張方圓，王李平，潘云山，朱大林，李雪瑩

（廣東省科學(xué)院 廣東省測試分析研究所（中國廣州分析測試中心）廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室 廣東省保健食品功效成分檢測與風(fēng)險物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心，廣州510070）

0 引言

二十碳四烯酸（arachidonic acid,ARA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid,DHA）是人體必需的不飽和脂肪酸，在嬰幼兒的生長發(fā)育中有重要作用，參與腦細胞的形成和發(fā)育，提升嬰幼兒的智力發(fā)育水平和視力敏銳度[1]。目前，主要采用GB 5009.168-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪酸的測定》[2]來測定嬰幼兒食品中ARA和DHA含量。

測量不確定度是表征測量結(jié)果準(zhǔn)確度的參數(shù)，是衡量檢測結(jié)果質(zhì)量的重要指標(biāo)[3-4]。通過對不確定度的分析和評定，可以找出影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵步驟，從而提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[5-7]。本文采用GB 5009.168-2016第一法測定了嬰幼兒乳粉中ARA和DHA的含量，并按照《CNAS-GL006:2019分析化學(xué)中不確定度的評估指南》[8]建立測量過程的數(shù)學(xué)模型，分析不確定來源，評定測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴展不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

十一碳甘油三酯，NU-CHEK PREP,INC；混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品40項，NU-CHEK PREP,INC；無水乙醇（色譜純），廣州化學(xué)試劑廠；乙醚（色譜純），廣州化學(xué)試劑廠；石油醚Ⅰ（色譜純），廣州化學(xué)試劑廠；甲醇（色譜純），廣州化學(xué)試劑廠；正庚烷（色譜純），廣州化學(xué)試劑廠；三氟化硼甲醇溶液(濃度為14%），上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent GC 7820A氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；HP-88色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25μm），美國安捷倫科技有限公司；Sartorius BT125D電子天平，賽多利斯工業(yè)稱重設(shè)備（北京）有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；0XW-80A旋渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗原理

依據(jù)GB 5009.168-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測定》第一法內(nèi)標(biāo)法測定嬰幼兒乳粉中ARA和DHA含量。該方法的原理如下：加入內(nèi)標(biāo)物的試樣經(jīng)水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后，在堿性條件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯，經(jīng)氣相色譜分析，內(nèi)標(biāo)法定量測定脂肪酸甲酯的含量。依據(jù)ARA和DHA甲酯含量和轉(zhuǎn)換系數(shù)計算出ARA和DHA的含量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取脂肪酸甲酯混標(biāo)0.16476 g用正庚烷定容于25.0 mL容量瓶(A級)中，制成質(zhì)量濃度6.524 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（共分為50個均量單位，每個單位為0.1305 mg/mL）。

十一烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱十一碳酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品0.08234 g用甲醇定容于50.0 mL容量瓶(A級)中，制成1.630 mg/mL的十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.3 樣品的處理

試樣的稱?。簻?zhǔn)確稱取均勻試樣1 g(精確至0.0001 g)，于250 mL容量瓶中，準(zhǔn)確加入2.0 mL十一烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液。加入約100 mg焦性沒食子酸，加入幾粒沸石，再加入2 mL 95%乙醇和4 m L水，混勻。

試樣的水解：采用酸水解法：加入鹽酸溶液10 mL，混勻。將燒瓶放入80℃水浴中水解40 min。每隔10 min振蕩一下燒瓶，使黏附在燒瓶壁上的顆粒物混入溶液中。水解完成后，取出燒瓶冷卻至室溫。

脂肪提取：水解后的試樣，加入10 mL 95%乙醇，混勻。將燒瓶中的水解液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用50 mL乙醚石油醚混合液沖洗燒瓶和塞子，沖洗液并入分液漏斗中，加蓋。振搖5 min，靜置10 min。將醚層提取液收集到250 mL燒瓶中。按以上步驟重復(fù)提取水解液3次，最后用乙醚石油醚混合液沖洗分液漏斗，并收集到250 mL燒瓶中。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘留物為脂肪提取物。

脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化：在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8 mL，連接回流冷凝器，80℃水浴上回流，直至油滴消失。從冷凝器上端加入7 mL三氟化硼甲醇溶液，在80℃水浴中繼續(xù)回流2 min。用少量水沖洗冷凝器。停止加入，從水浴上取下燒瓶，迅速冷卻至室溫。準(zhǔn)確加入25 mL正庚烷，振搖2 min，再加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層。吸取上層正庚烷提取溶液大約5 mL，至25 mL試管中，加入大約3～5 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min，吸取上層溶液到進樣瓶中待測定。

1.3.4 色譜條件

載氣：氮氣，流速：0.8 mL/min；空氣：450 mL/min；氫氣：40 m L/min；升溫程序：100℃保持2 min，以10℃/min速率升溫至150℃，再以2℃/min速率升溫至220℃，保持3 min，再以10℃/min速率升溫至230℃，保持1 min；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：270℃；進樣方式：分流進樣，分流比為10∶1；進樣量：1μL。

1.4 ARA、DHA含量計算

嬰幼兒乳粉中ARA、DHA含量的計算公式為：

式中：Xi為試樣中脂肪酸甲酯i的質(zhì)量分數(shù)(mg/100g)；Fi為脂肪酸甲酯i的響應(yīng)因子；Ai為試樣中脂肪酸甲酯i的峰面積；AC11為試樣中加入的內(nèi)標(biāo)物十一碳酸甲酯峰面積；CC11為十一碳酸甘油三酯質(zhì)量濃度(mg/mL)；VC11為試樣中加入十一碳甘油三酯體積(mL)；1.0067為十一碳酸甘油三酯轉(zhuǎn)化成十一碳酸甲酯的轉(zhuǎn)換系數(shù)；FFAME-FA為脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)化成脂肪酸的轉(zhuǎn)換系數(shù)，ARA為0.9560，DHA為0.9590；m為試樣的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

按照數(shù)學(xué)模型和測量方法，分析其不確定度來源有：響應(yīng)因子Fi測定產(chǎn)生的不確定度；樣品稱量m所引入的不確定度；十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液濃度C11產(chǎn)生的不確定度；十一碳酸甘油三酯加入體積V11帶來的不確定度；樣品重復(fù)測量產(chǎn)生的不確定度以及氣相色譜儀器定量誤差產(chǎn)生的不確定度。

2.2 響應(yīng)因子Fi的不確定度分析

取混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6針，根據(jù)十一碳酸甲酯、ARA甲酯、DHA甲酯的濃度和峰面積計算響應(yīng)因子。

響應(yīng)因子Fi的計算公式為

式中：Fi為脂肪酸甲酯i的響應(yīng)因子；CSi為混標(biāo)中各脂肪酸甲酯i的質(zhì)量濃度(mg/mL)；A11為試十一碳酸甲酯峰面積；Ai為脂肪酸甲酯i的峰面積；C11為混標(biāo)中十一碳酸甲酯的質(zhì)量濃度(mg/mL)。因此，F(xiàn)i的相對不確定度urel（Fi）由以下3個分量合成：混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中十一碳酸甲酯引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（IS11），混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中ARA甲酯和DHA甲酯引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（Si），以及測定過程中引入的測量不確定度urel（Fi）。

2.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中十一碳酸甲酯的不確定度分析

準(zhǔn)確稱取脂肪酸甲酯混標(biāo)0.16476 g用正庚烷定容于25.0 mL容量瓶(A級)中，制成6.524 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（共分為50個均量單位，每個單位為0.1305mg/mL）。

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度

脂肪酸甲酯混標(biāo)純度＞99%，可認為其最大允許誤差為1.0%。按均勻分布處理，標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(p11)=0.01/=0.00577%，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：urel(p11)=0.00577/0.99=0.00583。

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量

稱取標(biāo)準(zhǔn)品164.76 mg，所使用的天平，其示值誤差測量結(jié)果的擴展不確定度為0.03 mg(k=2)，重復(fù)性偏差為0.02 mg(由檢定證書提供)。前者的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.03/2=0.015 mg；后者為0.02/1.96=0.0102 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在稱重時應(yīng)重復(fù)計算兩次不確定度(一次為清零時，另一次為最后讀數(shù)時)。因此標(biāo)準(zhǔn)品稱量mstd標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為u(mstd)==0.0257 mg；urel(mstd)==0.000156。

2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程的相關(guān)體積

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置中使用25 mL容量瓶定容。根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[9]規(guī)定，20℃時25 mL容量瓶(A級)的容量允差為±0.03 mL，取矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.017 mL；對典型25 mL容量瓶充滿10次并稱量的實驗，得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.028 mL，即為標(biāo)準(zhǔn)不確定度；容量瓶在20℃校準(zhǔn)，本測試是在25℃的條件下進行的，容量瓶和溶液溫度與校準(zhǔn)時不同所引起的體積變化為±25 m L×5℃×1.24×10-3℃-1=0.000155 mL(1.24×10-3℃-1為正庚烷的體積膨脹系數(shù))，取矩形分布，則溫度對體積的影響所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0000895 mL。溫度效應(yīng)引入的不確定度遠小于校準(zhǔn)和重復(fù)性的不確定度,因此在以下的評定中忽略溫度的影響。則，25 mL容量瓶體積Vflask引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(Vflask)==0.0329 mL；相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(Vflask)==0.00132。

由于混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置中僅使用25 mL容量瓶定容，因此標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程的相關(guān)體積Vstd引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vstd)=urel(Vflask)=0.00132。

綜上所述：混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中十一碳酸甲酯濃度引入的不確定度為

2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中ARA甲酯、DHA甲酯的不確定度分析

準(zhǔn)確稱取脂肪酸甲酯混標(biāo)0.16476 g用正庚烷定容于25.0 mL容量瓶(A級)中，制成質(zhì)量濃度為6.524 mg/m L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（共分為50個均量單位，每個單位為0.1305 mg/mL）。

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度

脂肪酸甲酯混標(biāo)純度＞99%，可認為其最大允許誤差為1.0%。按均勻分布處理，標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(p11)=0.01/=0.00577%相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(p11)=0.00577/0.99=0.00583。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量

稱取標(biāo)準(zhǔn)品164.76 mg，所使用的天平，其示值誤差測量結(jié)果的擴展不確定度為0.03 mg(k=2)，重復(fù)性偏差為0.02 mg(由檢定證書提供)。前者的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.03/2=0.015 mg；后者為0.02/1.96=0.0102 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在稱重時應(yīng)重復(fù)計算兩次不確定度(一次為清零時，另一次為最后讀數(shù)時)。因此標(biāo)準(zhǔn)品稱量mstd標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為u(mstd)=)=0.0257 mg；urel(mstd)==0.000156。

2.2.2.3 校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程的相關(guān)體積

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置中使用25 m L容量瓶定容，由2.2.1.3可知，25 mL容量瓶體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(Vflask)==0.0329 mL；相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(Vflask)==0.00132。

由于混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置中僅使用25 mL容量瓶定容，因此標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程的相關(guān)體積Vstd引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Vstd)=urel(Vflask)=0.00132。

綜上所述：混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中ARA甲酯和DHA甲酯濃度引入的不確定度均為

2.2.3 響應(yīng)因子Fi的測量不確定度

6次測定的ARA甲酯響應(yīng)因子分別為0.9156，0.9088，0.9142，0.9028，0.9186，0.9074；DHA甲酯響應(yīng)因子分別為0.9027，0.8995，0.9013，0.8889，0.8978，0.8948。標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)，分別為

因此，響應(yīng)因子測定產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

2.3 樣品稱量m的不確定度分析

稱樣1 g，天平檢定證書提供的示值誤差測量結(jié)果的擴展不確定度為0.3 mg(k=2)，重復(fù)性偏差為0.1 mg(由檢定證書提供)。前者的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.3/2=0.15 mg；后者為0.1/1.96=0.0510 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在稱重時應(yīng)重復(fù)計算兩次不確定度(一次為清零時，另一次為最后讀數(shù)時)。其標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

2.4 十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液濃度C 11的不確定度

準(zhǔn)確稱十一碳酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品0.08234 g用甲醇定容于50.0 mL容量瓶(A級)中，制成質(zhì)量濃度為1.630 mg/mL的十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度

十一碳酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品純度＞99%，可認為其最大允許誤差為1.0%。按均勻分布處理，標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(p11)=0.01/=0.00577%相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為uret(p11)=0.00577/0.99=0.00583。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量

稱取標(biāo)準(zhǔn)品82.34 mg，所使用的天平，其示值誤差測量結(jié)果的擴展不確定度為0.03 mg(k=2)，重復(fù)性偏差為0.02 mg(由檢定證書提供)。前者的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.03/2=0.015 mg；后者為0.02/1.96=0.0102 mg(取95%置信水平，k=1.96)。在稱重時應(yīng)重復(fù)計算兩次不確定度(一次為清零時，另一次為最后讀數(shù)時)。因此標(biāo)準(zhǔn)品稱量m11標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別

2.4.3 校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與稀釋過程的相關(guān)體積

內(nèi)標(biāo)溶液的配制中使用50 mL容量瓶定容。根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[9]規(guī)定，20℃時50 mL容量瓶(A級)的容量允差為±0.05 mL，取矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.029 mL；對典型50 mL容量瓶充滿10次并稱量的實驗，得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.053 mL，即標(biāo)準(zhǔn)不確定度；容量瓶在20℃校準(zhǔn)，本測試是在25℃的條件下進行的，容量瓶和溶液溫度與校準(zhǔn)時不同所引起的體積變化為±50 m L×5℃×1.10×10-3℃-1=0.00275 mL(1.10×10-3℃-1為正己烷的體積膨脹系數(shù))，取矩形分布，則溫度對體積的影響所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.00159 mL。溫度效應(yīng)引入的不確定度遠小于校準(zhǔn)和重復(fù)性的不確定度,因此在以下的評定中忽略溫度的影響。則，50 m L容量瓶體積Vflask50引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

由于十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液的配置中僅使用50 mL容量瓶定容，因此十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液配置過程的相關(guān)體積V11引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V11)=urel(Vflask50)=0.00121。

綜上所述：十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液濃度引入的不確定度：

2.5 十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液加入體積V的不確定度分析

實驗中，使用2.0 mL分度吸量管準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)2.0 mL。根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》規(guī)定[9]，20℃時0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 mL分度吸量管的容量允差、分布、標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算如表1。

表1 流出式分度吸量管（A級）的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

分別對典型0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 mL分度吸量管充滿10次并稱量的實驗，得標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.0025，0.005，0.008，0.0125，0.0200，0.0500 mL，即標(biāo)準(zhǔn)不確定度。因此2.0 mL分度吸量管合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為=0.0106 mL；=0.0053。因此，十一碳酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液加入體積V引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(V)=0.0053。

2.6 樣品重復(fù)測量產(chǎn)生的不確定度

制樣過程產(chǎn)生的不確定度采用6次樣品測定結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)進行計算。ARA質(zhì)量分數(shù)6次的測定結(jié)果為：48.3、49.6、48.9、49.0、49.2、47.5 mg/100 g，平均質(zhì)量分數(shù)為=48.7 mg/100g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為SARA=0.73 mg/100 g。DHA質(zhì)量分數(shù)6次的測定結(jié)果為：27.4、27.9、27.3、27.9、28.0、27.1 mg/100 g，平均質(zhì)量分數(shù)為xDHA=27.6 mg/100 g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為SDHA=0.35 mg/100 g。重復(fù)測量產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

2.7 GC量校準(zhǔn)

由儀器校準(zhǔn)證書知，GC定量的允差是3%，取矩形分布，則相對不確定度為：urel(Q)=。

2.8 合成不確定度和擴展不確定度

嬰幼兒乳粉中ARA和DHA質(zhì)量分數(shù)測定的不確定度分量如表2所示。

表2 嬰幼兒乳粉中ARA和DHA質(zhì)量分數(shù)測定的不確定度分量

因各分量相互獨立不相關(guān)，因此樣品中ARA和DHA測定結(jié)果的相對合成不確定度為

ARA的質(zhì)量分數(shù)為：XARA=xARA=48.7 mg/100 g；DHA的質(zhì)量分數(shù)為：XDHA=xDHA=27.6 mg/100g。則標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度為：

不確定度各分量按正態(tài)分布處理，取包含因子k=2，置信水平P為95%，所以擴展不確定度為

因此，本次測定的嬰幼兒乳粉樣品中ARA的質(zhì)量分數(shù)為CARA=(48.7±2.2)mg/100 g（k=2，P=95%）；DHA的質(zhì)量分數(shù)為CDHA=(27.6±1.2)mg/100 g（k=2，P=95%）。

3 結(jié) 論

本文按照《CNAS-GL006:2019分析化學(xué)中不確定度的評估指南》對GB 5009.168-2016第一法測定嬰幼兒乳粉中ARA和DHA質(zhì)量分數(shù)的不確定度進行評價。通過對不確定度評定和來源分析可知，本次測定的不確定來源主要為氣相色譜儀的定量誤差及重復(fù)性引入的不確定度。因此，在實驗過程中增加平行測定次數(shù)，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法，規(guī)范操作，并對檢測儀器進行必要的維護，確保儀器的穩(wěn)定狀態(tài)，能夠有效降低實驗結(jié)果的不確定度，提高實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和實驗室的檢測質(zhì)量。