativa subsp. japonica）、小麥（Triticum aestivum ‘Chuanmai107）、玉米（Zea mays ‘B73）和大豆（Glycine max ‘Williams），各作物種子置于28 ℃條件下水培萌發(fā)，使用生長了7 d的胚根分生區(qū)細胞和1 d的子葉胚來檢測OsPIN1b及同源物的亞細胞定位。

1.2 抗體的制備和檢測

根據(jù)水稻‘Nipponbare的生長素輸出載體OsPIN1b（Os02g0743400）的氨基酸序列人工合成多肽QSSRNPTPRGSSFNC，并將其注入新西蘭兔體內(nèi)。通過ELISA方法檢測到純化的抗兔OsPIN1b多克隆抗體，其濃度為0.51 mg·mL-1（1∶20 000）（杭州華安生物技術(shù)有限公司）。

1.3 免疫雜交和免疫組化檢測

為檢測OsPIN1b的表達，提取了水稻葉片和根的總蛋白，并用一抗[抗兔的OsPIN1b多克隆抗體（1∶200）]和二抗[山羊抗兔的IgG-HRP（1∶5 000）]進行了免疫雜交。為了檢測蛋白亞細胞定位，使用或不使用50 mmol·L-1 Brefeldin A（BFA）（molecular probes）對不同農(nóng)作物的根和胚處理90 min，然后使用改良的免疫組織化學(xué)分析方法進行檢測（Paciorek et al.， 2006）。具體如下：首先，將樣品在25 ℃室溫條件下用4%戊二醛溶液固定1 h;然后，37 ℃條件下用2%崩潰酶處理1 h;最后，用抗兔的OsPIN1b多克隆抗體（1∶200）和二抗[驢抗兔的IgG（H+L）-Alexafluor 488抗體（1∶500）]（Jackson ImmunoResearch）進行免疫組化檢測。使用Leica SP5激光共聚焦顯微鏡（Leica Microsystems）觀察OsPIN1b的定位。

1.4 生物信息學(xué)分析

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得OsPIN1b及其同源蛋白的氨基酸序列，通過在線網(wǎng)站（https：//www.uniprot.org/）分析OsPIN1b的跨膜結(jié)構(gòu)域，使用軟件Vector NTI Suite 6進行氨基酸序列比對，所有圖片均使用Photoshop軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同作物的PIN1序列相似性分析

為了檢測不同作物中生長素輸出載體蛋白PIN1的亞細胞定位，首先，我們對擬南芥（AtPIN1）、水稻（OsPIN1b）、小麥（TaPIN1）、玉米（ZmPIN1b）和大豆（GmPIN1b）中PIN1的氨基酸序列進行比對分析（圖1）。結(jié)果表明：AtPIN1、TaPIN1、ZmPIN1b、GmPIN1b的序列與OsPIN1b分別具有58.6%、61.5%、62.5%、61.9%的相似性，在OsPIN1b的氨基酸序列中存在10個跨膜區(qū)。

2.2 水稻中OsPIN1b的檢測

PIN1序列在水稻、小麥、玉米和大豆之間顯示出高度相似性（圖1）。我們選擇OsPIN1b中的序列QSSRNPTPRGSSFNC，通過人工合成多肽免疫兔子制備了抗兔的OsPIN1b多克隆抗體。為檢測抗兔的OsPIN1b多克隆抗體的有效性，我們提取了水稻葉片和根的總蛋白，并使用抗兔的OsPIN1b多克隆抗體進行免疫雜交檢測。結(jié)果表明，用OsPIN1b抗體可以檢測到目標蛋白OsPIN1b（圖2）。

2.3 PIN1在不同農(nóng)作物中的亞細胞定位通過免疫組織化學(xué)分析進一步檢測了水稻、小麥、 玉米和大豆根中PIN1的亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)PIN1雖然可定位于根表皮細胞的細胞質(zhì)膜上，但沒有明顯的極性分布（圖3：A-D）。在檢測PIN1在胚細胞中的定位時，發(fā)現(xiàn)PIN1雖然可分布在水稻（圖3：E）、小麥（圖3：F）和玉米（圖3：G）胚中子葉表皮細胞的細胞質(zhì)膜上，但沒有明顯的極性分布。大豆中的GmPIN1b非極性分布在根表皮細胞的細胞質(zhì)膜上，而在胚的子葉表皮細胞中則分布于細胞質(zhì)中（圖3：H）。

2.4 水稻中OsPIN1b的胞吞檢測

由于OsPIN1b蛋白定位于細胞質(zhì)膜上（圖3：A，E），因此，我們進一步檢測了OsPIN1b是否可以通過胞吞的方式從細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運入細胞質(zhì)。用蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑BFA處理水稻‘Nipponbare和‘LTH的根尖，用抗兔的OsPIN1b多克隆抗體開展免疫組織化學(xué)實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在細胞質(zhì)中可以檢測到OsPIN1b蛋白的聚集（圖4）。這表明OsPIN1b可以通過胞吞途徑從細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中。

3 討論與結(jié)論

生長素輸出載體蛋白PIN家族在植物發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。在這項研究中，我們利用抗兔的OsPIN1b多克隆抗體有效檢測了水稻、小麥、玉米和大豆的胚根分生區(qū)表皮細胞及胚中子葉表皮細胞的OsPIN1及其同源物的亞細胞定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsPIN1b及其同源物分布在水稻、小麥、玉米和大豆的根和胚中子葉表皮細胞的細胞質(zhì)膜及細胞質(zhì)中。不同作物中的相同細胞定位表明PIN1在不同植物發(fā)育中，其調(diào)節(jié)生長素分布功能是保守的。此外，我們也注意到與擬南芥AtPIN1的極性定位相比（Friml et al.， 2003），在不同農(nóng)作物的根表皮細胞中，OsPIN1及其同源物的定位是非極性的。OsPIN1b的氨基酸序列與AtPIN1具有58.6%的相似性，因此，不同作物和擬南芥AtPIN1蛋白的亞細胞定位模式存在的差異可能與不同植物中PIN1蛋白結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。玉米中的ZmPIN1a在不同玉米組織中的定位存在極性定位（Carraro et al.， 2006; Gallavotti et al.， 2008; Moon et al.， 2013; Kamada et al.， 2018）、非極性定位 （Skirpan et al.， 2009）和胞質(zhì)定位 （Forestan et al.， 2012），一些研究也發(fā)現(xiàn)AtPIN1的極性分布與胚發(fā)育中的生長素動態(tài)相關(guān)（Friml et al.， 2003）。在本研究中，用于OsPIN1b及其同源物細胞定位觀察的胚根及子葉胚都處于植物發(fā)育的早期階段，這表明不同作物中PIN1的定位還與作物組織發(fā)育階段有關(guān)。此外，利用抗兔的OsPIN1b多克隆抗體可以檢測到OsPIN1b蛋白。進一步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsPIN1b與OsPIN1a氨基酸序列相似性為62.4%，OsPIN1a、OsPIN1b蛋白分子量分別為64.7、59.3 kD，且OsPIN1a氨基酸序列中含有用于制備抗兔的OsPIN1b多克隆抗體的序列QSSRNPTPRGSSFNC。因此，不能完全排除所檢測到的蛋白條帶中含有OsPIN1a，而這也可能部分解釋了我們在根表皮細胞中所觀察到的OsPIN1b及其同源物的非極性定位。

PIN蛋白由于胞吞作用而產(chǎn)生的細胞定位的改變可影響生長素的極性運輸，從而進一步調(diào)控器官形成（Kleine-Vehn et al.， 2008）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsPIN1b可以通過胞吞途徑進入到細胞質(zhì)中。這顯示由于細胞的胞吞作用，OsPIN1b及其同源物的細胞質(zhì)膜及細胞質(zhì)定位可能會發(fā)生變化，并參與調(diào)控植物內(nèi)生長素的分布。PIN蛋白的細胞定位可受到其他物質(zhì)如水楊酸的調(diào)控（Du et al.， 2013）。但是，我們觀察到OsPIN1b的定位可由自身胞吞作用而改變，因此，不同作物中PIN1蛋白的亞細胞定位是一個動態(tài)的過程。

不同作物中OsPIN1b及其同源物可非極性定位于細胞質(zhì)膜及細胞質(zhì)中，這是一個動態(tài)的分布過程，并與植物所處的發(fā)育階段密切相關(guān)。OsPIN1b及其同源物的亞細胞定位將有助于揭示生長素輸出載體通過影響生長素極性分布而參與調(diào)控農(nóng)作物中根和胚發(fā)育的分子機制。

登錄號 文章中相關(guān)蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫中的登錄號分別為AtPIN1 （NP_177500.1）、OsPIN1b （XP_015616014.1）、TaPIN1 （AAS19858.1）、ZmPIN1b （ABH09243.1）、GmPIN1b （NP_001237546.2）。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）