易燦，周新崇，王亞舉，劉進(jìn)兵

(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽，422000)

山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]，主要分布在長江以南的湖南、四川、廣東、貴州、廣西、云南、江西、浙江及海南等省份。山銀花是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，含有豐富的綠原酸、黃酮類、酚類物質(zhì)等生物活性物質(zhì)[2]，具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、降血糖和降血脂等功能[3-4]。

山銀花的有效成分提取方法主要有水提法[5]、回流醇提法[6]、超聲波提取法[7]、微波提取法[8]、酶解法[9]和超臨界提取法等[10]。水提法操作簡單、安全、環(huán)保、生產(chǎn)成本低，但雜糅、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多，后續(xù)提純較為復(fù)雜[5]。超聲、微波提取法與水提、醇提法提取率較高，但操作步驟繁瑣，不利于工業(yè)生產(chǎn)[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，山銀花除了在制藥行業(yè)有開發(fā)價(jià)值外，在食品和化妝等領(lǐng)域也有市場價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助法提取山銀花總黃酮并進(jìn)行優(yōu)化，并測定了其α-葡萄糖苷酶的抑制活性，運(yùn)用酶動(dòng)力學(xué)探討了微波輔助提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制，為進(jìn)一步綜合利用山銀花資源提供參考。

1 材料與儀器

隆回山銀花(湖南省隆回縣農(nóng)貿(mào)市場)；阿卡波糖(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；蘆丁對照品(純度≥98%)(中國食品藥品檢定研究院)；α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,G5003-100UN)，對硝基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)(美國Sigma化學(xué)公司)，其他均為國產(chǎn)分析純。

SF-130型高速中藥粉碎機(jī)(中南制藥機(jī)械廠)；MCR-3常壓微波化學(xué)反應(yīng)器(鞏義市中天儀器科技有限公司)；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)(島津(上海)實(shí)驗(yàn)器材有限公司；Thermo U3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；PT-3502C全波長酶標(biāo)分析儀(北京普天新橋技術(shù)有限公司)；Cary Edipse熒光分光光度計(jì)(安捷倫科技有限公司)。

2 方法

2.1 總黃酮含量的測定

2.1.1 山銀總黃酮的提取

將去雜后的山銀花花蕾攤平于瓷盤中，置于60 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中，恒溫干燥24 h至干燥。將烘干的山銀花花蕾樣品于中草藥粉碎機(jī)中粉碎，過 60 mm，樣品裝入磨口瓶中，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

精確稱取1.00 g經(jīng)石油醚脫脂12 h的粉末，按一定料液比，加入適量一定濃度的乙醇，在一定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行微波輔助提取，提取完成后過濾，將濾液減壓濃縮，再用70%乙醇定容至25 mL，作為待測液備用。

2.1.2 黃酮提取率的測定

黃酮類化合物的測定采用硝酸鋁比色法[12]。精密吸取待測液200 μL于10 mL EP管中，加5%的亞硝酸鈉溶液200 μL，靜置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液200 μL，靜置6 min后再加4%的氫氧化鈉溶液2 mL，搖勻，靜置15 min，最后，以75%的乙醇溶液定容至10 mL。在波長為510 nm處用紫外分光光度計(jì)測吸光值，將吸光度(A)代入蘆丁回歸方程公式：C=0.012 86A-0.008 14，R2=0.999 02中，可得測定的供試樣品溶液的總黃酮濃度(C)，再計(jì)算出樣品中的總黃酮提取率η：

式中：C為粗提取樣液中總黃酮的濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為山銀花粉末樣品質(zhì)量，mg。

2.2 山銀花總黃酮工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別對影響山銀花總黃酮微波輔助提取過程中的 4 個(gè)因素(料液比(g/mL)、微波功率(W)、提取時(shí)間(min)和乙醇濃度(%))進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在完成上述4種單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以料液比、微波功率、提取時(shí)間和乙醇濃度為自變因素，設(shè)計(jì)四因素三水平L9(34)的正交試驗(yàn)，利用Design-Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，進(jìn)一步得出微波輔助法優(yōu)化提取山銀花總黃酮的最佳工藝條件。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表 1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 The level of response surface test design factors

2.3 山銀花提取物的抑制α-葡萄糖苷酶研究

山銀花提取物的抑制α-葡萄糖苷酶酶活性及抑制動(dòng)力學(xué)參照文獻(xiàn)[13-14]中方法選擇。

3 結(jié)果與討論

3.1 山銀花總黃酮的工藝優(yōu)化

3.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

山銀花單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 山銀花總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)Fig.1 Single factor experiment of total flavonoids in Lonicerae Flos

3.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化輔助山銀花總黃酮的提取工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)因素結(jié)果見表 2。利用 Design-Expert 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

表2 響應(yīng)面分析法結(jié)果Table 2 The results of response surface analysis

R=23.26+1.07A-0.415 8B+0.073 2C+0.070 3D-1.37AB-1.13AC-0.248 5AD-0.323 5BC+
0.082 0BD-0.965 0CD-2.42A2-0.785 4B2-0.988 6C2-0.632 6D2

其中：R為黃酮提取率；A，B，C和D分別為液料比、微波功率、提取時(shí)間和乙醇濃度。

由表3可知，對單因素來說，料液比、微波功率對總黃酮提取率影響比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，影響程度為A(料液比)>B(微波功率)>C(提取時(shí)間)>D(乙醇濃度)。

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、微波功率交互作用對山銀花總黃酮提取率影響的響應(yīng)曲面圖見圖2。對于交互作用來說，AB，AC，AD，BC以及CD的交互效應(yīng)對總黃酮提取率的影響比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BD的交互效應(yīng)對總黃酮提取率的影響比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但對于模型的二次項(xiàng)的影響比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 兩兩因素交互作用對山銀花總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface map of the interaction of two factors on the extraction rate of total flavonoids from Lonicerae Flos

3.1.3 預(yù)測模型和方法驗(yàn)證

用Design-Expert 12軟件得出山銀花總黃酮的最佳提取條件如下：料液比為1∶20.5 g/mL，時(shí)間為 8.0 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60.5%，功率為394 W，在此條件下模型預(yù)測的總黃酮提取率為 23.3%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件以及模型預(yù)測結(jié)果確定微波最佳提取條件如下：料液比為1∶20.5 g/mL，提取時(shí)間為8 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 60%，微波功率為400 W，并在此提取條件下檢測響應(yīng)面的最佳響應(yīng)適宜性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山銀花總黃酮提取率為23.1%，與預(yù)測值的相對誤差為1.22%。這個(gè)實(shí)際山銀花總黃酮的提取率與所建立模型預(yù)測的山銀花總黃酮提取率相差不大，說明構(gòu)建的模型是有效的。表明利用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件準(zhǔn)確可靠，且在實(shí)際操作中具備一定的可行性。

3.2 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的影響

3.2.1 山銀花總黃酮提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

糖尿病是一種可預(yù)防的代謝紊亂，其特征是血液中葡萄糖含量異常高，胰島素分泌失調(diào)[15]。α-葡萄糖苷酶是一種小腸消化酶，是人體內(nèi)主要的代謝酶之一，能迅速降解膳食中的淀粉，導(dǎo)致血糖水平迅速升高[16]，目前，天然α-葡萄糖苷酶抑制劑研究得到廣泛關(guān)注。以阿卡波糖為對照，得到山銀花提取物對對α-葡萄糖苷酶的抑制作用結(jié)果見圖3。

圖3 阿卡波糖和山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.3 Inhibition of acarbose and Lonicerae Flos extract on α-glucosidase

3.2.2 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)分析

山銀花微波輔助醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制的Lineweaver-Burk曲線見圖4。文獻(xiàn)[17]最大反應(yīng)速率Vmax減小，米氏常數(shù)Km增大，表4結(jié)果與此結(jié)果一致。由此推斷它對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型為混合型抑制。

表4 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk方程Table 4 Lineweaver Burk equation of inhibition of Lonicerae Flos extract on α -glucosidase

圖4 山銀花微波輔助醇提取物對α-葡萄糖苷酶抑制的Lineweaver-Burk曲線Fig.4 Lineweaver Burk curve of α-glucosidase inhibition by microwave-assisted ethanol extract of Lonicerae Flos

3.2.3 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的熒光淬滅作用

熒光猝滅滴定法被廣泛應(yīng)用于研究小分子與蛋白質(zhì)的相互作用[18]。如圖5所示，小分子物質(zhì)在α-葡萄糖苷酶熒光峰附近有熒光發(fā)射峰，隨著山銀花微波輔助醇提取物濃度增大，α-葡萄糖苷酶的熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度逐漸降低，可以推斷山銀花微波輔助醇提取物與α-葡萄糖苷酶之間發(fā)生了相互作用。

圖5 在310 K下山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的熒光作用Fig.5 Fluorescence of Lonicera Flos extract on α-glucosidase at 310 K

3.2.4 山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅機(jī)理

根據(jù)式(1)Stern-volmer 方程，將山銀花微波輔助醇提取物濃度對F0/F作圖，結(jié)果見圖6。由圖6可知：F0/F與[Q]呈良好的線性關(guān)系。山銀花提取物與α-葡萄糖苷酶相互作用的 Stern-Volmer 方程參數(shù)見表5，可知隨著溫度升高，淬滅常數(shù)Ksv減小，從而可判斷山銀花波輔助醇提取物對α-葡萄糖苷酶的熒光淬滅方式屬于靜態(tài)淬滅。

表5 山銀花提取物與α-葡萄糖苷酶相互作用的 Stern-Volmer 方程參數(shù)Table 5 Parameters of stern Volmer equation for interaction between Lonicera Flos extract and α-glucosidase

圖6 不同溫度下山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶熒光猝滅的Stern-Volmer圖Fig.6 Stern Volmer plots for the fluorescence quenching of α-glucosidase by Lonicera Flos extract at different temperatures

(1)

式中：F0為熒光物質(zhì)的初始熒光強(qiáng)度；F為相互作用后熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)；Ksv為Stern-Volmer方程猝滅常數(shù)；τ0為猝滅劑不存在時(shí)，生物大分子的熒光平均壽命，一般為10-8s；[Q]為熒光淬滅劑濃度。

4 結(jié)論

采用微波輔助法提取山銀花總黃酮，并用響應(yīng)面法優(yōu)化其工藝條件，得到最佳工藝條件為料液比為1∶20.5 g/mL，時(shí)間為8.0 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60.5%，功率為394 W，該優(yōu)選的工藝操作簡單，提取時(shí)間短，預(yù)測性強(qiáng)。山銀花提取物對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，半數(shù)抑制濃度為378.44 mg/L，抑制效果低于陽性對照阿卡波糖(半數(shù)抑制濃度為200.10 mg/L)。山銀花提取物和α-葡萄糖苷酶的相互作用按照靜態(tài)淬滅進(jìn)行，其抑制類型為混合型抑制。