田振華,何靜瑄,王 穎,段 煉,李從虎

1. 陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021 2. 輕化工程國家級實驗教學(xué)示范中心(陜西科技大學(xué))， 陜西 西安 710021 3. 西南大學(xué)桑蠶紡織與生物質(zhì)科學(xué)學(xué)院， 重慶 400715 4. 安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 安慶 246133

引 言

作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分， 膠原的主要生理機(jī)能是結(jié)締組織的粘合物質(zhì)， 起到保護(hù)機(jī)體與支撐器官的作用。 膠原分子特有的三股螺旋結(jié)構(gòu)賦予其優(yōu)異的生物學(xué)功能， 因此廣泛應(yīng)用于組織工程、 藥物控釋、 美容護(hù)膚等領(lǐng)域[1-2]。 然而， 三股螺旋結(jié)構(gòu)易受到熱、 酶、 外力等因素的影響， 可采用化學(xué)交聯(lián)或共混對膠原進(jìn)行改性以優(yōu)化其性能。

羧甲基纖維素(CMC)是目前用量最大的纖維素種類， 其結(jié)構(gòu)中含有大量的─COOH和─OH， 因此可與膠原形成氫鍵、 靜電作用， 但由于兩者之間僅存在非共價鍵作用， 所得復(fù)合材料部分性能仍有不足， 需輔以化學(xué)交聯(lián)對膠原與CMC的復(fù)合材料進(jìn)行改性。 氧化羧甲基纖維素(OCMC)是CMC經(jīng)氧化后得到的產(chǎn)物， 分子中含有醛基(如圖1所示)， 能與膠原的自由氨基形成希夫堿反應(yīng)、 引入共價鍵， 從而實現(xiàn)對膠原的共混與交聯(lián)雙改性。 在前期研究中， 考察了OCMC改性膠原水凝膠[3]及膠原膜的熱穩(wěn)定性[4]， 發(fā)現(xiàn)OCMC顯著提高不同相態(tài)膠原的熱穩(wěn)定性且熱穩(wěn)定性與交聯(lián)鍵的數(shù)量密切相關(guān)。 然而， 曾有報道指出交聯(lián)鍵在膠原變性過程中依然保留完整[5]， 因此考察交聯(lián)前后膠原的結(jié)構(gòu)變化及溫度效應(yīng)對于研究OCMC對膠原結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性的影響具有重要的理論指導(dǎo)意義。

圖1 氧化羧甲基纖維素制備原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the preparation of OCMC

二維紅外技術(shù)(2D-IR)是由Isao Noda提出的對一系列相關(guān)的紅外光譜圖進(jìn)行分析， 得到分子化學(xué)鍵振動模式間相互關(guān)系的一種數(shù)學(xué)方法。 此技術(shù)不僅可以提高光譜的分辨率， 而且可以判斷外擾條件改變時分子結(jié)構(gòu)的響應(yīng)順序， 已被用于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、 變性、 折疊和去折疊變化[6-7]。 Duan等[8]通過2D-IR分析了絲膠蛋白與膠原間的相互作用及其對膠原螺旋結(jié)構(gòu)的影響， 證實2D-IR是分析膠原結(jié)構(gòu)的一種有效手段。 2D-IR分析膠原結(jié)構(gòu)方面的前期研究主要關(guān)注純膠原在不同環(huán)境中的結(jié)構(gòu)變化或小分子交聯(lián)劑對膠原結(jié)構(gòu)的影響， 而采用此技術(shù)研究天然大分子交聯(lián)劑與膠原之間相互作用及其對膠原結(jié)構(gòu)、 熱穩(wěn)定性等的影響鮮見報道。 本工作通過2D-IR技術(shù)分析OCMC與膠原間的相互作用， 以及改性前后膠原結(jié)構(gòu)的溫度效應(yīng)以此表征OCMC對膠原穩(wěn)定性的影響。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

膠原海綿、 氧化羧甲基纖維素鈉(OCMC)， 實驗室自制； Na2HPO4， NaH2PO4和NaCl， 分析純， 廣東光華科技有限公司。 傅里葉變換紅外光譜儀， Vector-22， 德國Bruker公司。

1.2 OCMC改性膠原膜的制備

用PBS緩沖溶液(10 mmol·L-1Na2HPO4/NaH2PO4， 100 mmol·L-1NaCl， pH ～7.4)溶解膠原海綿、 OCMC， 分別配置6 mg·mL-1的膠原溶液和250 mg·mL-1的OCMC溶液。 隨后將OCMC分次滴加至膠原溶液中， 最終OCMC與膠原的質(zhì)量比分別為0∶1， 1∶1， 2∶1， 3∶1， 4∶1和5∶1， 依次命名為C0， C1， C2， C3， C4和C5； 反應(yīng)24 h后將所得改性樣品離心脫泡后倒入聚四氟乙烯圓盤中， 室溫下自然干燥， 待成膜后用超純水進(jìn)行清洗以除去鹽和未結(jié)合的OCMC等干擾物， 自然干燥后置于干燥器中平衡水分， 待測。

1.3 紅外光譜圖采集及2D-IR譜圖繪制

將純膠原C0與改性膠原C5置于培養(yǎng)箱中， 25～125 ℃范圍內(nèi)每升高10 ℃培養(yǎng)30 min后采集不同溫度下的樣品紅外光譜。 分辨率為4 cm-1、 掃描信號64次。 基于所采集的紅外光譜數(shù)據(jù)， 利用軟件2D shige (Kwansei Gakuin University)計算生成二維紅外數(shù)據(jù)， 基于Origin 8.0繪制2D-IR譜圖。 圖中實線和虛線分別代表正相關(guān)峰和負(fù)相關(guān)峰。

2 結(jié)果與討論

2.1 OCMC與膠原間的相互作用

2.1.1 一維紅外譜圖分析

圖2 不同量OCMC改性膠原的紅外全譜圖(a)和放大譜圖(b)Fig.2 FITR spectra (a) and enlarge spectra (b) of collagen cross-linked with OCMC

為0.980， 而C1， C2， C3， C4和C5分別為0.997， 1.022， 1.002， 1.014和1.016， 均接近于1.000， 可知改性后膠原保留了完整的螺旋結(jié)構(gòu)[11]。 然而， 改性后膠原的特征吸收峰并沒有發(fā)生明顯頻移， 無法獲知兩者間的相互作用。

2.1.2 二維紅外譜圖分析OCMC與膠原間的相互作用

為了進(jìn)一步證實兩者之間發(fā)生上述相互作用的可能性， 對各反應(yīng)基團(tuán)所對應(yīng)的自相關(guān)峰的強(qiáng)度變化及響應(yīng)順序以及實驗條件下膠原、 OCMC的帶電情況進(jìn)行分析。

通過自相關(guān)峰的強(qiáng)度評判所對應(yīng)結(jié)構(gòu)對外擾的敏感程度： 1 730 cm-1>1 320 cm-1>1 500 cm-1>1 435 cm-1>1 236 cm-1>1 610 cm-1， 可知OCMC醛基和膠原N─H和C─N結(jié)構(gòu)變化較大， 表明兩者間相互作用以O(shè)CMC醛基與膠原氨基的交聯(lián)反應(yīng)為主。

圖3(b)即異步譜由復(fù)雜的異步交叉峰Ψ(ν1,ν2)組成， 可輔助提供物質(zhì)結(jié)構(gòu)對外擾條件的響應(yīng)信息。 結(jié)合同步譜與異步譜， 根據(jù)野田規(guī)則[當(dāng)Φ(ν1,ν2) 和Ψ(ν1,ν2)同為正或同為負(fù)時，ν1先于ν2； 當(dāng)兩者一正一負(fù)時，ν1后于ν2]可判斷吸收峰的響應(yīng)順序(如表1所示)[14]。 在OCMC用量增加時， 膠原中各吸收峰的響應(yīng)順序為1 500 cm-1>1 236 cm-1>1 610 cm-1， 膠原的N─H和C─N結(jié)構(gòu)最先響應(yīng)； OCMC各吸收峰的響應(yīng)順序為1 320 cm-1>1 435 cm-1>1 730 cm-1， 羧基的響應(yīng)先于醛基； 換言之， OCMC首先通過羧基與膠原發(fā)生相互作用， 隨后醛基與膠原氨基發(fā)生希夫堿交聯(lián)反應(yīng)。

表1 交叉峰的特征及OCMC改性膠原結(jié)構(gòu)的響應(yīng)順序Table 1 Cross-peaks intensities and the response order of cross-linked collagens

圖3 不同量OCMC改性膠原的二維紅外同步圖(a)和異步圖(b)Fig.3 2D synchronous (a) and asynchronous (b) spectra of collagens cross-linked by OCMC

2.2 OCMC對膠原熱穩(wěn)定性的影響

2.2.1 一維紅外譜圖分析

圖4是純膠原(C0)與改性膠原(C5)在不同溫度下的紅外全譜圖[圖4(a,c)]及1 850～800 cm-1范圍內(nèi)的放大譜圖， 如圖4(b,d)所示。 隨溫度的升高， 純膠原的酰胺A帶和B帶分別降低了7和5 cm-1； 而改性膠原[圖4(c)]的酰胺A帶和B帶僅降低了4和3 cm-1。 此外， 純膠原[圖4(b)]酰胺Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ帶分別向低波數(shù)移動3， 10和4 cm-1； 對于改性膠原[圖4(d)]， 酰胺Ⅰ帶沒有發(fā)生明顯的移動， 酰胺Ⅱ、 Ⅲ帶分別向低波數(shù)移動5和2 cm-1。 綜上所述， 改性前后膠原的特征吸收峰均發(fā)生紅移； 此外， 酰胺Ⅰ， Ⅱ和Ⅲ帶吸收峰的峰形由尖峰逐漸變?yōu)閷挿澹?表明分子間締合氫鍵減弱， 而膠原螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性歸功于氫鍵， 由此可知升溫過程中膠原結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[10]； 然而后者的紅移程度小于前者， 說明改性膠原的熱穩(wěn)定性高。 通過AⅢ/A1 455值判斷膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。 如表2所示， 純膠原的AⅢ/A1 455值由0.980降低至0.663， 說明三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生解旋； 改性膠原的AⅢ/A1 455值也呈現(xiàn)下降趨勢， 但同一溫度下， 改性膠原的AⅢ/A1 455值略大于純膠原， 證實了OCMC提高了膠原的熱穩(wěn)定性。

圖4 不同溫度下純膠原(a,b)與改性膠原(c,d)的紅外全譜圖及放大譜圖a→k: 25～125 ℃Fig.4 Temperature-dependent infrared spectra and enlarge spectra of native collagen (a,b) and cross-linked collagen (c,d)a→k: 25～125 ℃

表2 不同溫度下純膠原與改性膠原的AⅢ/A1 455值Table 2 AⅢ/A1 455 values of native and cross-linked collagens at various temperatures

2.2.2 二維紅外譜圖分析OCMC對膠原熱穩(wěn)定性的影響

圖5為以溫度為外擾、 1 750～1 220 cm-1范圍內(nèi)純膠原與改性膠原的二維同步圖與異步圖。 圖5(a)中， 1 655,1 555,1 500,1 455和1 240 cm-1處自相關(guān)峰的出現(xiàn)說明升溫過程中膠原二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化[11]。 其中1 655,1 555和1 240 cm-1處吸收峰來自于膠原的螺旋結(jié)構(gòu)； 1 500 cm-1處來自于膠原無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。 與圖5(a)相比， 圖5(c)中除了上述自相關(guān)峰外， 1 730,1 610,1 435和1 320 cm-1處也出現(xiàn)了明顯的自相關(guān)峰。

圖5 不同溫度下膠原(a,b)與改性膠原(c,d)的二維紅外同步圖與異步圖Fig.5 Temperature-dependent 2D synchronous and asynchronous infrared spectra of native (a,b) and cross-linked collagen (c,d)

正交叉峰Φ(1 655, 1 555)，Φ(1 555, 1 240)與負(fù)交叉峰Φ(1 655, 1 610)，Φ(1 555, 1 500)的出現(xiàn)說明來源于螺旋結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ帶(1 655， 1 555和1 240 cm-1)的變化方向一致， 但與來源于無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅰ和Ⅱ帶(1 610， 1 500 cm-1)相反。 由此得到如下結(jié)論： 升溫過程中， 改性前后膠原二級結(jié)構(gòu)的崩塌均表現(xiàn)為螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。 此外， 對比自相關(guān)峰的強(qiáng)度可知， 膠原對溫度最為敏感的結(jié)構(gòu)是來自螺旋結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅰ和Ⅱ帶(1 655， 1 555 cm-1)、 最后為來自無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅱ帶(1 500 cm-1)。 然而， 對于改性膠原， 其強(qiáng)度大小順序發(fā)生了明顯變化， 最為敏感的是膠原無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅱ帶(1 500 cm-1)， 而螺旋結(jié)構(gòu)(1 655 cm-1)最不敏感， 反映出改性膠原的螺旋結(jié)構(gòu)得到穩(wěn)定。

結(jié)合同步圖[圖5(a,c)]與異步圖[圖5(b,d)]判斷吸收峰的響應(yīng)順序， 如表3所示。 升溫過程中膠原無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅱ帶首先響應(yīng)， 其次為螺旋結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅲ帶和Ⅰ， Ⅱ帶， 最后響應(yīng)的是CH3反對稱彎曲振動； 改性后仍然是膠原無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅰ和Ⅱ帶發(fā)生響應(yīng)， 其次為OCMC中的結(jié)構(gòu)響應(yīng)， 最后為膠原螺旋結(jié)構(gòu)的酰胺Ⅰ和Ⅱ帶， 說明改性膠原螺旋結(jié)構(gòu)的響應(yīng)發(fā)生滯后， 可證實OCMC對膠原的穩(wěn)定作用主要歸功于三股螺旋結(jié)構(gòu)的加固。

表3 交叉峰的特征及升溫過程中膠原及改性膠原結(jié)構(gòu)的響應(yīng)順序Table 3 Cross-peaks intensities and the response order of native and cross-linked collagens

3 結(jié) 論

交聯(lián)劑氧化羧甲基纖維素鈉(OCMC)的加入不會破壞膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)， 而且隨著用量的增多， OCMC首先通過羧基與膠原中精氨酸的胍基或賴氨酸的氨基發(fā)生靜電作用， 隨后醛基與膠原氨基之間發(fā)生希夫堿反應(yīng)并且兩者之間的相互作用以希夫堿交聯(lián)反應(yīng)為主。 此外， OCMC的引入穩(wěn)定了膠原的螺旋結(jié)構(gòu)， 因此在升溫過程中， 改性后膠原的螺旋結(jié)構(gòu)對溫度的敏感度降低， 且螺旋結(jié)構(gòu)對溫度的響應(yīng)發(fā)生滯后。