李雪媛，常 紅，邢惠娟，劉曉琳

遼寧省大連市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科一病房，遼寧大連 116033

急性缺血性腦卒中(AIS)是最常見的卒中類型，占我國(guó)腦卒中的69.6%～70.8%[1]。輕度認(rèn)知功能障礙是介于正常衰老和癡呆(AD)之間的一種中間狀態(tài)，其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而升高[2]。AIS常伴有認(rèn)知功能障礙甚至癡呆。miRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的由22～25個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，在體內(nèi)發(fā)揮多種生物學(xué)功能，可作為進(jìn)行性疾病診斷與預(yù)后判斷的重要生物標(biāo)志物。研究表明，miRNAs與AIS患者認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度有關(guān)[3]。miR-219是一種常見的miRNAs，研究表明，腎臟纖維化患者血清中 miR-219 水平明顯降低[4]。miR-219在AIS患者中的研究報(bào)道不多，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)185例AIS患者血清中miR-219 情況，探討miR-219與AIS患者輕度認(rèn)知功能障礙的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年11月至2019年10月在本院神經(jīng)內(nèi)科住院的185例AIS患者為研究對(duì)象，其中男100例，女85例；年齡46～69歲，平均(55.6±7.9)歲。AIS患者按照認(rèn)知功能評(píng)價(jià)分為輕度認(rèn)知功能障礙組和無認(rèn)知功能障礙組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》[1]中AIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)發(fā)病至入院就診時(shí)間<24 h；(3)進(jìn)行1.5T或3.0MRI檢查；(4)患者自愿參與本研究，并簽署知情同意書，能完成臨床記錄者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有重度認(rèn)知功能障礙；(2)合并其他心血管疾??；(3)有惡性腫瘤；(4)臨床資料不全。另選取體檢健康者170例作為對(duì)照組，其中男92例，女78例；年齡46～69歲，平均(60.1±8.8)歲。

1.2儀器與試劑 Trizol 抽提試劑盒購自美國(guó) Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix購自南京Vazyme生物科技股份有限公司；miR-219及U6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)與合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 血清樣品：采集AIS患者與健康體檢者空腹靜脈血5 mL，常溫3 000 ×g離心10 min后收集血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2認(rèn)知功能的判斷 由神經(jīng)科醫(yī)生對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行認(rèn)知功能評(píng)價(jià)。輕度認(rèn)知功能障礙判斷標(biāo)準(zhǔn)：參考田金洲主編的《中國(guó)癡呆診療指南(2017年)》中有關(guān)輕度認(rèn)知障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并運(yùn)用簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查表(MMSE)、蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表(MoCA)[5]、日常生活功能量表(ADL)等進(jìn)行認(rèn)知功能測(cè)評(píng)。根據(jù)認(rèn)知功能評(píng)價(jià)將AIS患者分為輕度認(rèn)知功能障礙組和無認(rèn)知功能障礙組。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清miR-219 水平 采用 Trizol抽提試劑盒提取血清中總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組研究對(duì)象血清中miR-219 水平。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)miR-219進(jìn)行擴(kuò)增。miR-219正向引物：5′-CCGCCCCGGGCCGCGGCUCC-3′，反向引物：5′-GCCCCCAAACCUCGAGCGGG-3′；內(nèi)參U6正向引物：5′-GCAGTGCTTAGCTGGTTGT-3′，反向引物：5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系共20 μL：AceQ qPCR SYBR?Green Mix 8 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 45 s，95 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)血清miR-219水平進(jìn)行定量分析，重復(fù)3次取平均值。

1.3.4其他臨床資料收集 對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行三酰甘油(TG)、總膽固醇 (TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)檢測(cè)，并收集高血壓病史、飲酒史、吸煙史等臨床資料。中國(guó)缺血性腦卒中亞型(CISS)分型參考文獻(xiàn)[6]。

2 結(jié) 果

2.1各組研究對(duì)象一般情況比較 185例AIS患者中有輕度認(rèn)知功能障礙95例，無認(rèn)知功能障礙組90例。輕度認(rèn)知功能障礙組中糖尿病比例明顯高于無認(rèn)知功能障礙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；輕度認(rèn)知功能障礙組和無認(rèn)知功能障礙組性別，年齡，有吸煙、飲酒史比例，有高血壓、冠心病、腦卒中、心肌梗死基礎(chǔ)疾病比例，CISS 分型比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組研究對(duì)象一般情況比較

組別n基礎(chǔ)疾病[n(%)]高血壓糖尿病冠心病腦卒中心肌梗死CISS分型[n(%)]大動(dòng)脈粥樣硬化心源性卒中穿支動(dòng)脈病變其他原因不明原因有輕度認(rèn)知功能障礙組9554(56.8)40(42.1)32(33.7)28(29.5)7(7.4)55(57.9)15(15.8)17(17.9)6(6.3)2(2.1)無認(rèn)知功能障礙組9042(46.7)25(32.2)23(25.6)21(23.3)3(3.3)50(55.6)16(17.8)21(23.3)2(2.2)1(1.1)對(duì)照組170——————————χ2/F1.9174.1631.4620.8981.4722.892P0.1660.0410.2270.3440.2250.576

2.2各組研究對(duì)象血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、FPG、miR-219 水平比較 輕度認(rèn)知功能障礙組、無認(rèn)知功能障礙組血清中miR-219水平明顯高于對(duì)照組，且輕度認(rèn)知功能障礙組血清中miR-219 水平明顯高于無認(rèn)知功能障礙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而3組間血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、FPG水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組研究對(duì)象血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C、FPG、miR-219 水平比較

2.3AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的影響因素分析 將單因素分析中P<0.2的變量進(jìn)一步納入二分類Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，糖尿病、血清miR-219水平高是AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表3。

表3 AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的影響因素分析

2.4血清miR-219水平對(duì)AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的預(yù)測(cè)價(jià)值 血清miR-219水平預(yù)測(cè)AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的ROC曲線下面積為0.818(95%CI：0.755～0.871)，最佳截?cái)嘀禐?.34，靈敏度為68.42%，特異度為82.22%，見圖1。

圖1 血清miR-219水平預(yù)測(cè)AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的ROC曲線分析

3 討 論

AIS患者認(rèn)知功能障礙主要與血管閉塞或血流量減少導(dǎo)致腦細(xì)胞缺乏氧氣和營(yíng)養(yǎng)有關(guān)。AIS患者認(rèn)知功能障礙是受多基因調(diào)控的過程，涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、多種細(xì)胞因子的變化[7-8]。miRNAs 是一類真核生物內(nèi)源性小分子單鏈 RNA，通過與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)特異性結(jié)合，參與神經(jīng)系統(tǒng)不同信號(hào)通路基因調(diào)控，在學(xué)習(xí)與記憶功能中起重要作用，也用于血管性癡呆患者早期診斷[9]。袁梅等[10]研究結(jié)果表明，AIS 患者血清 miR-335水平明顯下降，與腦卒中后患者病情密切相關(guān)。謝尊椿等[11]研究表明，AIS患者血漿miR-124水平明顯降低，其水平與腦梗死面積及美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所腦卒中評(píng)分(NIHSS)呈負(fù)相關(guān)。由此可見，多種miRNAs與AIS病情進(jìn)展有關(guān)。

miR-219是常見的miRNA之一，廣泛存在于各種細(xì)胞、組織中。多項(xiàng)研究表明，miR-219在多種病變組織、腫瘤中均異常表達(dá)，參與多種信號(hào)通路，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，可作為多種疾病早期診斷、治療靶點(diǎn)或預(yù)后監(jiān)測(cè)的指標(biāo)[12-13]。本研究結(jié)果表明，miR-219在AIS患者血清中高表達(dá)，提示 miR-219可能與AIS發(fā)病有關(guān)。本研究結(jié)果表明，輕度認(rèn)知功能障礙組AIS患者血清中miR-219水平明顯高于無認(rèn)知功能障礙組，表明miR-219水平可能與AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙有關(guān)。

AIS患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生機(jī)制較復(fù)雜，但血清中一些標(biāo)志物的變化可為早期診斷及治療提供參考。一般認(rèn)為，血液循環(huán)中的 miRNA 主要來源于體內(nèi)凋亡或壞死的細(xì)胞，或者來源于細(xì)胞的主動(dòng)釋放及循環(huán)細(xì)胞的裂解等。miRNA可以通過血腦屏障，腦組織中miRNA水平與血清中miRNA水平變化是一致的。miR-219可能來源于受損的腦組織，有望通過檢測(cè)血清中 miR-219水平預(yù)測(cè)AIS的發(fā)生與進(jìn)展。缺血性腦卒中是腦卒中最常見的類型，不健康的生活方式，如吸煙、飲酒等因素，以及高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)疾病因素可能均影響腦卒中的發(fā)生、發(fā)展。本研究分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病、血清miR-219水平高是AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示有上述因素AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙風(fēng)險(xiǎn)較高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-219水平預(yù)測(cè)AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙的ROC曲線下面積為0.818，最佳截?cái)嘀禐?.34，提示血清miR-219水平對(duì)于AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，miR-219在AIS患者血清中高表達(dá)，且在有輕度認(rèn)知功能障礙的AIS患者血清中表達(dá)更高，對(duì)AIS患者發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。由于本研究臨床資料少，miR-219在AIS患者認(rèn)知功能障礙發(fā)生過程中的具體作用機(jī)制尚未明確，仍需進(jìn)一步研究。