鄭肖蘭 劉先寶 李博勛 鄭行愷 時(shí)濤 馮艷麗 黃貴修

摘 ?要：天然橡膠是四大工業(yè)原料中唯一的可再生資源，由炭疽病菌侵染引起的橡膠樹炭疽病是當(dāng)前我國橡膠生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的兩大葉部病害之一。本研究以分離自云南保山的喀斯特炭疽病菌MeCkYN1705為對照，對海南新發(fā)炭疽病菌喀斯特炭疽菌HCkHNQZ1736進(jìn)行抗藥性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，菌株HCkHNQZ1736對苯并咪唑類殺菌劑多菌靈表現(xiàn)出高抗藥性，EC50達(dá)1107.2654??g/mL，而MeCkYN1705的EC50僅為0.0554??g/mL?？寺×司闔CkHNQZ1736的tub2基因，序列分析發(fā)現(xiàn)其所編碼的第198個(gè)氨基酸位點(diǎn)由谷氨酸（Glu-E）突變?yōu)楸彼幔ˋla-A），推測該氨基酸位點(diǎn)突變是導(dǎo)致該菌株產(chǎn)生多菌靈抗性的原因。此外生物學(xué)特性測定發(fā)現(xiàn)，該菌株最適生長溫度為28?℃，致死溫度為35?℃;最適生長pH為6;光暗交替利于菌落生長;果膠、蛋白胨分別為最適碳源和氮源。

關(guān)鍵詞：橡膠樹炭疽病;喀斯特炭疽病菌;β-TUB2;抗藥性

Abstract： Rubber tree （Hevea brasiliensis） is the only renewable resource among the four major industrial raw materials. Rubber tree anthracnose which infected by the Colletotrichum spp. is one of the most serious foliar disease of rubber production in China. In this paper， a new strain of C. karstii was identified and analyzed for carbendazim （2-benzo imidazole methyl carbamate） resistance. The carbendazim sensitivity test of HCkHNQZ1736 and MeCkYN1705， HCkHNQZ1736 showed high resistance to benzimidazole fungicides carbendazim， the EC50 was 1107.265 ?g/mL， while MeCkYN1705 had only 0.0554??g/mL. After the HCkHNQZ1736 tub2 gene was cloned， sequence analysis showed that the 198th amino acid locus was mutated from glutamic acid （Glu-E） to alanine （Ala-A）. This paper speculated that the mutation of the amino acid locus was the cause of carbendazim resistance of the strain. Combining morphological observation and polygenic phylogenetic analysis found that the optimum temperature was 28?℃， the lethal temperature was 35?℃， and the optimum pH was 6. The study also found that the alternation of light and dark was beneficial to colony growth， and pectin and peptone were the optimum carbon and nitrogen sources.

Keywords： rubber tree anthracnose; Colletotrichum karstii; β-TUB2; resistance

天然橡膠、鋼鐵、煤炭、石油并稱為世界四大工業(yè)原料，天然橡膠是其中唯一的可再生資源。1906年斯里蘭卡的Peteh首次報(bào)道橡膠樹炭疽病，我國該病最早于1962年在海南大豐農(nóng)場開割林段爆發(fā)流行[1-2]。到目前為止，橡膠樹炭疽病幾乎遍布全球所有植膠地，其中非洲中部、南美洲、亞洲南部和東南部等植膠國家最為嚴(yán)重[2-3]。苯并咪唑類殺菌劑是一種內(nèi)吸性殺菌劑，其開發(fā)已有近50 a的歷史，以高效和廣譜著稱，是植物病害化學(xué)防治的里程碑，極具歷史意義[4-5]。其中多菌靈是應(yīng)用最普遍的一種。在化學(xué)防治仍是目前橡膠樹炭疽病的主要應(yīng)對方法的大環(huán)境下，長期施藥除了污染環(huán)境以外，還極易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，這一現(xiàn)狀為炭疽病防治加大了難度。

本研究就海南新發(fā)炭疽病菌喀斯特炭疽菌HCkHNQZ1736開展殺菌劑敏感性測定時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌株對多菌靈表現(xiàn)出高抗藥性，依據(jù)多篇文獻(xiàn)報(bào)道，多種真菌對苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性主要是β-微管蛋白與藥劑結(jié)合位點(diǎn)氨基酸發(fā)生突變，導(dǎo)致真菌對藥劑不敏感[6-16]。為探究本實(shí)驗(yàn)室所發(fā)現(xiàn)的橡膠樹喀斯特炭疽菌是否也同樣由于tub2基因的突變而引起多菌靈的抗藥性，將已獲得的抗藥性菌株的β-微管蛋白tub2基因進(jìn)行序列分析，在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用BLAST進(jìn)行序列相似性比對分析，在http：//linux1.softberry.com/berry. phtml？topic=fgenesh &group=programs&sub gr o u p = gfind中進(jìn)行基因預(yù)測，獲得氨基酸序列，比較抗性菌株和敏感性菌株的氨基酸序列，以探究HCkHNQZ1736菌株β-微管蛋白tub2基因的氨基酸是否發(fā)生突變。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株 ?喀斯特炭疽（Colletotrichum karstii）菌株MeCkYN1705，分離自云南保山，由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所分離、鑒定和保存;喀斯特炭疽菌株HCkHNQZ1736分離自海南瓊中，為本研究中采集、分離和鑒定獲得。

1.1.2 ?供試培養(yǎng)基 ?PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基）：去皮潔凈馬鈴薯200?g切小塊在蒸餾水中煮沸30?min后用紗布過濾獲取濾液，加入20?g葡萄糖，17?g瓊脂粉，溶解后加蒸餾水定容至1?L，121?℃滅菌20?min。

LB培養(yǎng)基：NaCl 10?g，酵母提取物5?g，蛋白胨10?g，瓊脂粉17?g，加蒸餾水溶解后定容至1?L，121?℃滅菌20 min。

1.1.3 ?供試藥劑 ?98%多菌靈原藥，由安林生物化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?藥劑敏感性測定 ?（1）多菌靈藥劑母液配置。稱取0.5?g 98%多菌靈原藥粉劑溶解于適量1?mol/L稀鹽酸中，待粉末完全溶解后用無菌水定容至50?mL，過濾滅菌，獲得10?000??g/mL的母液4?℃保存。

（2）含藥培養(yǎng)基配置。通過在降溫至60?℃左右的PDA培養(yǎng)基中按要求添加不同體積的多菌靈母液，分別制成不同濃度的含多菌靈PDA培養(yǎng)基。處理終濃度梯度如表1所示。

（3）敏感性評(píng)價(jià)方法[6]。將供試菌株接種于PDA平板上，28?℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5?d后，用滅菌的接種針挑取直徑5?mm的菌餅，移接于上述含藥平板進(jìn)行篩選，置于28?℃恒溫箱中培養(yǎng)5?d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，觀察菌落生長情況，用十字交叉法測量并記錄菌落生長直徑，計(jì)算菌絲生長抑制率，進(jìn)行回歸分析，計(jì)算回歸方程和EC50（抑制菌絲生長50%的有效濃度）。

1.2.2 ?抗藥性菌株抗性遺傳穩(wěn)定性測定 ?將供試菌株接種于無藥PDA平板上培養(yǎng)后，通過單孢分離進(jìn)行繼代培養(yǎng)5代后，將第1代和第5代菌株同時(shí)接種至多菌靈濃度為600??g/mL的PDA培養(yǎng)基上，置于28?℃恒溫箱中培養(yǎng)5?d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，觀察菌落生長情況，用十字交叉法測量并記錄菌落生長直徑，若各代菌株生長情況和菌落直徑差異不顯著，則表明抗藥性遺傳穩(wěn)定。

1.2.3 ?喀斯特炭疽菌tub2基因突變與抗藥性關(guān)系分析 ?利用Primer 5.0軟件在β-微管蛋白tub2基因起始編碼區(qū)和終止編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增基因的完整編碼區(qū)序列。

設(shè)計(jì)引物對：CKtub2F： 5-TCATCCAAAAT G C GT GAGATT-3;CKtub2R： 5-TACTC CTCCT CCTC CTCGTCA-3。

PCR擴(kuò)增體系（總體積25??L）：2.5?mmol/L dNTP Mixture 2??L;TakaRa LA Taq高保真酶0.5??L;2×GC buffer I 12.5??L;10??mol/L上游引物1??L;10??mol/L下游引物1??L;ddH2O 7??L;Template 1??L。

PCR反應(yīng)程序：94?℃ 5?min;94?℃ 45?s，54?℃ 45?s，72?℃ 2?min，34個(gè)循環(huán);72?℃ 5?min，4?℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，片段用OMEGA回收試劑盒進(jìn)行回收。將擴(kuò)增回收產(chǎn)物連接至PMD18-T載體，連接體系：pMD18-T Vector 50?μg/μL 1?μL，Solution I 5?μL，目標(biāo)片段0.1～0.3?pmol，ddH2O補(bǔ)至10?μL;16?℃水浴中連接過夜。

采用熱擊轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans 5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選疑似陽性克隆子于LB液體培養(yǎng)基（含Amp濃度為50?μg/mL）中，37?℃ 180?r/min搖菌培養(yǎng)12?h獲得菌液。利用通用引物M13R和M13F進(jìn)行菌液PCR檢測。經(jīng)過檢測確認(rèn)為陽性克隆子后，送華大基因有限公司測序。

1.2.4 ?基礎(chǔ)生物學(xué)特性測定 ?（1）生長適宜溫度的測定。將供試菌株接種于PDA平板上，分別置于10、15、20、25、28、30、32、35?℃環(huán)境下黑暗培養(yǎng)5?d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，用十字交叉法測量并記錄菌落生長直徑，明確病原菌的生長適宜溫度范圍。

（2）不同光照下菌株生長速率的測定。將供試菌株接種于PDA平板上，分別置28?℃于連續(xù)光照、連續(xù)黑暗和每12?h明暗交替的環(huán)境下培養(yǎng)5?d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，用十字交叉法測量并記錄菌落生長直徑，明確光照對菌株生長速度的影響。

（3）不同碳源對菌落生長的影響。以相同質(zhì)量的木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、堿性木素、果膠、纖維素、淀粉和多聚半乳糖醛酸替換察氏固體培養(yǎng)基中的蔗糖，配制成含有不同碳源的培養(yǎng)基。將供試菌株接種至不同碳源的察氏培養(yǎng)基中，以普通察氏培養(yǎng)基作為對照，置于28?℃恒溫箱中培養(yǎng)7?d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，用十字交叉法測量菌落直徑以明確菌株對不同碳源的利用率。

（4）不同氮源對菌落生長的影響。以相同質(zhì)量的硝酸銨、硝酸鉀、磷酸二氫銨、硫酸銨、氯化銨、蛋白胨和天冬酰胺替換察氏固體培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配制成含有不同氮源的培養(yǎng)基。將供試菌株接種至不同氮源的察氏培養(yǎng)基中，以普通察氏培養(yǎng)基作為對照，置于28?℃恒溫箱中培養(yǎng)7?d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，用十字交叉法測量菌落直徑以明確菌株對不同氮源的利用率。

（5）pH對菌落生長的影響。用1?mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，將供試菌株分別接種于pH為4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培養(yǎng)基中，置于28?℃恒溫箱中培養(yǎng)5?d，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，用十字交叉法測量并記錄菌落生長直徑，明確pH對菌株生長速度的影響。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并用SPSS 7.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?喀斯特炭疽菌藥劑敏感性測試結(jié)果

在98%多菌靈原藥濃度梯度下菌株HCkHN QZ 1736和MeCkYN1705的敏感性結(jié)果如圖1、圖2，計(jì)算其毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)和EC50值（表2）。結(jié)果表明，在多菌靈的篩選壓力下，HCkHNQZ1736明顯產(chǎn)生強(qiáng)抗藥性，EC50達(dá)到1107.2654??g/mL，而MeCkYN1705的EC50僅為0.0554??g/mL。

2.2 ?HCkHNQZ1736多菌靈抗藥性遺傳穩(wěn)定性分析

如圖3所示，接種自第1代的菌株在600??g/mL多菌靈PDA平板上的平均菌落直徑為48.17?mm，接種自第5代的菌株在600??g/mL多菌靈PDA平板上的平均菌落直徑為47.33?mm，二者菌落生長情況無顯著差異，可判斷其對多菌靈的抗藥性具有遺傳穩(wěn)定性。

2.3 ?喀斯特炭疽菌tub2基因與抗藥性關(guān)系分析

通過引物對CKtub2F/CKtub2R對喀斯特炭疽菌HCkHNQZ1736和MeCkYN1705菌株的tub2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖4），將擴(kuò)增片段回收、克隆、測序獲得β-微管蛋白基因片段長度為1789?bp，通過基因預(yù)測分析基因序列編碼428個(gè)氨基酸（圖5），通過與幾種已報(bào)道的植物病原真菌β-微管蛋白氨基酸進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)氨基酸的同源性99%以上，由此可以確認(rèn)克隆獲得的基因?yàn)镠CkHNQZ1736和MeCkYN1705菌株的β-微管蛋白基因。

通過對6個(gè)菌株（多菌靈抗藥性研究的模式菌株Aspergillus nidulans、Neurospora crassa，具有多菌靈抗藥性的已報(bào)道菌株Colletotrichum siamense_Yd-8、Colletotrichum fructicola_Gwha-1，具有多菌靈抗藥性的供試菌株HCkHNQZ1736，不具有多菌靈抗藥性的供試菌株MeCkYN1705）的β-微管蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明（圖6），具有多菌靈抗藥性的供試菌株HCkHNQ Z 1736與具有多菌靈抗藥性的已報(bào)道菌株C. siamense_Yd-8、C. fructicola_Gwha-1存在氨基酸突變的一致性，其198位點(diǎn)的谷氨酸（Glu-E）均突變成為丙氨酸（Ala-A），這一現(xiàn)象與多篇文獻(xiàn)報(bào)道的真菌產(chǎn)生多菌靈抗藥性的機(jī)理相同[9， 17-19]。因此可以初步推斷其第198位氨基酸的突變導(dǎo)致喀斯特炭疽菌HCkHNQZ1736對多菌靈產(chǎn)生抗藥性。

2.4 ?基礎(chǔ)生物學(xué)特性

2.4.1 ?溫度對菌落生長的影響 ?如圖7所示，供試菌株HCkHNQZ1736和MeCkYN1705生長溫度范圍為15～32?℃;28?℃為最適生長溫度范圍，菌落生長速度最快，約為11.7 mm/d。

2.4.2 ?光照對菌落生長的影響 ?如圖8所示，供試菌株HCkHNQZ1736和MeCkYN1705在3種光照條件下均能正常生長，連續(xù)光照條件下2種菌株生長速率分別為11.1?mm/d和10.6?mm/d;連續(xù)黑暗條件下2種菌株生長速率分別為11.1?mm/d和10.9?mm/d;光暗交替條件下2種菌株生長最快，生長速率分別為11.7?mm/d和11.9?mm/d。

2.4.3 ?不同碳源對菌株生長的影響 ?如圖9所示，供試菌株HCkHNQZ1736和MeCkYN1705在13種不同碳源中均能生長，其中HCkHN QZ1736對果膠的利用率最好，平均生長速率達(dá)9.4?mm/d，對多聚半乳糖醛酸的利用率最差，平均生長速率僅為3.1?mm/d;MeCkYN1705對果膠的利用率最好，平均生長速率達(dá)8.7?mm/d，對乳糖的利用率最差，平均生長速率僅為3.5?mm/d。

2.4.4 ?不同氮源對菌株生長的影響 ?如圖10所示，供試菌株HCkHNQZ1736和MeCkYN1705在8種不同氮源中均能生長，其中參試菌株對蛋白胨的利用率最好，平均生長速率分別為9.0?mm/d和8.5?mm/d;對硫酸銨的利用率最差，平均生長速率分別為3.19?mm/d和2.7?mm/d。

2.4.5 ?pH對菌落生長的影響 ?如圖11所示，供試菌株HCkHNQZ1736和MeCkYN1705在pH 4～12范圍內(nèi)均能生長，但菌落生長直徑有明顯差異，pH 6～9最適宜菌株生長，pH在6時(shí)菌株生長最快，HCkHNQZ1736和MeCkYN1705的生長速率分別約為11.1?mm/d和11.5?mm/d，在pH達(dá)到11時(shí)基本停止生長。

3 ?討論

對真菌抗藥性研究多用Aspergillus nidulans和Neurospora crassa作為模式菌株，黃大野等[20]研究表明，與tub2基因編碼的氨基酸比對后發(fā)現(xiàn)，第6、50、134、165、167、198、200、237、241、250、257位點(diǎn)的氨基酸突變均能不同程度地引起菌株產(chǎn)生抗藥性。其中198位點(diǎn)的谷氨酸（Glu-E）有多種突變方式，如突變?yōu)楸彼幔ˋla-A）、賴氨酸（Lys-K）、纈氨酸（Val-V）、甘氨酸（Gly-G）或谷氨酰胺（Gln-Q）均能引起菌株產(chǎn)生抗藥性，但是抗性程度不同，E198A或E198K所產(chǎn)生的抗藥性比其他突變情況將更強(qiáng)，E198A是迄今為止最常見的突變方式[21]。

膠孢炭疽病菌和尖孢炭疽病菌作為當(dāng)前橡膠樹炭疽病的主要病原菌，其對苯并咪唑類殺菌劑的抗性機(jī)理前人已做過一定的解釋和研究，發(fā)現(xiàn)尖孢炭疽的抗藥性存在tub1基因上調(diào)的獨(dú)特性，而膠孢炭疽的抗藥性機(jī)理與其他種類的菌株基本一致，都是由tub2基因突變引起[22-23]，但尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道橡膠樹喀斯特炭疽菌對苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生抗藥性和進(jìn)行抗性機(jī)理的分析總結(jié)，在本研究中發(fā)現(xiàn)的喀斯特炭疽菌株HCkHNQZ1736tub2基因氨基酸符合E198A的突變方式，且表現(xiàn)為高抗性，EC50達(dá)到1107.2654??g/mL。菌株HCkHNQZ1736產(chǎn)生抗藥性的機(jī)理符合前人對其他種類菌株的相關(guān)研究結(jié)果[22-23]，為橡膠樹喀斯特炭疽的相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)。

以此對菌株HCkHNQZ1736開展包括適生溫度、光照影響、碳氮源利用和pH影響等生物學(xué)特性的研究，結(jié)果顯示抗藥性菌株HCkHNQZ 1736與敏感性菌株MeCkYN1705的基礎(chǔ)形態(tài)和生物學(xué)特性并不存在顯著差異，可見抗藥性突變并不影響這些生物學(xué)功能。

通過研究發(fā)現(xiàn)，菌株HCkHNQZ1736的抗性遺傳具有很好的穩(wěn)定性，在田間長期施藥過程中，可能致使藥劑敏感性菌株發(fā)生突變成為抗性菌株后能夠穩(wěn)定擴(kuò)展，最終使得施藥效果逐年下降，產(chǎn)生嚴(yán)重的浪費(fèi)，此時(shí)有針對性地施藥或輪換其他類型的藥劑就顯得尤為重要。由于此前在海南省橡膠樹炭疽病的研究中并未發(fā)現(xiàn)和報(bào)道喀斯特炭疽菌，其他病原菌種群也未發(fā)現(xiàn)和報(bào)道對苯并咪唑類殺菌劑有高抗藥性的菌株，并且歷年用于不同小寫字母代表菌株之間差異顯著（P<0.05）。

防治橡膠樹炭疽病時(shí)多菌靈的施用也不算過于頻繁，故而推測本研究發(fā)現(xiàn)的侵染橡膠樹的喀斯特炭疽菌或?yàn)槠渌魑锷蟼魅?，然后蔓延至橡膠樹的。

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