蔡思學(xué)，謝樂芳，丁小梅，王 力

(集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

酪氨酸酶又稱多酚氧化酶，是一種兼具單酚酶和二酚酶活性的多功能含銅氧化酶[1]，在微生物、動植物和人體中都廣泛存在，在催化氧化酚類化合物的酶促褐變、促進黑色素形成方面發(fā)揮著重要作用。它是果蔬褐變的關(guān)鍵酶，一方面可以使果蔬中的酚類物質(zhì)被氧化為棕褐色，另一方面所生成的氧化產(chǎn)物會與其他蛋白質(zhì)等組分結(jié)合而抑制多種酶活性。因此，酪氨酸酶會顯著影響新鮮果蔬的顏色和質(zhì)量，導(dǎo)致果蔬的保質(zhì)期縮短[2-4]。研究表明，果蔬因為褐變造成的損失率高達50%[5]。并且，酪氨酸酶也是各種微生物生命活動所必需的酶之一，對其活性進行抑制可以控制腐敗菌的生長，達到對食品保鮮防腐的目的[6]。但目前，發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)酪氨酸酶檢測方法由于其抑制劑的毒性而不能口服或應(yīng)用于皮膚[7]，所以，找到一種靈敏、高效、安全檢測酪氨酸酶的方法，對評價果蔬褐變、食品保鮮有潛在的應(yīng)用前景。

多金屬氧酸鹽(polyoxometalates，POMs)簡稱多酸，通常是由前過渡元素(鉬、釩、鎢、鈮等d0電子構(gòu)型元素)形成的一類高氧化態(tài)陰離子金屬氧簇[8]，因其無毒、無臭、不揮發(fā)，便于萃取分離，且具超強的酸性、氧化還原性、高負(fù)電荷，特別是其無可比擬的結(jié)構(gòu)多樣性和理想的電荷轉(zhuǎn)移能力，因而被應(yīng)用于醫(yī)藥、催化、電化學(xué)等多個領(lǐng)域，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的綠色高效多功能催化劑。其中，在電化學(xué)領(lǐng)域，主要根據(jù)多酸的氧化還原、高度負(fù)電性質(zhì)和導(dǎo)電率等展開研究[9-11]。為了減少多酸在溶液中降解，促進其回收再利用，研究中通常將其固定在pH值穩(wěn)定且具有高比表面積的碳基載體上[12]。制備多酸修飾電極的方法有電極浸涂吸附法、電極表面電沉積法、聚合物包埋法等[13]，并且多酸修飾電極與普通玻碳電極相比，具有電流響應(yīng)增加、檢出限降低、電極反應(yīng)性能和電催化性能提高等優(yōu)勢[14]。近年來，多酸對酶的高效抑制作用已成為研究的熱點，雖確切的機制尚不明確，但主要歸因于高負(fù)電荷的多酸與蛋白質(zhì)之間正電荷區(qū)間的相互作用[15]，如磷酸酶、核苷酸酶、ATP酶和葡萄糖苷酶等，不同量的多酸都有高效的抑制作用[16]。

由于雜多化合物尤其是鉬系列化合物很容易吸附在碳電極表面，因此，文獻[17-19]利用吸附法制備了磷鉬酸修飾電極，其電極表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性和氧化還原性能。但現(xiàn)階段對于多酸修飾電極用于酪氨酸酶的檢測鮮有報道，因此，有望利用吸附法將多酸修飾至電極表面作為電化學(xué)傳感器用于酪氨酸酶的檢測，為評價果蔬褐變提供可靠的方法。本文制備H3PMo12O40修飾玻碳電極，通過陽極化、吸附法進行處理，進而增強H3PMo12O40的吸附能力，利用H3PMo12O40與蛋白質(zhì)之間可能會發(fā)生的反應(yīng)，研究其在不同支持電解質(zhì)、掃描速度下對酪氨酸酶的電化學(xué)傳感效果，以此為電化學(xué)傳感器檢測酪氨酸酶，抑制果蔬褐變提供一定的理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

Al2O3粉購自天津艾達恒晟科技有限公司；酪氨酸酶購自Sigma-Aldrich公司；硫酸鈉、硫酸和H3PMo12O40均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。實驗試劑除Al2O3粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%外，其余均為分析純，用水均為超純水。

PGSTAT302N電化學(xué)工作站，瑞士萬通中國有限公司；玻碳電極，武漢高仕睿聯(lián)科技有限公司；DHG-9037A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；KQ250ES型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玻碳電極的預(yù)處理

1.2.2 H3PMo12O40修飾玻碳電極的制備

在+2.0 V的電勢條件下，將預(yù)處理好的玻碳電極置于2 mol/L H2SO4中極化3 s進行陽極化處理，以加強其吸附效果，之后在-0.4～+0.8 V電勢電位下將電極處于5 mmol/L的H3PMo12O40溶液中，循環(huán)掃描25圈，即完成多酸修飾電極表面的制備。

1.2.3 不同支持電解質(zhì)對電極的修飾

在-0.4～+0.8 V的電位區(qū)間內(nèi)，分別以不同支持電解質(zhì)50 mmol/L、pH=6.8磷酸鹽緩沖液、超純水、不同比例的V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液在100 mV/s掃描速度下進行循環(huán)伏安掃描，觀察在不同電解質(zhì)支持下電極的修飾效果。

1.2.4 不同掃描速度檢測電極的修飾效果

以V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為支持電解質(zhì)，分別在不同掃描速度(10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 mV/s)下對H3PMo12O40修飾電極進行循環(huán)伏安掃描，并觀察其規(guī)律。

1.2.5 修飾電極催化不同濃度酪氨酸酶

分別以4 mL的磷酸鹽緩沖液和4 mLV(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為支持電解質(zhì)，再加入0.4 mL，0，21.48，40.28，59.08，77.87，96.67 U/mL的酪氨酸酶(由50 mmol/L、pH=6.8的磷酸鹽緩沖液配制)進行循環(huán)伏安掃描(-0.4～+0.8V電勢電壓、100 mV/s 掃描速度)，觀察修飾電極對不同濃度酪氨酸酶的催化規(guī)律，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以評價修飾電極對酪氨酸酶的催化效果，其檢出限計算為空白溶液(支持電解質(zhì))標(biāo)準(zhǔn)偏差的三倍除以分析曲線的斜率。

1.2.6 修飾電極連續(xù)催化酪氨酸酶

在100 mV/s掃描速度、-0.4～+0.8 V電位區(qū)間條件下，首先在反應(yīng)體系中加入4 mL磷酸鹽緩沖液進行掃描，繼而加入0.2 mL，249.73 U/mL酪氨酸酶溶液并迅速混合均勻，進行循環(huán)伏安掃描，再加入0.4 mL 249.73 U/mL酪氨酸酶溶液迅速混合均勻，進行循環(huán)伏安掃描。以此類推，分別加入0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0，2.2 mL，249.73 U/mL酪氨酸酶溶液，進行循環(huán)伏安掃描，每次掃描圈數(shù)均為1圈。

1.2.7 H3PMo12O40修飾電極穩(wěn)定性、重現(xiàn)性的測定

在100 mV/s掃描速度、-0.4～ +0.8 V電位區(qū)間條件下，以V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為支持電解質(zhì)，非連續(xù)性掃描多酸修飾電極，每次掃描3圈，并觀察其規(guī)律。后續(xù)對修飾電極進行100圈的循環(huán)伏安掃描，觀察響應(yīng)電流的變化以確定其穩(wěn)定性。

同一制備條件下以6支H3PMo12O40修飾電極來檢測電極的重現(xiàn)性。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次平行測定，采用SPSS 17.0版本進行分析，實驗作圖使用Origin 8.0專業(yè)軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同支持電解質(zhì)對電極的修飾

如圖1所示，以V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為支持電解質(zhì)下，H3PMo12O40修飾的玻碳電極與裸玻碳電極相比，出現(xiàn)明顯的多金屬氧酸鹽特征氧化還原峰，表現(xiàn)出更清晰的伏安行為。說明H3PMo12O40被成功修飾至電極表面，能有效改善電流響應(yīng)，可以用于后續(xù)實驗。

不同溶液作為支持電解質(zhì)修飾電極的循環(huán)伏安圖如圖2所示。由圖2a可以看出，超純水作為支持電解質(zhì)，其響應(yīng)電流為0 mA，原因是超純水在處理過程中溶解鹽類等導(dǎo)電物質(zhì)幾乎都被除去，電阻率太大，所以沒有導(dǎo)電作用[20]。與圖2b比較發(fā)現(xiàn)，在0.5 mol/L Na2SO4溶液支持下，循環(huán)伏安圖沒有出現(xiàn)多酸的特征氧化還原峰，原因可能是多酸在中性溶液中易分解，特別是鉬基會隨著pH值的升高逐漸分解，導(dǎo)致多酸離子濃度低從而不足以響應(yīng)電流[21]。而在V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=1∶1和0.1 mol/L H2SO4溶液支持下均出現(xiàn)特征氧化還原峰，且在H2SO4溶液中強于混合溶液的。

考慮到體系最終測定酪氨酸酶，其活性條件較溫和，不能處于強酸強堿下，所以繼續(xù)研究不同比例的硫酸、硫酸鈉混合溶液作為支持電解質(zhì)對修飾電極的效果，結(jié)果如圖2c所示。由圖2c可見，隨著硫酸、硫酸鈉溶液的比例由5∶5至1∶9，即酸性減弱，循環(huán)伏安圖的響應(yīng)電流也隨之減弱。由于H3PMo12O40的電化學(xué)還原機理是兩電子雙質(zhì)子的過程，可以發(fā)現(xiàn),隨著pH值的增加，氧化還原峰電位發(fā)生負(fù)移[22]，當(dāng)V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=1∶9時，氧化峰個數(shù)由5個下降至4個，表明該反應(yīng)過程確實有質(zhì)子參與。但多酸對酸性敏感，當(dāng)酸性減弱至一定程度時，多酸將會分解，氧化還原峰將減少，并且pH值增加可能使負(fù)電荷基團增多從而加大之間的靜電排斥,抑制電化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生[23]。所以，為了保證檢測的準(zhǔn)確度、靈敏度，選擇V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為電解質(zhì)進行后續(xù)實驗，此時氧化還原峰為5對，其中3對明確的氧化還原峰Ⅰ-Ⅰ′、Ⅱ-Ⅱ′、Ⅲ-Ⅲ′對應(yīng)H3PMo12O40的2-、4-、6-電子轉(zhuǎn)移[24-26]，用式(1)～式(3)進行描述：

(1)

(2)

(3)

2.2 不同掃描速度檢測電極的修飾效果

如圖3所示，以V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為支持電解質(zhì)下，掃描速度從10 mV/s增至100 mV/s的同時，氧化還原峰的響應(yīng)電流增強，當(dāng)掃描速度達100 mV/s時，多酸的特征氧化還原峰明顯，后續(xù)進一步增加掃描速度，實驗效果并不顯著。說明100 mV/s的掃描速度適合掃描該多酸修飾電極。并且從圖3還可以看出，隨著掃描速度的變化，其氧化還原峰電位未發(fā)生改變，在10～70 mV/s內(nèi)氧化還原峰的響應(yīng)電流與掃描速度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，80～100 mV/s內(nèi)響應(yīng)電流與掃描速度的對數(shù)呈線性關(guān)系，表明該反應(yīng)過程屬于表面與擴散的共同控制[27-31]。

2.3 H3PMo12O40修飾電極催化不同濃度的酪氨酸酶

圖4a以磷酸鹽緩沖液作為支持電解質(zhì)，隨酪氨酸酶濃度的增加，對應(yīng)響應(yīng)電流減弱，但減弱的幅度很小，表明多酸對酪氨酸酶有一定的催化效果。

以V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為支持電解質(zhì)，結(jié)果如圖4b所示，圖4b呈現(xiàn)4對明顯的特征氧化還原峰，并且其氧化還原峰、對應(yīng)響應(yīng)電流隨酪氨酸酶濃度的增大呈下降趨勢，表明多酸具有雙重催化功能，既能氧化催化又能還原催化酪氨酸酶?？赡茉谠擉w系下酪氨酸酶中的羧基負(fù)載、負(fù)基團可以與修飾電極的正電荷發(fā)生有效的相互作用，增加了親和力，所以效果顯著[32]。相比磷酸鹽緩沖液，硫酸、硫酸鈉混合溶液體系可以使之呈現(xiàn)明顯的氧化還原峰，原因可能是多酸在酸性條件下較中性條件更穩(wěn)定，符合Ensafi等[33]的研究結(jié)果：在酸性溶液中多酸更有機會發(fā)揮催化作用，而緩沖溶液pH=6.8使體系基本處于中性條件下，導(dǎo)致在該體系下多酸修飾電極催化酪氨酸酶不會出現(xiàn)明顯的特征峰。且以圖4b插圖峰Ⅳ為例，對應(yīng)線性曲線為：I=0.863 1C-0.083，R2=0.998 5，檢出限(S/N=3)為15.76 U/mL-1，表明在該體系下響應(yīng)電流同酪氨酸酶的濃度存在良好的線性關(guān)系，可作為標(biāo)準(zhǔn)曲線用于果蔬中酪氨酸酶的檢測。

2.4 H3PMo12O40修飾電極對酪氨酸酶的連續(xù)催化作用

以V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為支持電解質(zhì)，研究H3PMo12O40修飾電極對酪氨酸酶的連續(xù)催化作用，結(jié)果如圖5所示?？梢姡琀3PMo12O40對酪氨酸酶的催化沒有掃出明顯的氧化還原峰，且隨酪氨酸酶加入量的增加，響應(yīng)電流還出現(xiàn)了輕微的減弱趨勢。原因可能是，雖然酪氨酸酶在持續(xù)加入，但部分酶已失活，導(dǎo)致實際濃度在下降，多酸對其催化效果不顯著。

2.5 H3PMo12O40修飾電極的穩(wěn)定性

從循環(huán)伏安圖(見圖6)可見，在V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為支持電解質(zhì)下，修飾電極經(jīng)過7次非連續(xù)性掃描、清洗過程，但整個過程響應(yīng)電流并沒有出現(xiàn)明顯的減弱，最終響應(yīng)電流值較開始僅下降了3.14%。后續(xù)對修飾電極進行100圈的循環(huán)伏安掃描(-0.4～+0.8 V的電位區(qū)間，掃描速度為100 mV/s)，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)電流基本沒有發(fā)生變化，表明基于吸附法制備的H3PMo12O40修飾電極穩(wěn)定性良好。

2.6 H3PMo12O40修飾電極的重現(xiàn)性

同一制備條件下以6支H3PMo12O40修飾電極來檢測電極的重現(xiàn)性，結(jié)果表明：各響應(yīng)電流間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.72%，表明基于吸附法制備的H3PMo12O40修飾電極具有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

對玻碳電極進行陽極化處理，用吸附法將H3PMo12O40修飾至電極表面，將制備的修飾電極作為傳感器適合在100 mV/s的掃描速度下進行掃描。為保持酪氨酸酶活性和避免H3PMo12O40分解，以V(0.1 mol/L H2SO4)∶V(0.5 mol/L Na2SO4)=2∶8混合溶液作為支持電解質(zhì)最優(yōu)，此時所對應(yīng)的循環(huán)伏安圖有明顯的氧化還原峰，其響應(yīng)電流和酪氨酸酶有著很好的線性關(guān)系。并以峰Ⅳ為例：I(Ⅳ)=0.863 1C-0.083，計算出檢出限(S/N=3)為15.76 U·mL-1，且H3PMo12O40修飾電極有著良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，對酪氨酸酶的催化和電化學(xué)傳感效果良好。所以，后續(xù)有望將該修飾電極作為傳感器安全地用于果蔬中酪氨酸酶的檢測，對抑制果蔬褐變具有潛在的應(yīng)用前景。