楊會林，溫見翔，閆津津，周麗娜，陳 娟，歐嘉文，黃海靈

北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗科，廣東深圳 518036

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)利用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，使樣品生物分子發(fā)生電離并帶上電荷，帶電荷的生物分子在電場作用下移動，測量移動速度可以得到離子的質(zhì)荷比，繪制成生物分子質(zhì)荷比峰圖。通過分析不同細菌不同的質(zhì)荷比峰圖，可以進行微生物鑒定。質(zhì)譜鑒定已經(jīng)成為微生物實驗室的常規(guī)鑒定手段,相比生化鑒定，質(zhì)譜鑒定有簡便、快速、準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點[1]。目前，臨床微生物實驗室使用的質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)多為法國生物梅里埃VITEK MS系統(tǒng)和德國布魯克Bruker Biotyper。天瑞質(zhì)譜細菌鑒定系統(tǒng)microTyper MS是國內(nèi)研發(fā)的一款質(zhì)譜細菌鑒定系統(tǒng)，目前對其細菌鑒定性能還缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)評估。本研究擬評估國產(chǎn)MALDI-TOF MS系統(tǒng)microTyper MS對革蘭陰性菌的鑒定能力，為今后microTyper MS的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2018年6月至2019年6月北京大學(xué)深圳醫(yī)院臨床分離的革蘭陰性菌及實驗室收藏的革蘭陰性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株。臨床分離革蘭陰性菌中腸桿菌科目細菌2 717株，非發(fā)酵革蘭陰性菌1 536株及其他少見革蘭陰性菌256株。標(biāo)準(zhǔn)菌株包括大腸埃希菌ATCC8739、大腸埃希菌ATCC35218、大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、產(chǎn)氣克雷伯菌ATCC713048、陰溝腸桿菌ATCC700323、鼠傷寒沙門菌血清型ATCC14028、銅綠假單胞菌ATCC27853、嗜麥芽窄食單胞菌ATCC717666、流感嗜血桿菌ATCC10211/ATCC49247、侵蝕艾肯菌ATCC BAA-1152。

1.2儀器與試劑 microTyper MS(江蘇天瑞儀器股份有限公司)，所用數(shù)據(jù)庫為V1.6.0.10版本；VITEK MS系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)，所用數(shù)據(jù)庫為V3.0版本。兩個系統(tǒng)細菌鑒定使用試劑均為儀器配套試劑。

1.3方法 臨床標(biāo)本培養(yǎng)分離純化后，采用VITEK MS系統(tǒng)及microTyper MS鑒定。標(biāo)準(zhǔn)菌株傳代后進行同步鑒定。操作及質(zhì)量控制參照儀器使用說明書及文獻[2-3]。當(dāng)兩種系統(tǒng)鑒定結(jié)果出現(xiàn)不一致，或均鑒定不出結(jié)果時，采用生化方法或16s rDNA測序進行驗證。對于不易區(qū)分的復(fù)合群，如陰溝腸桿菌復(fù)合群(陰溝腸桿菌、阿氏腸桿菌、霍氏腸桿菌、路氏腸桿菌等)、鮑曼不動桿菌復(fù)合群(鮑曼不動桿菌、皮特不動桿菌、醫(yī)院不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌等)、洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合群(洋蔥伯克霍爾德菌、新洋蔥伯克霍爾德菌等)、無色桿菌復(fù)合群(木糖氧化無色桿菌、反硝化無色桿菌等)、沙門菌群等，如果系統(tǒng)對復(fù)合群細菌鑒定到種，且兩系統(tǒng)結(jié)果不一致，則需要進行驗證。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel2007軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1細菌鑒定總體情況 標(biāo)準(zhǔn)菌株中除鼠傷寒沙門菌外，其余菌株VITEK MS系統(tǒng)及microTyper MS均能準(zhǔn)確鑒定到種水平。臨床分離菌株共鑒定4 509株革蘭陰性菌，159株鑒定結(jié)果不一致。以生化鑒定方法和16s rDNA測序驗證后，VITEK MS系統(tǒng)準(zhǔn)確鑒定4 419株，準(zhǔn)確率為98.0%；microTyper MS準(zhǔn)確鑒定4 405株，準(zhǔn)確率為97.7%。

2.2腸桿菌目細菌鑒定情況 VITEK MS系統(tǒng)主要對部分檸檬酸桿菌屬(12/65)和變形桿菌屬(2/94)不能進行屬內(nèi)區(qū)分，對部分埃希菌屬(3/1 018)、克雷伯菌屬(3/1 172)、檸檬酸桿菌屬(3/65)鑒定無結(jié)果或鑒定錯誤；而microTyper MS對部分埃希菌屬(4/1 018)、克雷伯菌屬(7/1 172)、變形桿菌屬(4/94)、檸檬酸桿菌屬(3/65)、多源桿菌屬(4/17)鑒定無結(jié)果或鑒定錯誤。見表1。

表1 腸桿菌目細菌鑒定結(jié)果(n)

2.3非發(fā)酵革蘭陰性菌鑒定情況 對非發(fā)酵革蘭陰性菌，VITEK MS系統(tǒng)對部分莫拉菌屬(3/63)只能鑒定到屬，對部分假單胞菌屬(9/603)、不動桿菌屬(22/546)、伯克霍爾德菌屬(3/30)、代爾夫特菌屬(6/16)、金黃桿菌屬(2/13)鑒定無結(jié)果或鑒定錯誤；而microTyper MS對部分假單胞菌屬(20/603)、伯克霍爾德菌屬(2/30)、無色桿菌屬(3/19)、金黃桿菌屬(2/13)鑒定無結(jié)果或鑒定錯誤。見表2。

表2 非發(fā)酵革蘭陰性菌鑒定結(jié)果(n)

2.4少見革蘭陰性菌鑒定情況 對少見革蘭陰性菌，VITEK MS系統(tǒng)對部分嗜血桿菌屬(2/218)、全部氣單胞菌屬(15/15)只能鑒定到屬，對部分嗜血桿菌屬(1/218)、全部布魯菌屬(4/4)未給出鑒定結(jié)果；而microTyper MS對全部氣單胞菌屬(15/15)只能鑒定到屬，對部分嗜血桿菌屬(29/218)、艾肯菌屬(3/7)、弧菌屬(1/3)鑒定錯誤。見表3。部分送16s rDNA測序菌株結(jié)果見表4。

表3 少見革蘭陰性菌鑒定結(jié)果(n)

表4 部分兩個系統(tǒng)鑒定結(jié)果不一致菌株送16s rDNA測序結(jié)果

3 討 論

MALDI-TOF MS通過分析細菌核糖體蛋白譜差異，進行微生物菌種鑒定，在常見細菌和真菌鑒定方面，其鑒定能力不弱于生化鑒定[4]。對于很多不常見微生物，MALDI-TOF MS鑒定能力甚至優(yōu)于生化鑒定[5]，相比生化鑒定，其鑒定更加簡便、快速，較傳統(tǒng)的生化鑒定早1～2 d得到鑒定結(jié)果[6-7]，臨床可以提前根據(jù)本地區(qū)細菌耐藥趨勢，做出診療調(diào)整，節(jié)省治療費用，減少因不合理使用抗菌藥物導(dǎo)致的細菌耐藥。MALDI-TOF MS除了細菌鑒定，還能用于細菌藥敏試驗、流行病學(xué)調(diào)查、蛋白質(zhì)檢測、核酸檢測等，具有廣闊應(yīng)用前景[8-11]。目前，國內(nèi)臨床微生物實驗室使用的質(zhì)譜細菌鑒定系統(tǒng)多為進口質(zhì)譜系統(tǒng)，其具有較完善的數(shù)據(jù)庫，但因病原微生物流行情況存在地域分布差異，需要驗證其對國內(nèi)細菌的鑒定性能。隨著我國科技的發(fā)展，研制出多款國產(chǎn)質(zhì)譜細菌鑒定系統(tǒng)[12]。國產(chǎn)質(zhì)譜系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建基于國內(nèi)流行細菌的蛋白譜，相比進口設(shè)備，在國內(nèi)細菌鑒定方面具有一定優(yōu)勢。但國產(chǎn)質(zhì)譜系統(tǒng)因起步較晚，在數(shù)據(jù)庫方面還需進一步完善，在臨床微生物實驗室使用較少，細菌鑒定能力還需進一步驗證。

革蘭陰性菌是國內(nèi)臨床微生物實驗室分離的主要病原菌，占70%左右[13]，設(shè)備能否準(zhǔn)確鑒定革蘭陰性菌，對該設(shè)備是否能應(yīng)用到臨床細菌鑒定具有重要參考價值。本研究結(jié)果顯示，在鑒定準(zhǔn)確率方面，microTyper MS與VITEK MS系統(tǒng)在革蘭陰性菌鑒定方面具有相近的準(zhǔn)確率(VITEK MS系統(tǒng)準(zhǔn)確率為98.0%，microTyper MS準(zhǔn)確率為97.7%)。VITEK MS系統(tǒng)對部分檸檬酸桿菌屬、全部氣單胞菌屬、部分莫拉菌屬只能鑒定到屬，對部分不動桿菌屬、假單胞菌屬、代爾夫特菌屬無鑒定結(jié)果，而microTyper MS對氣單胞菌屬只能鑒定到屬，對部分變形桿菌屬、多源桿菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬有較多鑒定錯誤。兩種系統(tǒng)對傳統(tǒng)不易區(qū)分的復(fù)合群如陰溝腸桿菌復(fù)合群、鮑曼不動桿菌復(fù)合群、洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合群、無色桿菌屬復(fù)合群、沙門菌群等，大部分不能鑒定到屬，對上述細菌的鑒定能力還有待加強。本研究顯示，與進口質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)VITEK MS系統(tǒng)相比，microTyper MS對革蘭陰性菌具有相似的鑒定能力。對部分革蘭陰性菌如金黃桿菌屬、布魯菌屬、艾肯菌屬、弧菌屬、二氧化碳噬纖維菌屬，因臨床少見，故納入比對菌株較少，對這些細菌的鑒定能力，還需進一步驗證。革蘭陰性菌是國內(nèi)臨床微生物實驗室檢出的主要病原菌。本研究結(jié)果顯示，對革蘭陰性菌，國產(chǎn)質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)microTyper MS具有與進口質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)VITEK MS系統(tǒng)相似的鑒定準(zhǔn)確率。對一些少見革蘭陰性菌，還需用更多菌株來驗證國產(chǎn)質(zhì)譜系統(tǒng)的鑒定性能。