楊秀玲

（河南省延津縣人民醫(yī)院病理科，河南 新鄉(xiāng) 453200）

尖銳濕疣（Condyloma acuminatum,CA）作為常見性傳播疾病，多發(fā)于青年群體，其患病率約為0.5%～1%，具有復(fù)發(fā)率高等特點[1]。相關(guān)研究表明，β連環(huán)素（β-catenin）作為環(huán)連蛋白家族成員，亦為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)核心蛋白，參與病理進(jìn)展及分化，改變細(xì)胞周期變化[2]。核因子κB（NF-κB）作為基因多向性核轉(zhuǎn)錄因子，通過參與多種基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，誘導(dǎo)其在惡性腫瘤中呈異常表達(dá)，進(jìn)而參與CA病理進(jìn)展。近年相關(guān)研究證實β-catenin、NF-κB在多種腫瘤中均存在表達(dá)異常現(xiàn)象，但其表達(dá)水平與CA關(guān)聯(lián)性研究較少[3-4]?；诖?，本研究探討β-catenin、NF-κB在CA患者角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力中的關(guān)聯(lián)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院收治的CA患者92例（2019年1月至2021年1月）作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《尖銳濕疣治療專家共識（2017）》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn)；肉眼可見菜花樣、雞冠樣贅生物；疣狀增生物多出現(xiàn)于肛門、肛周、會陰、生殖器等部位；無局部皮膚?。淮姿岚自囼炾栃?。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他帶狀皰疹感染類疾??；代謝性疾病；其他類型性病；精神疾病。

按照感染類型分為高危組（n=41）與低危組（n=51）。高危組男26例，女15例；年齡（25～62）歲，平均年齡（43.68±9.11）歲；病程（2～12）年，平均病程（7.06±2.43）年。低危組男31例，女20例；年齡（24～64）歲，平均年齡（44.10±9.92）歲；病程（1～10）個月，平均病程（5.54±2.20）個月。同時選取同期于我院檢查的112例健康體檢者作為健康體檢組，其中男65例，女47例，年齡（23～63）歲，平均年齡（43.24±9.88）歲，三組基線資料均衡可比（P＞0.05）。

1.2 方法 ① 檢測方法：取CA患者皮損組織、健康體檢組正常包皮、宮頸組織，使用石蠟包埋，制備切片，經(jīng)脫蠟、水化處理后使用pH值7.4磷酸鹽緩沖液沖洗，修復(fù)抗原，使用過氧化物酶阻斷溶液，將標(biāo)本方式于室溫下孵育，10min后加入第一抗體，室溫孵育過夜，后加之第二抗體，放置于室溫下孵育，10min后加入50g鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，繼續(xù)放置于室溫下孵育，10min后加入DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片，使用400倍顯微鏡，觀察標(biāo)本染色情況，選取5個視野，計算100個細(xì)胞。② 角質(zhì)形成細(xì)胞分離與培養(yǎng)：取CA患者皮損組織、健康體檢組正常包皮、宮頸組織，使用PBS溶液浸泡10min，后使用PBS溶液洗滌3次，后將上述組織剪為小塊，再次使用PBS溶液洗滌2次，加入Dispase酶，于4℃冰箱中放置8h，吸出酶液使用PBS溶液洗滌2次，加入混合消化液，37℃環(huán)境中放置5min，使用胰酶抑制劑終止反應(yīng)，吹打為單細(xì)胞懸液，離心5min，棄上清液，重懸細(xì)胞，接種至培養(yǎng)板中，細(xì)胞長至70%～80%傳代，細(xì)胞放置于-196℃液氮中保存，經(jīng)免疫組化染色，倒置于顯微鏡下，溶細(xì)胞呈現(xiàn)為鋪路石狀，則鑒定為角質(zhì)形成細(xì)胞。③ 標(biāo)本陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：染色強度評分：0分（無染色）、1分（淡黃色）、2分（黃色）、3分（棕褐色）。陽性細(xì)胞百分比評分：0分（陽性細(xì)胞百分比＜5%）、1分（陽性細(xì)胞百分比為5%～25%）、2分（陽性細(xì)胞百分比為26%～50%）、3分（陽性細(xì)胞百分比為51%～75%）、4分（陽性細(xì)胞百分比＞75%）。根據(jù)上述兩項評分，將得分相加，≤2分為陰性，＞2分為陽性。④ 角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力：使用四唑鹽（MTT）比色法，將原代角質(zhì)形成細(xì)胞制為懸液，接種至96孔板中，200μg/孔，3孔/組，孵育48h，后于孔內(nèi)加入MTT溶液，繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，最后放入二甲基亞砜終止反應(yīng)，搖晃均勻后，檢測波長570mm處吸光度值。

1.3 觀察指標(biāo) ① 三組β-catenin、NF-κB表達(dá)情況。② 角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力。③ β-catenin、NF-κB與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力的關(guān)聯(lián)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以（±s）表示，t檢驗，多重比較采用LSD-t檢驗，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，計數(shù)資料以（n，%）表示，X2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin、NF-κB表達(dá)情況 高危組、低危組β-catenin、NF-κB陽性率均高于健康體檢組（P＜0.05），見表1。

表1 β-catenin、NF-κB表達(dá)情況（n，%）

2.2 角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力 伴隨時間延長，高危組、低危組角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力呈升高趨勢（P＜0.05），見表2。

表2 角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力（±s）

表2 角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力（±s）

組別 例數(shù) 光密度值24h 48 h 72h 96h高危組 41 0.40±0.03 0.42±0.05 0.43±0.03 0.48±0.10低危組 51 0.40±0.05 0.41±0.04 0.42±0.04 0.44±0.06健康體檢組 112 0.38±0.04 0.38±0.03 0.41±0.03 0.42±0.05 F 5.997 22.348 5.972 12.732 P 0.003 ＜0.001 0.003 ＜0.001

2.3 β-catenin、NF-κB與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力的關(guān)聯(lián)性 經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，β-catenin、NF-κB與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān)（r1=0.472，P＜0.001；r2=0.627，P＜0.001）。

3 討論

CA多因HPV感染，誘發(fā)肛周及生殖器部分出現(xiàn)增生性病變，其發(fā)病率高居我國性傳播疾病第3位，僅次于非淋菌性尿道炎、淋病。目前臨床治療CA方法較多，但因復(fù)發(fā)率高居不下，嚴(yán)重影響患者生活及心理健康。鑒于目前臨床對β連環(huán)素、核因子κB表達(dá)水平與尖銳濕疣患者角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力的關(guān)聯(lián)性分析研究較少，本研究通過研究β-catenin、NF-κB表達(dá)水平及CA患者角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力，觀察其表達(dá)情況、增殖趨勢變化，以期為CA臨床診治及預(yù)防提供科學(xué)參考依據(jù)。

HPV最初感染時為角質(zhì)形成細(xì)胞，伴隨機體內(nèi)病毒DNA呈低水平時，逐步建立，形成穩(wěn)定病毒基因組織，而后即可進(jìn)入病毒周期生產(chǎn)階段，進(jìn)而影響其他免疫細(xì)胞、炎癥反應(yīng)、網(wǎng)絡(luò)通路等[6]。臨床認(rèn)為，表皮細(xì)胞過度增殖，可促使真皮毛細(xì)血管增多，擴張管腔，誘發(fā)癌變。其中β-catenin作為新原癌基因產(chǎn)物，可通過結(jié)合多種蛋白質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與分化，在不同類型細(xì)胞復(fù)合體內(nèi)發(fā)揮不同生物學(xué)功能，并可通過平衡酪氨酸激酶與磷酸酯酶活性，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞遷移及黏附[7-8]。另外，β-catenin作為Wnt信號通路中關(guān)鍵組成部分，可通過影響細(xì)胞遷移與黏附，調(diào)整靶基因轉(zhuǎn)錄，王云帆學(xué)者[9]認(rèn)為，β-catenin蛋白表達(dá)水平與癌癥患者病理分級存在直接關(guān)聯(lián)。相關(guān)研究表明，CA患者于發(fā)病時，β-catenin水平mRNA表達(dá)水平呈異常狀態(tài)，其細(xì)胞周期亦會發(fā)生變化[10]。NF-κB作為多功能轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)多種基因表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖及進(jìn)展。除此之外，NF-κB可通過參與細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成、抑制細(xì)胞凋亡等方式參與CA病情進(jìn)展[11]。本研究結(jié)果顯示，高危組、低危組β-catenin、NF-κB陽性率高于健康體檢組，且伴隨時間延長，高危組、低危組角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力呈升高趨勢，β-catenin、NF-κB與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān)（P＜0.05）?？梢姡?catenin、NF-κB可作為臨床評估CA疾病感染類型的參考依據(jù)。

綜上，β-catenin、NF-κB表達(dá)水平與CA患者角質(zhì)形成細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān)，時間越長，光密度值越高，細(xì)胞繁殖能力越強，因此，其表達(dá)水平可作為臨床評估患者疾病感染類型的有效指標(biāo)。