孫嘉華，李雨萌,凌 翰,惠竹梅

(西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100)

我國大多數(shù)地區(qū)屬于大陸性季風氣候，雨熱同季。在黃河故道、環(huán)渤海灣、黃土高原等主要葡萄種植區(qū)域，夏秋多雨容易導致葡萄霜霉病、白腐病、炭疽病等真菌病害頻繁發(fā)生，因此，在葡萄栽培管理中常使用殺菌劑、殺蟲劑等化學農藥來防治真菌病害[1]。多菌靈是葡萄田間管理中廣泛使用的一種高效低毒殺菌劑，它屬于苯并咪唑類農藥，對許多子囊菌和半知菌有效，可干擾細菌有絲分裂中紡錘體的形成，影響細胞分裂，從而起到殺菌作用，常用于葡萄白腐病、黑痘病、炭疽病的防治[2]。但在葡萄栽培管理中經(jīng)常因為農藥使用不當，使大量有機物殘留在葡萄植株上，導致葡萄葉片萎黃、光合能力降低、營養(yǎng)物質缺乏以及生物量減少[3]，殘留的農藥還會進入葡萄果實或通過發(fā)酵進入葡萄酒中影響葡萄酒的質量安全，對人類健康造成威脅[1]。植物在長期進化中形成了自身的解毒機制，它們將農藥代謝為毒性較低的物質隔離儲存起來從而達到解毒的目的，但由于植物自身解毒機制效率較低，所以需要通過物理、化學和生物手段加速農藥殘留的降解[3]。油菜素內酯可參與植物體內多種生長代謝和抗逆過程，在降解農藥殘留方面有著較好的應用前景。

油菜素內酯 (Brassinosteroid, 簡稱BR)是廣泛存在于植物中的甾醇類激素，它在植物生長發(fā)育中起到至關重要的作用，可以緩解多種生物脅迫和非生物脅迫。已有研究表明：0.1 mg·L-1的外源2，4-表油菜素內酯(EBR)預處理能通過改善葡萄葉片光合特性，減少其活性氧物質和丙二醛(MDA)的積累以及提高解毒酶活性以促進百菌清降解，從而緩解農藥對葡萄植株的傷害[3]；當葡萄遭受低溫脅迫時，外源BRs可通過提高植物體內的保護酶活性、清除活性氧自由基而間接抑制過氧化產(chǎn)物MDA的含量，從而減輕低溫誘導的氧化性損傷[4]；EBR預處理能夠通過提高黃瓜幼苗葉片的同化能力和抗氧化酶活性緩解多種農藥的藥害[5]；在番茄、黃瓜等作物上噴灑多菌靈、毒死蜱和除蟲菊酯等農藥前，先噴灑少量油菜素內酯作預處理，可以降低農藥殘留30%～70%[6]；對植物用毒死蜱處理前先用EBR預處理可提高植物體內的谷胱甘肽S-轉移酶(GST)、過氧化物酶(POD)和谷胱甘肽還原酶(GR)活性，從而能夠降低農藥殘留[7]。有關外源EBR對農藥多菌靈(CBD)脅迫下葡萄植株抗氧化系統(tǒng)的影響尚少見研究報道。本試驗以歐亞種釀酒葡萄(VitisviniferaL.)赤霞珠(Cabernet Sauvignon)為試材，研究EBR預處理對CBD脅迫下葡萄植株抗氧化系統(tǒng)的影響，以期明確外源EBR對CBD脅迫下葡萄植株的生理調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年在陜西楊凌西北農林科技大學葡萄酒學院日光溫室及中心實驗室進行，供試品種為歐亞種釀酒葡萄(VitisviniferaL.)赤霞珠(Cabernet Sauvignon)2 a生葡萄盆栽苗。2017年6月進行塑料盆扦插育苗，盆高18 cm、盆口外徑26 cm、盆口內徑24 cm、盆底直徑14 cm，盆中營養(yǎng)土重量約5 kg，營養(yǎng)土配方為原土(V)∶珍珠巖(V)∶腐殖質(V)=2∶1∶1。2017年12月移至西北農林科技大學楊凌區(qū)試驗農場溫室中進行正常管理。2018年4月中旬當赤霞珠葡萄盆栽苗生長至10～12片完全展開葉時，選擇生長狀況基本一致的盆栽苗進行試驗處理。

EBR購自加拿大TRC公司；多菌靈可濕性粉劑(50%)購自四川國光農化股份有限公司。

1.2 試驗設計

本試驗共設CK、稀釋800倍CBD、0.3 mg·L-1EBR+稀釋800倍CBD 3種處理，每種處理3個重復，每個重復5株葡萄苗。試劑使用濃度和采樣時間根據(jù)課題組關于EBR處理對葡萄盆栽苗的影響研究而定[3, 8]。噴施前EBR和CBD都先用98%的乙醇溶解，再稀釋到試驗設置濃度，并使乙醇最終含量為0.1%(v/v)，同時加入終濃度0.1%(v/v)的吐溫-80，配好的EBR溶液和CBD溶液避光冷藏保存。清水中也加入同樣體積的98%乙醇和吐溫-80。試驗選在晴朗、無風且日照較弱的下午進行，首先分別對CK、CBD與EBR+CBD處理組葡萄盆栽苗葉片噴施清水、清水、0.3 mg·L-1EBR，間隔24 h后再分別對上述各處理組葡萄盆栽苗葉片噴施清水、稀釋800倍CBD、稀釋800倍CBD。各處理用容量0.8 L的噴壺噴施葡萄盆栽苗所有葉片的正、反兩面，以葉面滴水為止。記多菌靈處理當天為第0天，分別在多菌靈處理后的第1、3、5、7、9天采樣，每株葡萄苗選取其2～6節(jié)位長勢相同的葉片隨機采樣，采集的葉片去除主葉脈后剪成細絲狀，每個樣品混合均勻后放入-40℃冰箱中保存?zhèn)溆?，用于各項指標的測定。

1.3 測定指標與方法

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析，并用鄧肯氏法進行多重比較，對于同一個測定指標，分析同一時間點上3個處理之間的差異顯著性，用不同小寫字母表示(P<0.05)，圖中的短線代表標準誤。

2 結果與分析

2.1 EBR對CBD處理下葡萄葉片含量的影響

2.2 EBR對CBD處理下葡萄葉片GSH和AsA含量的影響

從圖2可以看出，CBD處理的葡萄葉片GSH含量與對照相比無顯著變化；與CBD處理相比，除第1天和第9天外，EBR+CBD處理使葡萄葉片GSH含量顯著升高，平均比CBD處理升高5.46%。

在整個處理過程中，與對照相比，CBD處理使葡萄葉片AsA含量略微升高，平均比對照升高2.52%；與CBD處理相比，除第1天外，EBR+CBD處理使葡萄葉片AsA含量顯著升高，平均比CBD處理升高24.92%。說明0.3 mg·L-1EBR預處理可顯著提高農藥脅迫下葡萄葉片的抗氧化物質含量，提高葡萄盆栽苗對農藥的抗性。

2.3 EBR對CBD處理下葡萄葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3可以看出，在整個處理過程中，與對照相比，CBD處理使葡萄葉片CAT、POD活性顯著增強；除第1天和第9天外，CBD處理使葡萄葉片GR活性顯著高于對照；與CBD處理相比，EBR+CBD處理使葡萄葉片CAT、GR活性分別在處理5天后和處理3～7 d顯著增強，平均比CBD處理分別升高17.15%、5.33%；除第7天外，EBR+CBD處理與CBD處理的葡萄葉片POD活性均無顯著差異。該結果表明0.3 mg·L-1EBR預處理主要通過增加抗氧化酶CAT、GR的活性來有效增強葡萄盆栽苗對農藥多菌靈的抗性，但對POD的活性影響不顯著。

3 討 論

3.1 外源EBR處理降低CBD脅迫下葡萄活性氧類物質含量

3.2 外源EBR處理提高CBD脅迫下葡萄葉片抗氧化物質含量

植物體內ROS的清除主要依靠兩套抗氧化系統(tǒng)：一類是抗氧化物質, 另一類是抗氧化酶系統(tǒng)[17]。GSH和AsA是植物體內重要的抗氧化物質，它們能夠與ROS反應直接清除ROS或作為抗氧化酶的底物間接清除ROS[8]，從而降低植物細胞內活性氧自由基的含量，避免過多的ROS物質對植物造成傷害。已有研究表明外源EBR處理可以提高農藥百菌清[3]、低溫[4]等非生物脅迫下葡萄抗氧化物質GSH和AsA的含量，提高葡萄植株的抗性。本試驗中用稀釋800倍的CBD處理使葡萄盆栽苗葉片中GSH和AsA的含量升高，可能因為該濃度的農藥刺激了葡萄體內的防御機制，從而產(chǎn)生更多的保護物質。EBR預處理后進一步提高了葡萄葉片中GSH和AsA的含量，這與吳雪霞[15]、彭小琴[3]等的研究一致，說明外源EBR可以通過提高葡萄盆栽苗葉片內抗氧化物質GSH和AsA的含量而增強其對農藥脅迫的抗性。

3.3 外源EBR處理提高CBD脅迫下葡萄葉片抗氧化酶活性

抗氧化酶系統(tǒng)是植物遭受環(huán)境脅迫時重要的防御系統(tǒng)，CAT、POD和GR是植物體內主要的抗氧化酶，POD與CAT共同作用消除植物細胞內過多H2O2，GR活性的增強促進抗氧化物質GSH含量的升高[18]，它們之間的協(xié)同作用可以防止活性氧自由基對細胞膜造成傷害, 抑制膜脂過氧化, 減輕逆境脅迫對植物的傷害[19-20]?？芙瓭萚21]研究表明，外源EBR可顯著增加NaCl鹽脅迫下紫花苜蓿幼苗根系的抗氧化酶活性；在低溫脅迫下，外源EBR處理可顯著增強葡萄幼苗的抗氧化酶活性[4]，提高植物的抗性。本試驗中CBD處理使葡萄葉片抗氧化酶CAT、POD、GR活性顯著增強，可能經(jīng)稀釋800倍的CBD處理刺激了葡萄盆栽苗的應激保護功能，通過提高抗氧化酶的活性保護細胞免受氧化損害；與單獨CBD處理相比，EBR+CBD處理進一步增強了抗氧化酶CAT、GR的活性，但對POD活性作用效果不明顯，說明EBR預處理可能主要通過增加葡萄抗氧化酶CAT、GR的活性來有效增強葡萄盆栽苗對農藥多菌靈的抗性。

4 結 論