劉凌 沈偉敏 郭琦琪

肝癌（hepatic carcinoma）是我國最常見的惡性腫瘤之一。我國每年因原發(fā)性肝癌死亡42.2萬例，約占全球50%，其不良預(yù)后與早期轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有關(guān)，因此研究肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制至關(guān)重要[1-3]。本研究團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中人硫酸酯酶-1（Hsulf-1）mRNA和蛋白表達(dá)水平較癌旁組織均明顯降低，且在肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC7221等中Huslf-1表達(dá)較正常細(xì)胞系LO2低，提示Hsulf-1與肝癌細(xì)胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，然而Hsulf-1在肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的具體作用機(jī)制仍不甚明確[4-5]。此外目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（PI3K/AKT）信號通路與肝癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[6-9]。因此本研究將進(jìn)一步探討Hsulf-1介導(dǎo)PI3K/AKT信號通路抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞系SMMC7221細(xì)胞購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；pcDNA 3.1（+）-Hsulf-1、Hsulf-1 siRNA質(zhì)粒均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。TaKaRa RNA PCR KIT（AMV）Ver.3.0試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司；內(nèi)參GAPDH、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）基因引物均購自上海生工生物工程有限公司，一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，二抗購自美國馬里蘭州KPL公司；Trizol試劑、DMEM、G418、FBS、細(xì)胞裂解液、LY294002、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、LipofectamineTM2000試劑均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 采用胰蛋白酶消化生長狀態(tài)良好的SMMC7221細(xì)胞，計數(shù)后分別接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，待細(xì)胞生長至70%～80%時，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為Hsulf-1過表達(dá)組、Hsulf-1 siRNA組、抑制劑組和空白組。Hsulf-1過表達(dá)組：將 pcDNA 3.1（+）-Hsulf-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SMMC7221細(xì)胞中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染 6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；Hsulf-1 siRNA組：成功構(gòu)建的Hsulf-1 siRNA按照LipofectamineTM2000試劑盒操作說明書，轉(zhuǎn)染至SMMC7221細(xì)胞中；抑制劑組：SMMC7221細(xì)胞加入AKT抑制劑LY294002；空白組：培養(yǎng)良好的SMMC7221細(xì)胞，不作其他處理。

1.3 E-cadherin和β-catenin mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，接著測定RNA純度及含量。根據(jù)GeneBank設(shè)計引物，后者作為內(nèi)參照。E-cadherin的上游引物:5′-TGAAGGTGACAG AGCCTCTGGAT-3′，下游引物：5′-TGGGTGAATTCGG GCTTGTT-3′；β-catenin 的上游引物：5′-AAGGTCTGAG GAGCAGCTTC-3′，下游引物：5′-TGGACCATAACTGCA GCCTT-3′；內(nèi)參照 GAPDH 的上游引物：5′-AGTCAAC GGATTTGGTCGT-3′，下游引物：5′-TTGATTTTGGAGG GATCTG-3′。嚴(yán)格按照 TaKaRa RNA PCR KIT（AMV）Ver.3.0試劑盒操作說明書進(jìn)行相關(guān)步驟操作，最終反應(yīng)產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，在染色后使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相并定量分析。

1.4 Hsulf-1、磷酸化 AKT（p-AKT）、E-cadherin 和 βcatenin蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，通過細(xì)胞裂解液來裂解細(xì)胞，并提取蛋白，采用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定相關(guān)蛋白濃度，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后再轉(zhuǎn)印硝酸纖維素薄膜（PVDF）上，在用封閉液稀釋一抗后（包括Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin 以及 β-catenin）過夜，PBST漂洗后，再浸洗3次，每次5 min，加入二抗4℃下1 h，漂洗后吸干，應(yīng)用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行結(jié)果的顯影顯色，標(biāo)定Marker后拍照分析，并以β-actin作為內(nèi)參照。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)法。將轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1（+）-Hsulf-1質(zhì)粒后的Hsulf-1過表達(dá)組、Hsulf-1 siRNA組、抑制劑組（加入10 μmol/L LY294002）以及空白組SMMC7221細(xì)胞用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。對數(shù)生長期的細(xì)胞用2 mol/L乙二胺四乙酸//PBS緩沖液消化，PBS洗滌1次，用無血清0.1%BSADMEM重懸成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml。每孔200 μl細(xì)胞懸液均勻接種于上室，下室加入5%FBS-DMEM培養(yǎng)基 500 μl，在 37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出后PBS洗，并用棉簽去除上室的表面細(xì)胞以及Matrigel凝膠，然后下室細(xì)胞使用4%多聚甲醇進(jìn)行固定，染色后PBS洗兩遍，并于光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個視野計算遷移細(xì)胞數(shù)平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組E-cadherin和β-catenin mRNA表達(dá)水平比較 Hsulf-1過表達(dá)組E-cadherin和β-catenin mRNA表達(dá)水平均明顯高于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；Hsulf-1 siRNA組、抑制劑組 E-cadherin和β-catenin mRNA表達(dá)水平均明顯低于空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 各組E-cadherin和β-catenin mRNA表達(dá)水平比較

圖1 各組E-cadherin和β-cateninmRNA表達(dá)的電泳圖（E-cadherin為上皮鈣黏蛋白；β-catenin為β-連環(huán)蛋白；a：Hsulf-1 siRNA組；b：抑制劑組；c：空白組；d：Hsulf-1 過表達(dá)組）

2.2 各組 Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin和 β-catenin 蛋白表達(dá)水平比較 與空白組比較，Hsulf-1過表達(dá)組Hsulf-1、E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯為高，p-AKT均明顯為低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；Hsulf-1 siRNA組p-AKT蛋白表達(dá)水平明顯為高，Hsulf-1、E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯為低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；抑制劑組p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯為低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與Hsulf-1 siRNA組比較，抑制劑組p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白表達(dá)水平均明顯為低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見圖 2、3。

圖2 Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin和β-catenin蛋白相對表達(dá)水平比較（Hsulf-1為人硫酸酯酶-1；p-AKT為磷酸化AKT；E-cadherin為上皮鈣黏蛋白；β-catenin為β-連環(huán)蛋白；與空白組比較，*P＜0.05；與 Hsulf-1 siRNA 組比較，△P＜0.05）

圖3 各組 Hsulf-1、p-AKT、E-cadherin和 β-catenin蛋白表達(dá)的電泳圖（Hsulf-1為人硫酸酯酶-1；p-AKT為磷酸化AKT；E-cadherin為上皮鈣黏蛋白；β-catenin為 β-連環(huán)蛋白；a：Hsulf-1siRNA 組；b：抑制劑組；c：空白組；d：Hsulf-1 過表達(dá)組）

2.3 各組SMMC7221細(xì)胞遷移能力比較 與空白組比較，Hsulf-1過表達(dá)組、Hsulf-1 siRNA組SMMC7221細(xì)胞遷移數(shù)均明顯為高，抑制劑組SMMC7221細(xì)胞遷移數(shù)明顯為低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與Hsulf-1 siRNA組比較，抑制劑組SMMC7221細(xì)胞遷移數(shù)明顯為低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組SMMC7221細(xì)胞遷移情況（個）

3 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近一半以上肝癌的新發(fā)病例發(fā)生在我國，具有生長快、轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)。因此，研究肝癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機(jī)制對我國的衛(wèi)生健康尤為關(guān)鍵。據(jù)報道，硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）是細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，可以通過硫酸化水平調(diào)控多種細(xì)胞因子信號通路，從而控制細(xì)胞的形成、黏附、增殖和分化等多種功能[10-13]，而Hsulf-1基因被認(rèn)為是HSPGs硫酸化水平的調(diào)控因子，其表達(dá)異?？赏ㄟ^減少HSPGs的硫化作用，調(diào)控相應(yīng)的細(xì)胞因子信號通路，與多種腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如卵巢癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等。Roy等[14]在對卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Hsulf-1集中表達(dá)在細(xì)胞表面，通過瞬時轉(zhuǎn)染Hsulf-1可顯著增加HSPGs中的硫酸葡萄糖胺水平，同時人肝素結(jié)合性表皮生長因子及成纖維細(xì)胞生長因子-2（FGF-2）誘導(dǎo)細(xì)胞因子的磷酸化水平顯著下降，并抑制腫瘤細(xì)胞增殖等，調(diào)控卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。在另外一項(xiàng)對頭頸部鱗狀癌細(xì)胞系SCCHN的研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsulf-1基因能顯著降低FGF-2及肝細(xì)胞生長因子（HGF）介導(dǎo)的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）信號通路的活性，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15-17]。有大量研究顯示，PI3K/AKT信號通路是調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵通路，而AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它能被PI3K依賴的細(xì)胞外信號通路（如與表皮生長因子受體結(jié)合）激活，使其蛋白結(jié)構(gòu)活化，處于磷酸化狀態(tài)[18-20]。被激活的AKT進(jìn)入細(xì)胞，造成細(xì)胞內(nèi)大量底物蛋白磷酸化，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等表型，有研究證實(shí)在肝癌中，AKT信號通路與β-catenin相關(guān)[21-22]。

而在本研究中，筆者證實(shí)在肝癌細(xì)胞SMMC7221中，Hsulf-1過表達(dá)可抑制PI3K/AKT信號通路，并通過PI3K/AKT信號通路提高轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin以及β-catenin的表達(dá)。當(dāng)筆者分別將Hsulf-1表達(dá)質(zhì)粒，Hsulf-1 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞SMMC7221后，AKT磷酸化表達(dá)隨著Hsulf-1表達(dá)增加而減少，而E-cadherin以及β-catenin的表達(dá)則明顯增加，加入AKT抑制劑后，可發(fā)現(xiàn)E-cadherin以及β-catenin的表達(dá)明顯降低，表明AKT信號通路在Hsulf-1抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中起到非常重要的作用。接著，筆者采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)法檢測肝癌SMMC7221細(xì)胞在不同處理下的遷移能力，結(jié)果顯示在Hsulf-1過表達(dá)后，肝癌SMMC7221細(xì)胞的侵襲能力明顯減少，而在加入AKT抑制劑后，Hsulf-1抑制肝癌SMMC7221細(xì)胞的侵襲能力則受到一定影響。

綜上所述，筆者證實(shí)Hsulf-1基因可抑制肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移，且進(jìn)一步闡明了PI3K/AKT信號通路參與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為肝癌轉(zhuǎn)移預(yù)防及治療提供新的方向。