徐曇燁，田元勇，李亞烜，劉俊榮

(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連116023)

蝦夷扇貝Patinopectenyessoensis是中國重要的貝類經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種之一，據(jù)統(tǒng)計，2019年中國養(yǎng)殖貝類產(chǎn)量達(dá)1 457萬t[1]?；钇肺r夷扇貝作為一種高端海產(chǎn)品，其品質(zhì)一直備受關(guān)注，對捕后活品蝦夷扇貝品質(zhì)評價模式與變化機(jī)制的探究有助于提升產(chǎn)品品質(zhì)，促進(jìn)貝類產(chǎn)業(yè)發(fā)展。從海上采捕至陸基加工凈化前為貝類的品質(zhì)易逝期(quality determination period, QDP)，根據(jù)本團(tuán)隊多年的調(diào)研與實踐發(fā)現(xiàn)，該階段的環(huán)境變化及處置方式對于后續(xù)活品貝類的品質(zhì)貯藏穩(wěn)定性具有十分重要的影響，且存在明顯的延遲效應(yīng)[2-3]。因此，有必要對品質(zhì)易逝期蝦夷扇貝活品的代謝特征與品質(zhì)變化進(jìn)行探究。

扇貝的風(fēng)味品質(zhì)與其生理狀態(tài)密切相關(guān)，在活品貝類市場，扇貝開口率、閉合靈敏度及外套膜縮邊等常常能夠反映扇貝質(zhì)量的好壞[4]。生化指標(biāo)如pH、糖原、ATP關(guān)聯(lián)物、K值等也被廣泛用于貝類活力的評價[5-6]。此外，游離氨基酸、水溶性蛋白及免疫因子等亦可作為扇貝品質(zhì)評價指標(biāo)[7-9]。然而，這些傳統(tǒng)的感官評價或單一理化指標(biāo)往往靈敏度不夠、品種針對性不強(qiáng)。目前，尚缺乏分子水平上蝦夷扇貝代謝特征的全面分析。

代謝組學(xué)(metabolomics)是考察生物細(xì)胞、組織、器官或者生物體在不同狀態(tài)下小分子物質(zhì)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)[10]。其主要研究手段包括核磁共振譜(NMR)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)等方法[11]，其中，超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)具有靈敏度高、選擇性好、信息豐富等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)研究中[12]。多元統(tǒng)計分析方法用于代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)降維與信息挖掘，主要包括無監(jiān)督的主成分分析法(PCA)與有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)等[13]。近年來，代謝組學(xué)作為一種行之有效的方法應(yīng)用于水產(chǎn)品的生理變化研究，如Pilditch等[14]研究了溫度波動和食物供應(yīng)對幼齡海扇貝Placopectenmagellanicus生長和代謝的影響；Chen等[15]運(yùn)用代謝組學(xué)方法研究了半無水保存期間櫛孔扇貝Chlamysfarreri的生理變化；Rochfort等[16]發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)方法可能有助于確定貽貝的產(chǎn)地；劉佳琳等[17]研究了褐牙鲆Paralichthysolivaceus幼魚全組織在低鹽脅迫后的代謝組變化。

本研究中，以蝦夷扇貝為研究對象，利用UPLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)，將捕后早期設(shè)定為36 h之內(nèi)，分析了品質(zhì)易逝期濕藏條件下蝦夷扇貝閉殼肌的差異代謝物及代謝途徑，探索了濕藏條件下活品蝦夷扇貝的代謝模式，以期為活品貝類代謝組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確分析提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用蝦夷扇貝于2019年12月購自大連市長興水產(chǎn)品市場，殼高為(11.37±0.30)cm，殼長為(11.01±0.31)cm，殼寬為(2.27±0.08)cm，均為當(dāng)日到貨，采用泡沫箱密封(碎冰降溫)，于1 h內(nèi)運(yùn)至實驗室，立即進(jìn)行分選和貯藏處理，剔除活力弱或死亡的蝦夷扇貝。試驗在遼寧省水產(chǎn)設(shè)施養(yǎng)殖與裝備技術(shù)工程研究中心循環(huán)海水系統(tǒng)中進(jìn)行。

儀器設(shè)備：精密電子天平(BS224S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；離心機(jī)(Z326K型，德國HERMLE Labortechnik GmbH公司)；超高壓液相色譜儀(Agilent 1290 Infinity LC，美國Agilent公司)；質(zhì)譜儀(Triple TOF 5600，美國AB SCIEX公司)；Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱(美國Waters公司)；PH計(PB-10，德國Sartori-us公司)；水純化系統(tǒng)(Milli-Q，美國Millipore公司)。

試劑：乙腈、甲醇、氨水為色譜級(德國Merck公司)；乙酸銨為色譜級(德國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計及采樣處理 運(yùn)抵至實驗室的蝦夷扇貝活體原料處于急驟應(yīng)激狀態(tài)，立即置于循環(huán)海水系統(tǒng)中進(jìn)行24 h緩沖，循環(huán)海水為經(jīng)3次沉淀的自然海水，海水體積為0.91 m3，溶解氧質(zhì)量濃度為6.3 mg/L，溫度為6.9 ℃。緩沖后的扇貝作為模擬捕后的初始狀態(tài)，即濕藏0 h，設(shè)為對照組(A)；在海水中繼續(xù)濕藏36 h，可看作蝦夷扇貝品質(zhì)易逝期階段，設(shè)為濕藏組(C)。每組取10只扇貝用于代謝組學(xué)分析。此外，分別于濕藏0、3、6、12、24、36 h，從各組每個時間點取3只扇貝用于pH和糖原含量分析。

活貝樣品經(jīng)手工開殼，將閉殼肌與其他軟體組織分離，取閉殼肌中心部位肌肉，立即用液氮處理后于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.2 生化指標(biāo)的測定 參考田元勇等[18]的方法。試驗設(shè)3個重復(fù)，每只扇貝取2.0 g蝦夷扇貝閉殼肌，加入濃度20 mmol/L的碘乙酸鈉10 mL，冰浴下用玻璃棒搗碎，靜置25 min，冰浴條件下測定閉殼肌pH。

參考劉慧慧等[19]的方法。試驗設(shè)3個重復(fù)，每只扇貝取2.0 g 閉殼肌，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的氫氧化鉀溶液，沸水浴中加熱20 min，冷卻后加入20 mL 無水乙醇，并在3 000g條件下離心15 min，取沉淀。采用蒽酮比色法于620 nm下測定吸光度，計算葡萄糖含量，糖原含量為葡萄糖含量的1.11倍。

1.2.3 代謝組學(xué)分析

1)樣品處理。試驗設(shè)10個重復(fù),每只扇貝樣品取100 mg閉殼肌，在液氮下研磨后，加入800 μL甲醇-乙腈-水(體積比為2∶2∶1)渦旋混勻，4 ℃下超聲2次，每次30 min，然后在-20 ℃下孵育1 h沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃、13 000g條件下離心15 min，取上清液凍干后于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｙ|(zhì)譜分析時加入100 μL乙腈水溶液(乙腈與水的體積比為1∶1)復(fù)溶，4 ℃下渦旋振蕩，以14 000g離心15 min，取上清液進(jìn)行分析。為了對本次試驗進(jìn)行質(zhì)量控制，制備了所有樣品等量混合的樣本(QC樣本)，用于平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)及測定儀器狀態(tài)，并用于整個試驗過程中系統(tǒng)穩(wěn)定性的評價。

2)LC-MS/MS分析。

色譜分離：色譜流動相A為水+25 mmol/L乙酸銨+25 mmol/L氨水，流動相B為乙腈，色譜梯度洗脫程序如表1所示。整個分析過程中樣品置于4 ℃自動進(jìn)樣器中，進(jìn)樣量為10 μL，Waters Acquity BEH Amide(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)色譜柱，柱溫為25 ℃，流速為 0.3 mL/min；樣本隊列中插入 QC 樣品，用于監(jiān)測和評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性及試驗數(shù)據(jù)的可靠性。

質(zhì)譜采集：采用電噴霧電離(ESI)進(jìn)行正離子和負(fù)離子模式檢測。條件如下：干燥氣為60，輔助加熱氣為60，氣簾氣為30，毛細(xì)管溫度為600 ℃，離子噴霧空載電壓為±5 500 V；掃描范圍為60 000～1 200 000(相對分子質(zhì)量)，掃描積累時間為0.15 s；二級質(zhì)譜采用高靈敏度模式，掃描范圍為25 000～1 200 000(相對分子質(zhì)量)，掃描積累時間為0.03 s，去簇電壓為±60 V，碰撞能量為30 eV，IDA模式，同位素排除4 000之內(nèi)，離子監(jiān)測周期6。

1.3 數(shù)據(jù)處理

UPLC-MS分析的原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard轉(zhuǎn)換成.mzXML格式，然后采用XCMS程序進(jìn)行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。對XCMS提取得到的數(shù)據(jù)，刪除組內(nèi)缺失值>50%的離子峰，應(yīng)用軟件SIMCA-P 14.1(Umetrics，Umea，Sweden)進(jìn)行模式識別，數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理后，進(jìn)行多元統(tǒng)計分析，包括無監(jiān)督的主成分分析(PCA)及有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)等。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定通過峰的保留時間、精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25×10-6)和MS/MS二級譜圖匹配的方式，檢索實驗室數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步確認(rèn)代謝物。代謝通路解析通過代謝通路數(shù)據(jù)庫KEGG Pathways(KEGG,www.genome.jp/kegg)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH及糖原含量

從圖1可見，品質(zhì)易逝期濕藏條件下活品蝦夷扇貝閉殼肌的pH變化不大，為7.29～7.38，糖原也維持在較高水平，為25.5～31.3 mg/g，說明扇貝狀態(tài)較好，品質(zhì)較高。

標(biāo)有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 代謝組學(xué)分析

2.2.1 多元統(tǒng)計分析 通過LC-MS/MS質(zhì)譜檢測，正離子模式下共獲得了8 844個峰，在負(fù)離子模式下共獲得了8 692個峰。將QC樣本正、負(fù)離子檢測模式下的質(zhì)譜總離子流圖(TIC)分別進(jìn)行譜圖疊加比較，各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時間基本重疊(圖2(a)、(b))；將所有試驗樣本和QC樣本提取得到的峰，經(jīng)Pareto-scaling處理后進(jìn)行PCA分析，經(jīng)7次循環(huán)交互驗證得到PCA模型，圖中的QC樣品緊密聚集，說明整個試驗過程中儀器誤差引起的變異較小，試驗數(shù)據(jù)可靠(圖2(c)、(d))。

圖2 QC樣本的TIC重疊圖譜與A、C和QC樣本的PCA得分圖

去除QC樣本，將對照組(A)與濕藏組(C)的樣品進(jìn)行PCA分析，結(jié)果顯示，正負(fù)離子模式下，所有樣本均出現(xiàn)在HotellingT295%置信區(qū)間的橢圓內(nèi)，說明兩組樣本不存在異常值(圖3)，然而在PCA下組間樣本并無良好的區(qū)分。采用有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)對兩組樣本進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示，在兩種模式下，蝦夷扇貝A、C樣本均發(fā)生組內(nèi)聚集且組間分離趨勢，且在OPLS-DA模式下該趨勢更加明顯(圖4(a)、(c)和圖5(a)、(c))，這說明海水濕藏36 h后蝦夷扇貝的代謝模式發(fā)生改變。

圖3 A組和C組樣本的PCA得分圖

表2 PLS-DA與OPLS-DA模型的評價參數(shù)

圖4 A組和C組的PLS-DA得分圖和置換檢驗圖

圖5 A組和C組的OPLS-DA得分圖和置換檢驗圖

2.2.2 差異代謝物的鑒定與通路分析 根據(jù)OPLS-DA 模型得到的變量權(quán)重值(variable importance for the projection, VIP)來衡量各代謝物的表達(dá)模式對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，挖掘具有生物學(xué)意義的差異代謝物。本試驗中，以VIP>1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，同時結(jié)合單變量分析方法差異倍數(shù)分析(fold change analysis，F(xiàn)C)和Student’sT，檢驗顯示兩組樣本間代謝物變化的顯著性，以 FC>2 或 FC<0.5 且P<0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出7個顯著性差異的代謝物(表3)，包括二十二烷酸(behenic acid)、酪胺(tyramine)、脯氨酰谷氨酸(prolyl-glutamate)、二磷酸腺苷葡萄糖(ADP-glucose)、尿苷5-二磷酸(uridine 5′-diphosphate, UDP)、3-磷酸絲氨酸(3-phosphoserine)和檸檬酸(citrate)。

各差異代謝物濕藏后的變化趨勢如圖6所示，其中，3-磷酸絲氨酸發(fā)生上調(diào)，其余6個差異代謝物則為下調(diào)。KEGG通路分析表明，三羧酸循環(huán)(TCA cycle)是最容易受到影響的代謝通路(圖7)。

圖6 對照組(A)和濕藏組(C)顯著性差異代謝物熱圖

圖7 差異代謝物的通路富集分析

3 討論

3.1 代謝組學(xué)技術(shù)用于貝類活品品質(zhì)評價方法的構(gòu)建

扇貝作為活體生物，其生理代謝活動會隨著環(huán)境影響發(fā)生變化，因此，扇貝的生理代謝及活力狀態(tài)可以一定程度上反映扇貝的品質(zhì)。pH和糖原是反映貝類生理狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。糖原是扇貝主要的儲能物質(zhì)，也是扇貝重要的呈味物質(zhì)[22]。傳統(tǒng)的評價方法如pH、糖原等，都是以單一指標(biāo)作為響應(yīng)值。代謝組學(xué)是以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，針對生物樣本內(nèi)所有小分子代謝物進(jìn)行分析，目的是從海量數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)潛在標(biāo)志物。與傳統(tǒng)生化指標(biāo)相比，代謝組學(xué)技術(shù)更為全面靈敏。代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理通常采用PLS-DA或OPLS-DA進(jìn)行多元統(tǒng)計分析。選取合適的模型有助于提高數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。OPLS-DA較PLS-DA增加了一個正交換算，可以把與模型分類不相干的信號過濾掉，因此，OPLS-DA解釋能力更強(qiáng)，可更準(zhǔn)確地篩選出組間差異[23]。相較于PLS-DA，OPLS-DA分析可以更好地避免過擬合現(xiàn)象，但與PLS-DA相比通常無預(yù)測性能的提升。本研究結(jié)果證明了這一點。

3.2 品質(zhì)易逝期濕藏條件下活品蝦夷扇貝的代謝特征

本研究表明，品質(zhì)易逝期濕藏36 h活品蝦夷扇貝閉殼肌中pH和糖原含量有所波動，但變化不大，兩者的波動范圍可說明此條件下扇貝狀態(tài)良好，其中，糖原含量的變化相比于pH較明顯。扇貝體內(nèi)pH的改變通常與其代謝產(chǎn)物有關(guān)，乳酸、丙酮酸等無氧代謝產(chǎn)物的升高均可導(dǎo)致扇貝體內(nèi)pH的降低[24]。品質(zhì)易逝期濕藏的蝦夷扇貝閉殼肌pH并無明顯下降，這說明扇貝體內(nèi)無氧代謝產(chǎn)物并未積累，而糖原含量波動則說明能量代謝途徑的活躍。在代謝組學(xué)分析中，蝦夷扇貝濕藏36 h后與初始扇貝的代謝存在差異，通過OPLS-DA分析篩選了7個顯著差異代謝物，即2個氨基酸、2個有機(jī)酸、2個核苷酸和1個胺類物質(zhì)。貝類中廣泛存在著氨基酸、核苷酸等非揮發(fā)性含氮呈味物質(zhì)[25]，游離氨基酸被認(rèn)為在新陳代謝中起重要作用，參與蛋白質(zhì)的構(gòu)建、滲透調(diào)節(jié)[26]及免疫反應(yīng)[27]。在濕藏條件下，3-磷酸絲氨酸出現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢。根據(jù)KEGG代謝通路顯示，該物質(zhì)參與了甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等多種游離氨基酸的代謝，與氨基酸的合成密切相關(guān)。另有報道，肌球蛋白的調(diào)節(jié)功能可能與3-磷酸絲氨酸有關(guān)[28]。此外，酪胺和脯氨酰谷氨酸同樣參與了氨基酸代謝。Aru等[29]對貽貝Mytilusgalloprovincialis冰藏期間的NMR代謝組學(xué)分析顯示，丙氨酸含量有降低；Chen等[15]對覆蓋潮濕無紡紙的活扇貝Chlamysfarreri的GC-MS代謝組學(xué)分析顯示，谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸含量有降低。以上研究說明，氨基酸物質(zhì)的調(diào)節(jié)對于維持貝類生命代謝較為重要。此外，能量物質(zhì)往往能夠最直接地反映扇貝的生理狀態(tài)。捕后早期濕藏條件下蝦夷扇貝有氧呼吸代謝活躍，本研究中發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)通路的過程產(chǎn)物——檸檬酸出現(xiàn)下調(diào)趨勢。能量代謝涉及高能磷酸鹽的降解與合成[4, 30]，本研究中二磷酸腺苷葡萄糖和尿苷5′-二磷酸的下調(diào)可能與該過程有關(guān)。二十二烷酸是一種脂肪酸類物質(zhì)，它的前體物質(zhì)為behenoyl-CoA，因此，二十二烷酸的減少也在一定程度上反映了能量物質(zhì)的波動。這表明，三羧酸循環(huán)是最易受到影響的代謝通路。以上結(jié)果顯示，品質(zhì)易逝期濕藏條件下活品扇貝的有氧呼吸作用顯著，與能量有關(guān)的代謝是最主要的代謝途徑。

綜上，傳統(tǒng)的品質(zhì)評價指標(biāo)pH及糖原并不靈敏，代謝組學(xué)分析方法可以較為靈敏、全面地反映品質(zhì)易逝期活品蝦夷扇貝濕藏條件下的實時狀態(tài)，這對探索高端貝類產(chǎn)品品質(zhì)評價及變化機(jī)制具有較為重要的意義。

4 結(jié)論

本研究中以蝦夷扇貝為研究對象，通過超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)法對其代謝組學(xué)進(jìn)行分析，從分子層面探索了品質(zhì)易逝期海水濕藏36 h活品蝦夷扇貝的代謝特征。

1)本研究中詳細(xì)描述了從數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)集預(yù)處理、模式識別到篩選差異代謝物的過程，通過OPLS-DA方法建立的模型表明，蝦夷扇貝濕藏36 h后與初始扇貝的代謝存在顯著差異。

2)經(jīng)過篩選和鑒別，共發(fā)現(xiàn)7個顯著差異代謝物，且三羧酸循環(huán)通路是最易受影響的代謝通路。品質(zhì)易逝期濕藏條件下活品扇貝有氧呼吸作用顯著，與能量有關(guān)的代謝是最主要的代謝途徑。

3)代謝組學(xué)是一種較為靈敏的技術(shù)手段，可以用于貝類活品品質(zhì)評價與變化機(jī)制的研究。本研究為活品貝類代謝組數(shù)據(jù)的分析方法與操作流程提供了參考依據(jù)，也為今后研究貝類的活力評價與品質(zhì)調(diào)控提供了新的思路和方法。