李佳朔， 潘鵬宇， 陳立剛， 鄒 正， 楊新宇， 孔 睿， 李侑埕， 梁國(guó)標(biāo)

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 神經(jīng)外科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種發(fā)病率高，且病死率高達(dá)50%的腦卒中疾病，常伴有永久性的神經(jīng)功能損傷[1]。有研究表明，早期腦損傷是導(dǎo)致SAH后死亡、殘疾等不良預(yù)后的重要原因[2]。炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡等在內(nèi)的病理、生理變化是造成早期腦損傷的主要原因[3]。SAH后過(guò)激的炎癥反應(yīng)刺激炎癥因子激活，通過(guò)各種炎癥通路造成腦細(xì)胞病理性凋亡，進(jìn)而造成腦水腫，血腦屏障破壞等諸多損傷[4]。因此，通過(guò)抑制SAH后的炎癥反應(yīng)可以減輕早期腦損傷，保護(hù)神經(jīng)，改善預(yù)后。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是PRR家族的一部分，可以識(shí)別微生物病原體，激活先天及獲得性免疫反應(yīng)，引起多種促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)[5-6]。因此，通過(guò)抑制TLR可以發(fā)揮抗炎的生物活性。在Toll樣受體的眾多受體中，TLR4是最重要的脂多糖受體[7]。作為T(mén)LR4的下游因子，NF-κB同樣具有多種生物活性，如調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞凋亡及免疫應(yīng)答[8]。在刺激狀態(tài)下，NF-κB通過(guò)IκBα的磷酸化及核轉(zhuǎn)位進(jìn)行活化，發(fā)揮其生物活性[9]。因此，通過(guò)TLR4/NF-κB通路抑制TLR4及NF-κB，可以減少炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。黃腐酚(xanthohumol，XN)是一種異戊二烯基黃酮類物質(zhì)，具有抗炎、調(diào)節(jié)凋亡及自噬、抗癌、抗糖尿病在內(nèi)的多種生物活性[10-11]。這些發(fā)現(xiàn)在腦缺血性卒中的研究中也得到了證實(shí)[12]。目前，XN在SAH動(dòng)物模型中的神經(jīng)保護(hù)作用的研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討XN對(duì)SAH早期腦損傷動(dòng)物模型神經(jīng)炎癥的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性KM小鼠120只，體質(zhì)量28～30 g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于恒溫室中，每12 h光暗交替1次，日常給予充足的食物和清水，術(shù)前自由進(jìn)食、進(jìn)水，1周后進(jìn)行手術(shù)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)與處理均嚴(yán)格按照“National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組(n=24)、模型(SAH)組(n=24)，XN組(n=72)。將XN組小鼠分為XN 10 mg/kg組，XN 25 mg/kg組，XN 50 mg/kg組，每組各24只，于術(shù)前30 min腹腔注射相應(yīng)劑量的XN。SAH組注射等量的溶劑(0.5% DMSO)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 XN質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%，購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、NF-κB p65、p-IκBα、TLR4抗體購(gòu)自碧云天公司；NeuN抗體購(gòu)自Abcam公司；白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)抗體購(gòu)自Santa公司。

1.3 研究方法

1.3.1 建立小鼠SAH模型 運(yùn)用改良頸內(nèi)動(dòng)脈線穿刺法模擬SAH，建立SAH模型[13]。術(shù)前腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，充分顯露頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，夾閉頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎并剪斷頸外動(dòng)脈，于起始部剪“V”形口，將尼龍線導(dǎo)入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)有阻力時(shí)繼續(xù)插入2 mm，迅速退出尼龍線，結(jié)扎縫合，置于37℃保溫板上直至恢復(fù)。Sham組進(jìn)行相同手術(shù)，但不刺破血管。

1.3.2 SAH嚴(yán)重程度評(píng)分 根據(jù)Sugawara評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)SAH嚴(yán)重程度[14]。將基池分為6部分，根據(jù)每個(gè)節(jié)段內(nèi)的凝塊數(shù)量分為0～3級(jí)，將6個(gè)節(jié)段分?jǐn)?shù)相加得出評(píng)分。評(píng)分越高表示出血量越大，SAH越嚴(yán)重。

1.3.3 神經(jīng)功能評(píng)分 術(shù)后24 h根據(jù)平衡木試驗(yàn)及改良Garcia評(píng)分對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)估小鼠神經(jīng)功能缺損程度。

1.3.4 腦組織含水量測(cè)定 術(shù)后24 h進(jìn)行腦組織含水量測(cè)試。將小鼠處死后迅速取出完整的腦組織，稱量其濕重。用110℃烘箱持續(xù)烘干72 h，重量不再變化后稱量其干重。

腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%

1.3.5 蛋白免疫印跡法 術(shù)后24 h摘取小鼠腦組織，置于冰上迅速研磨勻漿，于4℃靜置30 min，12 000 r/min 4℃恒溫離心10 min取上清液。根據(jù)說(shuō)明書(shū)利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入5×loading buffer后100℃恒溫水浴5 min；每孔加入40 μg總蛋白樣品，使用10% SDS-聚丙烯胺進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后5% BSA室溫封閉1 h；加入一抗TNF-α(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜；次日TBST清洗3次后，1∶800稀釋二抗，室溫孵育1 h，洗膜。利用ECL化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果。

1.3.6 免疫熒光法 小鼠處死后取新鮮腦組織，于10%多聚甲醛溶液中固定24 h，于30%蔗糖溶液中脫水，制成冷凍4 mm切片，選用IL-1β(1∶100)，TUNEL細(xì)胞凋亡試劑，NeuN(1∶100)于4℃孵育過(guò)夜，次日PBS清洗3次，每次5 min。在37℃避光孵育相應(yīng)二抗60 min后PBS洗滌3次，每次5 min，滴加抗熒光淬滅封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 各組Sugawara評(píng)分、神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及免疫熒光結(jié)果比較 Sham組Sugawara評(píng)分、腦組織含水量低于SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，平衡木試驗(yàn)評(píng)分、改良Garcia評(píng)分高于SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SAH組Sugawara評(píng)分高于XN 50 mg/kg組，平衡木試驗(yàn)評(píng)分低于XN 50 mg/kg組，改良Garcia評(píng)分低于XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，腦組織含水量高于XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAH處理后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加，XN處理后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少，XN 50 mg/kg組效果最優(yōu)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組Sugawara評(píng)分、神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及免疫熒光結(jié)果比較(a.Sugawara評(píng)分；b.平衡木試驗(yàn)評(píng)分；c.改良Garcia評(píng)分；d.腦組織含水量；e.免疫熒光染色結(jié)果)

2.2 各組TLR4蛋白表達(dá)情況比較 SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組TLR4蛋白表達(dá)水平明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SAH組TLR4蛋白表達(dá)水平明顯高于XN 10mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組TLR4蛋白表達(dá)情況比較

2.3 各組IκBα、NF-κB蛋白表達(dá)情況比較 Sham組IκBα、NF-κB蛋白表達(dá)低于SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SAH組IκBα、NF-κB蛋白表達(dá)高于XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組IκBα、NF-κB蛋白表達(dá)情況比較

2.4 各組炎癥因子表達(dá)情況比較 Sham組TNF-α、IL-1β表達(dá)低于SAH組、XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SAH組TNF-α、IL-1β表達(dá)高于XN 10 mg/kg組、XN 25 mg/kg組、XN 50 mg/kg組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組炎癥因子表達(dá)情況比較

3 討論

SAH是一種危重的臨床急性腦卒中疾病，在發(fā)病的患者中，約12.4%的患者立即死亡，約50.0%患者出現(xiàn)不同程度的永久性神經(jīng)功能損傷，且出血后前幾日的病死率也高達(dá)30.0%[15]。早期腦損傷是指SAH后72 h內(nèi)的一系列病理、生理變化，包括顱內(nèi)壓升高，血腦屏障破壞，腦水腫，血管痙攣，氧化應(yīng)激，炎癥等[16]，對(duì)患者病死率以及致殘率有著極大的影響。這些最終導(dǎo)致了SAH后的細(xì)胞損傷及功能障礙。因此，在SAH發(fā)生的早期甚至發(fā)生前給予干預(yù)可以減輕患者出血后的早期腦損傷，對(duì)于改善預(yù)后有一定的積極作用。

XN具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、預(yù)防腫瘤、保護(hù)神經(jīng)等多種生理作用[17]。TLR是XN發(fā)揮其生理作用的最重要作用因子，可調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫、炎癥、凋亡等[13-14]。因此，抑制TLR4可以作為一種抑制過(guò)激炎癥反應(yīng)的治療方法。本研究中，SAH處理后TLR4表達(dá)水平升高，而隨著XN藥物濃度的升高，TLR4蛋白表達(dá)水平逐漸降低，提示XN可以通過(guò)抑制TLR4的表達(dá)保護(hù)神經(jīng)功能。既往研究發(fā)現(xiàn)，激活TLR4可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，進(jìn)而發(fā)揮其重要的生理作用[18]。因此，抑制TLR4可以下調(diào)NF-κB，抑制過(guò)激的炎癥反應(yīng)。NF-κB是由Rel蛋白的二聚體組成，具有多種生物活性效應(yīng)，如調(diào)節(jié)炎癥、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[19]。作為調(diào)節(jié)促炎基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，NF-κB可引起炎性細(xì)胞的募集及炎癥因子的釋放[20]。有研究報(bào)道，XN可通過(guò)NF-κB發(fā)揮其抗炎、抑癌等生理作用[21-22]，而NF-κB發(fā)揮作用與IκBα的磷酸化、NF-κB磷酸化及核轉(zhuǎn)位相關(guān)[9]。因此，檢測(cè)p-IκBα、p-65 NF-κB的表達(dá)水平可有效地反映NF-κB的活化程度。本研究發(fā)現(xiàn)，XN可以顯著地抑制IκBα磷酸化及p65 NF-κB表達(dá)，說(shuō)明XN可以抑制NF-κB活化程度，而高濃度XN(50 mg/kg)處理后對(duì)TLR4有顯著的抑制作用。這提示，XN可以通過(guò)抑制TLR4的表達(dá)來(lái)下調(diào)NF-κB活化。

有研究報(bào)道，SAH后的炎癥反應(yīng)在出血發(fā)生的24 h內(nèi)即可發(fā)生，其相關(guān)的炎癥因子TNF-α、IL-1β均有明顯升高，且由于其具有顯著的細(xì)胞毒性、啟動(dòng)凋亡、破壞血腦屏障等危害，下調(diào)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)對(duì)神經(jīng)功能具有正向的保護(hù)作用[23]，與本研究結(jié)果一致。本研究中，SAH處理后，TNF-α、IL-1β的蛋白表達(dá)水平顯著升高，而這種升高會(huì)被XN逆轉(zhuǎn)，且隨著XN藥物濃度的增加，小鼠的出血嚴(yán)重程度、神經(jīng)功能、腦水腫、細(xì)胞凋亡均得到改善，提示XN可能通過(guò)TLR4/NF-κB途徑抑制SAH后炎癥因子的表達(dá)，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，XN可以通過(guò)抑制TLR4表達(dá)進(jìn)而下調(diào)IκBα及NF-κB的磷酸化，降低NF-κB的活化，抑制SAH后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)損傷，起到保護(hù)神經(jīng)的作用。本研究存在一定的局限性，首先，SAH后的各種腦損傷機(jī)制并非相互獨(dú)立，而是同時(shí)發(fā)生，且可以相互作用，而本研究?jī)H分析炎癥這一獨(dú)立因素，有一定的局限性；同時(shí)，XN是否可以通過(guò)其他通路起到緩解炎癥反應(yīng)的作用還需進(jìn)一步的研究。