◎ 黃 宇，趙 嵩，張?jiān)滤?，?強(qiáng)

（馬鞍山市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 馬鞍山 243000）

三氯蔗糖，又稱(chēng)為蔗糖素，在高溫下甜度不變[1-2]，甜味純正，其甜度約為蔗糖的600倍，是以蔗糖為原料的功能性甜味劑[3-4]，可有效減少肥胖人群和糖尿病患者對(duì)糖的攝入，被廣泛用于各類(lèi)食品中[5]。有研究表明，腸道菌群的失調(diào)與消化系統(tǒng)疾病、代謝性疾病有一定的聯(lián)系[6]。腸道屏障和腸道內(nèi)環(huán)境及其代謝物的相互作用形成腸道穩(wěn)態(tài)，當(dāng)三氯蔗糖進(jìn)入腸道后，腸道微生物豐度降低和結(jié)構(gòu)改變，促炎因子水平升高，腸道免疫屏障受損，無(wú)法有效抵制大量產(chǎn)生的腸道細(xì)菌毒素和病原體，致使腸道穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致機(jī)體持續(xù)的炎癥和腸道組織損傷。同時(shí)，經(jīng)過(guò)三氯蔗糖干預(yù)的腸道微生物組中耐藥基因增加，耐藥基因增加相應(yīng)耐藥細(xì)菌也將繁殖，最終可能導(dǎo)致更惡劣的腸道環(huán)境[7-8]，因此，三氯蔗糖在食品中的使用仍須嚴(yán)格控制。2019年12月，安徽省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布了本年度第51期食品抽檢信息，在466批次樣品中檢出6批次不合格樣品，涉及甜味劑項(xiàng)目不合格樣品3批次，其中三氯蔗糖不合格2批次，且不合格樣品均為醬腌菜。根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定腌漬的蔬菜中三氯蔗糖最大使用量為0.25 g·kg-1。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果在限量值附近時(shí)，檢測(cè)結(jié)果對(duì)醬腌菜是否合格有直接影響。不確定度評(píng)定是評(píng)價(jià)測(cè)量方法的合理性與科學(xué)性的有效手段之一，當(dāng)不合格樣品在復(fù)檢時(shí)，不確定度也是評(píng)價(jià)測(cè)得值的準(zhǔn)確度、可信度的定量指標(biāo)。

本研究按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測(cè)定》（GB 22255—2014）中高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法檢測(cè)醬腌菜中三氯蔗糖含量，根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）和《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL006—2019）建立數(shù)學(xué)模型，系統(tǒng)分析不確定度來(lái)源，通過(guò)對(duì)影響樣品檢測(cè)結(jié)果的不確定度進(jìn)行評(píng)定，為當(dāng)樣品含量在限值附近的結(jié)果判定提供參考，對(duì)檢驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 infinity Ⅱ高效液相色譜儀（配G4260B蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)Agilent科技公司）；ME204E/02梅特勒-托利多電子天平（分度值：0.1 mg，瑞士Mettler TOLEDO公司）；GL-21M高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；Arium-pro超純水發(fā)生器（德國(guó)Sartorius公司）；A100250多管渦旋儀（月旭科技（上海）股份有限公司）；N-EVAP 5085氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司）。

三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.77%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈、正己烷（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；0.45 μm有機(jī)系濾膜（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

醬腌菜為市售五香蘿卜條。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱(chēng)取三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液：用5 mL吸量管分別吸取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL三氯蔗糖中間液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成濃度為20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理

稱(chēng)取1.5 g（精確至0.000 1 g）醬腌菜樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水渦旋振蕩3 min后加入15 mL甲醇，繼續(xù)渦旋20 min，以3 000 r·min-1離心10 min后，將上清液移入50 mL離心管中，沉淀物加入5 mL甲醇水溶液（75∶25，V∶V），渦旋振蕩30 s，以3 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)提取2次，合并上清液。上清液于沸水浴中氮吹至1 mL左右時(shí)，加入9 mL水，渦旋超聲波處理10 min。向離心管中加入10 mL正己烷，振搖2 min后以3 000 r·min-1離心10 min，棄去正己烷層。取全部上清液移入已活化好的固相萃取柱中，控制液體流速不超過(guò)每秒1滴，用1 mL水淋洗，排干柱中液體，加入3 mL甲醇洗脫，洗脫液于氮吹儀中氮吹近干，加入1.0 mL乙腈水溶液（11∶89，V∶V）溶解，溶液過(guò)0.45 μm濾膜，待測(cè)。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），月旭科技（上海）股份有限公司；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：乙腈+水（11∶89，V∶V）；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1。

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)計(jì)算原理，可得醬腌菜的三氯蔗糖含量測(cè)定的數(shù)學(xué)模型[9]，定量結(jié)果按以下公式計(jì)算：

式（1）中：X為樣品中三氯蔗糖的含量，g·kg-1；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得樣品進(jìn)樣液中三氯蔗糖的濃度，μg·mL-1；V為樣品定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；R為回收率；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源的分析

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定醬腌菜中的三氯蔗糖的不確定度主要來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)變動(dòng)性、樣品前處理、樣品測(cè)量重復(fù)性、樣品加標(biāo)回收等環(huán)節(jié)。

2.2 不確定度的分量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)主要由標(biāo)準(zhǔn)品純度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a1)，標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a2)和配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的玻璃器皿引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a3)組成。

（1）標(biāo)準(zhǔn)品純度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a1)。由三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)所得純度為99.77%，擴(kuò)展不確定度為U=0.77%（k=2），標(biāo)準(zhǔn)品純度不確定度按正態(tài)分布計(jì)算，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a2)。使用萬(wàn)分之一天平，按照純度換算稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品0.100 2 g。根據(jù)該天平檢定證書(shū)，在0～50 g稱(chēng)量范圍內(nèi)，最大允許誤差為0.000 5 g，按照矩形分布計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的玻璃器皿引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a3)。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的玻璃器皿引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a3)主要由玻璃器皿的容量允差產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)和溫度對(duì)體積的影響產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T)組成。從《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）獲得容量器皿的允差δ，按照三角分布處理，取則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制需進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)定，而每次所用的容量瓶不可能保持完全相同，可認(rèn)為容量瓶的體積誤差和讀數(shù)誤差已隨機(jī)化（有正有負(fù)），其不確定度分量可忽略，不再評(píng)定。溫度對(duì)體積的影響主要包括溫度對(duì)溶液體積和容量器皿的體積膨脹變化，容量器皿一般為硼硅酸鹽玻璃，膨脹系數(shù)為1×10-5℃-1，忽略不計(jì)。溫度對(duì)溶液體積的膨脹影響是指實(shí)驗(yàn)室使用標(biāo)準(zhǔn)溶液與溫度配制時(shí)，溫度間變動(dòng)而產(chǎn)生的影響，該實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，因此，不存在溫度對(duì)體積的影響產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

（4）分度吸量管移液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)。根據(jù)1.2.1方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取標(biāo)準(zhǔn)溶液用的5 mL分度吸量管（A級(jí)），其體積允差為±0.025 mL，按三角分布處理，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

5次移取標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可近似用其均方根計(jì)算：

（5）100 mL容量瓶定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V2)。使用的100 mL容量瓶（A級(jí)），其體積允差為±0.10 mL，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)于2.2.1（4）中的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可忽略。

（6）10 mL容量瓶定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V3)。使用的10 mL容量瓶（A級(jí)），其體積允差為±0.020 mL，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

使用5個(gè)10 mL容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可近似用其均方根計(jì)算為：

相對(duì)于2.2.1（4）中的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可忽略。

由以上數(shù)據(jù)可得三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制過(guò)程中玻璃器皿產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a3)=2.51×10-2。

因此，三氯蔗糖在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品前處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B)

待測(cè)試樣制備過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來(lái)自樣品稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(b1)和待測(cè)試樣定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(b2)。

（1）樣品稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(b1)。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.5 g待測(cè)樣品，根據(jù)所用天平檢定證書(shū)，最大允許誤差為0.0005 g，按照矩形分布計(jì)算得出：

（2）待測(cè)試樣定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(b2)。使用1 mL單標(biāo)管吸取初始流動(dòng)相定容，所用1 mL單標(biāo)管容量允差為±0.007 mL，按照三角分布計(jì)算得出：

因此，樣品前處理引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 樣品測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)

按照1.2的實(shí)驗(yàn)方法處理樣品，得到6次獨(dú)立測(cè)試的結(jié)果依次為 0.227 g·kg-1、0.214 g·kg-1、0.232 g·kg-1、0.208 g·kg-1、0.201 g·kg-1、0.215 g·kg-1，平均值為x-為0.216 g·kg-1。根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算得出測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)變動(dòng)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(D)

按照2.2的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)5個(gè)不同濃度的三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行3次測(cè)定，擬合出以I=a+bC形式的一元一次方程，根據(jù)公式（2）計(jì)算待測(cè)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測(cè)定結(jié)果表

式（2）中：SR為殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差；C0為待測(cè)樣品溶液濃度平均值的對(duì)數(shù)值；b為斜率；a為截距；P為樣品測(cè)定次數(shù)；n為工作曲線(xiàn)校準(zhǔn)點(diǎn)測(cè)量次數(shù)；C-為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)各點(diǎn)濃度對(duì)數(shù)的平均值。

由表1數(shù)據(jù)，根據(jù)蒸發(fā)光檢測(cè)器原理得出醬腌菜中三氯蔗糖含量，利用最小二乘法擬合線(xiàn)性方程及統(tǒng)計(jì)結(jié)果，見(jiàn)表2。

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)變動(dòng)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表2 三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液線(xiàn)性方程及統(tǒng)計(jì)結(jié)果表

2.2.5 回收率測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

準(zhǔn)確稱(chēng)取6份1.5 g空白樣品，按照最大使用量0.25 g·kg-1向其中加入三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)1.2的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。其6次加標(biāo)回收率分別為：92.2%、98.4-%、90.2%、90.0%、93.8%、96.6%，平均加標(biāo)回收率R為93.53%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S=3.42%，則回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

采用t檢驗(yàn)法對(duì)回收率進(jìn)行顯著性實(shí)驗(yàn)確定其在計(jì)算公式中是否使用。由《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）附錄查知，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，自由度ν為5時(shí)，t0.95(5)=2.57。本實(shí)驗(yàn)n=6，自由度ν=5，計(jì)算得出：

當(dāng)t≥2.57時(shí)，則回收率有非常顯著性差異，因此該實(shí)驗(yàn)需要使用回收率校正結(jié)果為0.231 g·kg-1。

2.3 相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(x)

樣品中三氯蔗糖測(cè)定結(jié)果相對(duì)合成不確定度為：

2.4 不確定度結(jié)果報(bào)告

假設(shè)測(cè)量過(guò)程中的誤差屬于正態(tài)分布，取置信區(qū)間P=95%，包含因子k=2，則醬腌菜中的三氯蔗糖含量測(cè)定相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

Urel=k×urel(x)=2×3.71×10-2=7.42%

該實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品中三氯蔗糖含量為擴(kuò)展不確定度為：

U=742%×0.231=0.017 1 g·kg-1

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測(cè)量醬腌菜中三氯蔗糖含量的結(jié)果表示為C=（0.231 0±0.0171）g·kg-1（k=2，P=95%）。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品重復(fù)測(cè)定和樣品加標(biāo)回收對(duì)三氯蔗糖含量測(cè)定的不確定度貢獻(xiàn)最大。樣品前處理和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)擬合對(duì)最終結(jié)果影響較小，因此在實(shí)驗(yàn)中，樣品處理和加標(biāo)實(shí)驗(yàn)應(yīng)保證各項(xiàng)操作的正確性和一致性。配制標(biāo)曲時(shí)應(yīng)選擇較高精密度的器皿，注意其最佳使用量程，減少誤差。當(dāng)使用精密儀器，應(yīng)選擇合適的實(shí)驗(yàn)條件，注意各項(xiàng)操作規(guī)范，保證儀器設(shè)備的穩(wěn)定性，降低不確定度，提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確質(zhì)量。