何莎 茍東蕓 王文遠(yuǎn) 劉紫倩 楊潔 王彥永 孫靜娜 張令怡 馬曉偉

目前腦卒中仍然是世界范圍內(nèi)病死率較高的主要疾病［1］，其中缺血性卒中是由腦局部血液循環(huán)障礙所致中樞神經(jīng)功能缺損綜合征，高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、吸煙、高血糖及高血壓等疾病或不良嗜好是其重要危險(xiǎn)因素。研究證實(shí)，缺血性卒中的發(fā)病過程受相關(guān)基因調(diào)控［2］，載脂蛋白E（ApoE）基因多態(tài)性則可能是其重要危險(xiǎn)因素之一［3］。既往研究表明，ApoE基因多態(tài)性與缺血性卒中的發(fā)生存在相關(guān)性，尤其是攜帶ε4等位基因的亞洲人群發(fā)生缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于白種人［4-5］。他汀類藥物作為預(yù)防心腦血管病的重要藥物，在臨床上被廣泛應(yīng)用［6］，但其降脂效果及患者臨床結(jié)局存在較大的個(gè)體差異，這種差異的部分原因可能與遺傳因素相關(guān)［7］，近年較受關(guān)注的基因類型即ApoE和SLCO1B1基因。研究表明，SLCO1B1基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）可通過改變藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性而影響藥物的血清濃度，誘發(fā)肌肉病。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）-熒光探針法從分子水平對(duì)河北地區(qū)漢族人群中心腦血管病患者ApoE和SLCO1B1基因多態(tài)性的分布特征進(jìn)行分析，以為實(shí)現(xiàn)基因檢測手段服務(wù)于腦卒中的防治及他汀類藥物精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

1.納入標(biāo)準(zhǔn)（1）年齡17～100歲。（2）籍貫為河北地區(qū)漢族居民，無血緣關(guān)系以及異族通婚史。（3）依據(jù)《心血管內(nèi)科疾病診療指南》［8］和《中國各類主要腦血管病診斷要點(diǎn)2019》［9］確診合并心血管病或腦血管病。（4）本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批準(zhǔn)號(hào)：20190418），患者及其家屬對(duì)研究項(xiàng)目知情同意并簽署知情同意書。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)（1）未檢測到基因表型者。（2）有肝、腎、血液系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病或肝功能異常者。（3）近3個(gè)月內(nèi)參加其他臨床試驗(yàn)者。

3.一般資料選擇2018年6月至2019年10月在我院神經(jīng)內(nèi)科和心內(nèi)科就診的4193例心腦血管病患者，男性2314例，女性1879例；年齡31～97歲，平均（64.12±12.18）歲。

二、研究方法

1.儀器與試劑全自動(dòng)核酸提純及熒光PCR分析儀Anadus9850、血液基因組DNA提取試劑盒均購自廈門安普利生物工程有限公司；人類SLCO1B1和ApoE基因多態(tài)性檢測試劑盒（批號(hào)：19052008，PCR-熒光探針法）由武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司提供。

2.基因組DNA提取抽取患者晨起空腹靜脈血2 ml，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取基因組DNA，同時(shí)，設(shè)置弱陽性對(duì)照和空白對(duì)照。分別于2 ml基因組DNA（5～15 ng/μl）、弱陽性對(duì)照及空白對(duì)照管中滴加4種PCR反 應(yīng) 液（SLCO1B1*1b、SLCO1B1*5、ApoE2、ApoE4），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為25 μl［緩沖液、特異性引物和探針、內(nèi)標(biāo)引物、探針和模板、Taq酶和尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）］，配制后于離心半徑4.83 cm、2650 g/min離心2 min；反應(yīng)條件為37℃10 min、95℃5 min；95℃15 s、60℃45 s，共40個(gè)循環(huán)。

3.PCR-熒光探針法擴(kuò)增基因組DNA及信號(hào)采集按照以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，UNG酶處理階段：37℃10 min循環(huán)1次；預(yù)變性階段：95℃5 min循環(huán)1次；PCR階段：95℃15 s、60℃45 s，共循環(huán)40次，于60℃時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，熒光信號(hào)的收集定為FAM（SLCO1B1*1b388A、SLCO1B1*5521T、ApoE?2526C、ApoE?4388T）、VIC（SLCO1B1*1b388G、SLCO1B1*5521C、ApoE?2526T、ApoE?4388C）和ROX（內(nèi)標(biāo)）。根據(jù)不同等位基因數(shù)目和等位基因總數(shù)計(jì)算基因頻率：已知基因型個(gè)體數(shù)，計(jì)算某基因頻率=［該基因總數(shù)（A）/該基因及其等位基因的總數(shù)（A+a）］×100%；已知基因型頻率求某一等位基因的頻率＝該等位基因純合子的頻率（AA）+1/2×雜合子的頻率。

4.統(tǒng)計(jì)分析方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)構(gòu)成比（%）或率（%）表示，ApoE和SLCO1B1基因多態(tài)性位點(diǎn)是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡和組間基因型分布的差異性，行χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ApoE和SLCO1B1基因多態(tài)性等位基因頻率及基因型分布

分析結(jié)果顯示，河北地區(qū)漢族心腦血管病患者ApoE及SLCO1B1基因多態(tài)性位點(diǎn)突變頻率觀察值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，提示該樣本來自同一總體，具有群體代表性（表1）；且男女之間ApoE基因多態(tài)性位點(diǎn)388T＞C、526C＞T，SLCO1B1基因多態(tài)性位點(diǎn)388A＞G、521T＞C分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；表2，3）。

表1 ApoE和SLCO1B1基因等位基因頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Table 1.Allele frequency of ApoE and SLCO1B1 genes and the test of Hardy-Weinberg balance

表2 不同性別心腦血管病患者ApoE基因多態(tài)性頻率分布的比較［例（%）］Table 2.Frequency distribution of ApoE genotypes of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

二、基因多態(tài)性分布

1.ApoE基因多態(tài)性分布河北地區(qū)漢族心腦血管病患者ApoE基因的6種表型中，以?3/?3、?3/?4所占比例最高，分別為68.57%（2875/4193）、15.48%（649/4193）；?2/?2、?2/?3、?2/?4、?4/?4比例為0.48%（20/4193）、12.81%（537/4193）、1.69%（71/4193）和0.98%（41/4193）。不同性別之間ApoE各表型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.971，P=0.223；表4）。

表4 不同性別心腦血管病患者ApoE基因表型分布［例（%）］Table 4.Genotypes of ApoE gene of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

2.SLCO1B1基因多態(tài)性分布河北地區(qū)漢族心腦血管病患者SLCO1B1基因的7種表型之中，*1a/*1a、*1b/*1b、*1a/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*15/*15所占比例分別為7.20%（302/4193）、39.57%（1659/4193）、31.05%（1302/4193）、0.02%（1/4193）、6.42%（269/4193）、14.31%（600/4193）和1.43%（60/4193）。不同性別之間SLCO1B1基因表型差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.354，P=0.078；表5）。

表5 不同性別心腦血管病患者SLCO1B1基因表型分布［例（%）］Table 5.Genotypes of SLCO1B1 gene of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

討 論

腦卒中是一種受多基因、多因素影響的腦血管病，其中遺傳和環(huán)境因素共同影響其病理生理學(xué)機(jī)制［3］。研究顯示，中國漢族人群中ApoE?4等位基因及?2/?4、?3/?4、?4/?4基因表型可能是缺血性卒中的危險(xiǎn)及遺傳易感因素［10］。他汀類藥物是目前防治冠心病、腦卒中及高脂血癥等疾病的首選藥物，但其降低膽固醇的幅度仍然存在很大的個(gè)體差異，約有1/3的患者經(jīng)調(diào)整調(diào)脂藥物后仍達(dá)不到降脂目標(biāo)［11］，這種降低膽固醇的效果表現(xiàn)出相對(duì)較大的個(gè)體差異，與患者的病情、治療依從性及遺傳因素有關(guān)［12］。研究發(fā)現(xiàn)，SLCO1B1基因的常見變異與他汀類藥物引起的肌病密切相關(guān)，SLCO1B1基因突變可增加他汀類藥物的血漿濃度，從而導(dǎo)致肌病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)上升［13-14］。

ApoE是一種存在于血漿中可以參與脂蛋白運(yùn)輸和代謝、腦磷脂代謝及維持神經(jīng)細(xì)胞間脂類代謝的載脂蛋白［15］。ApoE有兩種常見單核苷酸多態(tài)性，526C＞T和388T＞C，二者共形成3種等位基因（?2、?3、?4）和6種基因表型（?3/?3、?3/?4、?2/?3、?2/?4、?4/?4、?2/?2）［16］。本研究顯示，不同性別間ApoE基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)388T＞C、526C＞T分布及基因表型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示ApoE基因多態(tài)性與性別無關(guān)。大量研究結(jié)果表明，ApoEε4可能是中國漢族人群缺血性卒中的重要遺傳因素［10，17-18］，Jin等［17］對(duì)漢族人群ApoE基因多態(tài)性和缺血性卒中相關(guān)性進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)與ApoE3/3型受試者相比，ApoE4/4攜帶者發(fā)生缺血性卒中的風(fēng)險(xiǎn)增加2.1倍，且缺血性卒中組患者ApoE?4等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，表明ε4是中國漢族人群缺血性卒中的危險(xiǎn)因素，其與缺血性卒中病情進(jìn)展密切相關(guān)［17-18］。

表3 不同性別心腦血管病患者SLCO1B1基因多態(tài)性頻率分布的比較［例（%）］Table 3.Frequency distribution of SLCO1B1 genotypes of patients with curlar-cerebrovascular disease in different gender[case(%)]

以往研究顯示，不同民族之間ApoE基因多態(tài)性的基因型頻率和等位基因頻率存在差異［19］。本研究對(duì)河北地區(qū)漢族心腦血管病患者的觀察顯示，ApoE?4等位基因頻率所占比例為9.56%（802/8386），?3和?2的比例分別為82.71%（6936/8386）和7.73%（648/8386；而與?4相關(guān)的基因表型?3/?4、?2/?4、?4/?4占比分別為15.48%（649/4193）、1.69%（71/4193）和0.98%（41/4193），與中國南部客家族［20］及華中地區(qū)漢族人群［21］的研究結(jié)果相似，提示河北地區(qū)漢族心腦血管病患者中約20%的人存在罹患缺血性卒中的潛在風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)此類人群應(yīng)該進(jìn)行健康教育宣傳并盡早做好預(yù)防，從而避免缺血性卒中的發(fā)生。

SLCO1B1基因是指導(dǎo)合成有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽1B1（OATP1B1）的基因，其多態(tài)性可以導(dǎo)致OATP1B1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能下降并可增加藥物不良反應(yīng)，SLCO1B1基因位點(diǎn)有兩個(gè)常見、非同義單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)顯示藥物運(yùn)輸功能改變，分別是521T＞C和388A＞G［14］。兩種單核苷酸多態(tài)性共形成4種單倍型（*1a、*1b、*5、*15）以及9種表型（*1a/*1a、*1b/*1b、*1a/*1b、*1a/*5、*1a/*15、*1b/*15、*15/*15、*5/*5、*5/*15）。本研究僅檢測到7種表型，未檢測到*5/*5和*5/*15，且不同性別之間SLCO1B1基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)388A＞G、521T＞C分布及基因表型分布差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示SLCO1B1基因多態(tài)性與性別無關(guān)。SLCO1B1基因的功能突變（包括SLCO1B1單核苷酸多態(tài)性388A＞G、521T＞C）在世界各地均以高頻率廣泛分布，且在群體內(nèi)部的多樣性大于在群體之間的多樣性［22］。本研究納入的河北漢族心腦血管病患者，SLCO1B1388A＞G與521T＞C基因突變頻率分別為74.04%（6209/8386）和11.81%（990/8386），與中國南方客家族的74.18%（1362/1836）和10.95%（201/1836）［20］，以及華中地區(qū)漢族人群的74.99%（4873/6498）和12.37%（804/6498）［21］突變頻率相似。與國外相關(guān)人群相比，河北地區(qū)漢族心腦血管病患者SLCO1B1388A＞G基因突變頻率與非洲人群相近（70%～80%），且高于高加索人群（30%～45%）。相比中國漢族人群，SLCO1B1521T＞C基因突變在美國、中東及歐洲人群中發(fā)生頻率較高，分別為24%、20%和18%，但在撒哈拉以南非洲的突變頻率（1.9%）較低［22］。

既往研究表明，SLCO1B1521T＞C可增加他汀類藥物（如辛伐他汀、普伐他汀、西立伐他汀、洛伐他?。┲委熑巳喊l(fā)生相關(guān)肌病的風(fēng)險(xiǎn)［23］。這是由于SLCO1B1521T＞C基因突變使OATP1B1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性降低，導(dǎo)致許多他汀類藥物尤其是活性辛伐他汀酸的血藥濃度顯著升高，使辛伐他汀誘發(fā)肌肉病的風(fēng)險(xiǎn)隨之增加，從而降低辛伐他汀的治療效果［24］。他汀類藥物引起的不良反可能與SLCO1B1基因多態(tài)性及他汀藥物種類有關(guān)，但也有部分學(xué)者認(rèn)為SLCO1B1521T＞C基因突變不會(huì)增加肌病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［25-26］。在本研究中，SLCO1B1521 TC（雜合突變）和CC（純合突變）型所占比例分別為20.75%（870/4193）、1.43%（60/4193），521T＞C基因突變頻率為11.81%（990/8386），提示河北地區(qū)漢族心腦血管病患者中有近20%的人存在罹患他汀藥類物相關(guān)性肌肉病風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于此類用藥患者應(yīng)盡量監(jiān)測并避免其發(fā)生相關(guān)不良反應(yīng)。對(duì)湖北省漢川市漢族人群SLCO1B1基因多態(tài)性與缺血性卒中相關(guān)性的研究提示，SLCO1B1基因rs4149056位點(diǎn)多態(tài)性可能與缺血性卒中有關(guān)，TC和CC基因型人群可能更容易罹患缺血性卒中，等位基因C可能是腦卒中的易感基因［27］。

綜上所述，河北地區(qū)漢族心腦血管病患者中可能有近20%的人存在發(fā)生缺血性卒中和他汀類藥物相關(guān)性肌肉病的風(fēng)險(xiǎn)，攜帶SLCO1B1*5或*15等位基因的患者應(yīng)避免服用高劑量他汀類藥物。對(duì)不同地區(qū)的人群進(jìn)行ApoE和SLCO1B1基因多態(tài)性檢測可從分子水平揭示其與疾病易感性的關(guān)系，為不同地區(qū)預(yù)防缺血性卒中及實(shí)現(xiàn)他汀類藥物精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。

利益沖突無