杜林 陸雯麗 劉慶芬 顧芬

如何修復(fù)皮膚缺損、減少瘢痕形成是臨床亟待解決的問題。生物材料的進(jìn)步與發(fā)展有望為解決該問題提供新思路及新策略。其中，明膠已被廣泛地應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域［1－3］。明膠基凝膠允許水溶性添加劑，具有生物可降解性。但是，明膠基凝膠在空氣中因快速干燥而導(dǎo)致硬化，影響其作為創(chuàng)面修復(fù)材料的穩(wěn)定性和耐久性。研究證明，在明膠中加入食品級(jí)添加劑，如糖、甘油、檸檬酸等，不會(huì)損害材料的生物相容性和安全性，可產(chǎn)生具有彈性和韌性的凝膠組合物［4－5］。

我們以明膠為基底，加入可食用甘油，用以增強(qiáng)明膠的熱穩(wěn)定性及保水性，并利用檸檬酸使其交聯(lián)，制備了新型甘油／明膠基水凝膠（GG 水凝膠），研究其生物相容性和修復(fù)皮膚缺損的效果，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

高糖DMEM（Hyclone，美國）；胎牛血清（FBS）、1%的青鏈霉素和胰蛋白酶－EDTA（Thermo Fisher Scientific，美國）；明膠、檸檬酸和甘油（Merck，德國）；CCK－8 試劑（Dojindo，日本）；活死細(xì)胞染色試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）。

多功能酶標(biāo)儀（Tecan Spark，瑞士），共聚焦顯微鏡（Leica，德國）。

1.2 方法

1.2.1 制備GG 水凝膠

將甘油（8 g）溶解在去離子水中（8 g）并加熱至60 ℃。冷卻至室溫后，加入明膠粉末（4 g），浸泡1 h?；旌衔镌?0 ℃的烘箱中真空下攪拌1 h（2 350 r／min，45 kPa），并加入1%檸檬酸以獲得均勻的成膠前液體。澆筑模具中，冷卻即可得到凝膠。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人皮膚成纖維細(xì)胞（HSFs）來源于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下（37 ℃、5%CO2以及飽和濕度），使用含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)到80%融合后傳代。

1.2.3 GG 水凝膠的生物相容性

用CCK－8 法和活／死細(xì)胞染色分別測(cè)定細(xì)胞活力和增殖能力。將1×104個(gè)HSFs 包裹在200μL凝膠中。在培養(yǎng)1 d、3 d 和7 d 時(shí)，將原培養(yǎng)基換成含有CCK－8 試劑的新鮮培養(yǎng)基，并于37 ℃下培養(yǎng)1.5 h。使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm 處的光密度（OD）值。以活死細(xì)胞染色試劑盒在培養(yǎng)7 d 時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 GG 水凝膠修復(fù)皮膚缺損

18 只6 周齡SPF 級(jí)小鼠，雌雄不限，平均體質(zhì)量20 g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

小鼠麻醉后背部備皮，并在背部中間造成直徑10 mm 的全層皮膚缺損。將小鼠隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組（n＝6）、GG 水凝膠治療組（n＝6）和GG 水凝膠＋細(xì)胞治療組（n＝6）。對(duì)照組為空白對(duì)照，不予任何處理；GG 水凝膠治療組：將凝膠前體液200μL涂抹于皮膚缺損創(chuàng)面；GG 水凝膠＋細(xì)胞治療組：將凝膠前體液200μL 與1×104個(gè)HSFs 混合后涂抹于皮膚缺損創(chuàng)面。術(shù)后小鼠全部單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。術(shù)后即刻和術(shù)后11 d 對(duì)創(chuàng)面行大體觀察并拍照，使用Image J 軟件（1.51 版）進(jìn)行創(chuàng)面面積定量分析。

術(shù)后11 d 創(chuàng)面取材，4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋切片，HE 染色［6－7］。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較采用單因素方差分析和Tukey 后分析法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GG 水凝膠的生物相容性

用CCK－8 法測(cè)定凝膠內(nèi)部的HSFs 增殖情況。結(jié)果顯示，術(shù)后7 d 時(shí)的OD 值明顯高于術(shù)后1 d 和3 d 時(shí)（P＜0.001），說明GG 水凝膠內(nèi)部的HSFs 能夠維持增殖。活死細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)表明，超過95%的HSFs 在水凝膠表面存活長達(dá)1 周。上述結(jié)果表明，HSFs 可以在GG 水凝膠內(nèi)生長、增殖，維持其代謝活性，GG 水凝膠具有良好的生物相容性（圖1、2）。

圖2 活死染色法測(cè)定HSFs 在GG 水凝膠內(nèi)部的存活情況（不同方向觀測(cè)到的熒光圖像）Fig.2 Viability of HSFs in GG hydrogel measured by living／dead staining（fluorescent images observed in different directions）

2.2 GG 水凝膠用于皮膚缺損修復(fù)

如圖3 所示，小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面涂抹GG水凝膠前體液后，大體觀察可見各組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均未發(fā)現(xiàn)明顯的感染及其他并發(fā)癥。與對(duì)照組和GG 水凝膠治療組相比，GG 水凝膠＋細(xì)胞治療組傷口愈合明顯更快。定量分析顯示，術(shù)后11 d 時(shí)，GG 水凝膠＋細(xì)胞治療組剩余的創(chuàng)面面積僅為最初面積的8.3%±1.0%，明顯小于對(duì)照組的49.5%±0.9%（P＜0.05）。

圖3 術(shù)后創(chuàng)面大體觀察及創(chuàng)面面積定量分析Fig.3 Gross observation and area quantitative analysis of the wound after operation

為了研究水凝膠的滲透作用和傷口完全閉合后的組織重塑情況，術(shù)后11 d 時(shí)對(duì)創(chuàng)面組織取材并行HE 染色觀察。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠組織中含有少量的新生肉芽組織、新生毛細(xì)血管及膠原蛋白沉積，同時(shí)伴有大量的炎性細(xì)胞；GG 水凝膠治療組中水凝膠發(fā)生了降解，創(chuàng)面新生肉芽組織明顯形成；GG 水凝膠＋細(xì)胞治療組中表皮細(xì)胞分層明顯，排列整齊，表皮和真皮連接緊密，可見毛細(xì)血管増生，血管周圍無明顯炎性細(xì)胞浸潤，并且可觀察到皮脂腺等皮膚附屬器，且成纖維細(xì)胞排列有序，與周圍組織相互交叉。上述證據(jù)表明，GG 水凝膠輸送HSFs 并作為原位形成的皮膚替代物可用于治療皮膚缺損創(chuàng)面（圖4）。

圖4 HE 染色法測(cè)定各組小鼠全層皮膚缺損修復(fù)情況（10×）Fig.4 Repair of full－thickness skin defects in each group determined by HE staining（10×）

3 討論

研究表明，細(xì)胞因子在創(chuàng)面愈合中具有重要作用［8］，而且有效的細(xì)胞輸送方法不僅可提高移植細(xì)胞的存活率，而且對(duì)保持其多能特性和功能狀態(tài)至關(guān)重要。將細(xì)胞混入水凝膠中可以方便地輸送細(xì)胞，且水凝膠可適應(yīng)任意大小、形狀的創(chuàng)面或空腔［9］。本研究中，天然明膠和甘油分子為水凝膠提供了細(xì)胞黏附基質(zhì)。結(jié)果表明，HSFs可以很好地黏附和擴(kuò)散在GG 水凝膠中，保持活力，持續(xù)增殖。體內(nèi)試驗(yàn)我們利用小鼠全層皮膚缺損模型，檢測(cè)GG 水凝膠包裹HSFs 用于治療皮膚缺損的可能性。結(jié)果顯示，含有HSFs 的水凝膠顯著改善了創(chuàng)面的再上皮化，并促進(jìn)了創(chuàng)面閉合。在創(chuàng)面愈合的早期階段，GG 水凝膠有效地抑制了創(chuàng)面中炎性細(xì)胞的浸潤。本研究中，水凝膠在體內(nèi)大約11 d 后有明顯分解，表明其降解速率是適當(dāng)?shù)?，可引?dǎo)宿主成纖維細(xì)胞浸潤到損傷區(qū)域，促進(jìn)顆粒組織形成，可防止過度收縮和纖維化。明膠是一種基質(zhì)金屬蛋白酶敏感的生物降解分子，來源于膠原蛋白。研究表明，明膠水凝膠的降解速度是可調(diào)的，通過優(yōu)化水凝膠的降解速率，相信GG 水凝膠包裹細(xì)胞的治療方法能更好地滿足臨床治療的需要。

綜上所述，本研究構(gòu)建的甘油／明膠基水凝膠具有優(yōu)異的穩(wěn)定性及生物學(xué)性能，有望用于臨床皮膚缺損修復(fù)。