門(mén)娟娟

（山東省高密市醴泉街道畜牧獸醫(yī)站 261512）

豬流行性腹瀉主要是豬流行性腹瀉病毒導(dǎo)致的一種豬腸道傳染病，此病可使豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉及脫水癥狀，近年來(lái)，隨著我國(guó)豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模逐漸擴(kuò)大，此傳染病的發(fā)病率有所上升。其癥狀表現(xiàn)、流行病學(xué)、病毒形態(tài)學(xué)及病理變化等方面與豬傳染性胃腸炎非常相像，所以對(duì)豬流行性腹瀉的診斷存在一定難度，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的方式對(duì)病豬進(jìn)行檢查，從而科學(xué)的進(jìn)行豬流行性腹瀉診斷，為病豬有效治療提供依據(jù)。

1 免疫熒光法概述

1.1 概念

免疫熒光法主要是將免疫學(xué)法同熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合來(lái)對(duì)特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)部中的分布進(jìn)行研究的一種檢測(cè)方法。因熒光素能發(fā)出熒光，并且在熒光顯微鏡下能被檢出，所以可以對(duì)抗原實(shí)施細(xì)胞定位，通過(guò)免疫熒光技術(shù)對(duì)細(xì)胞或者說(shuō)細(xì)胞組織內(nèi)部的抗原及半抗原物質(zhì)顯示和檢查，故稱(chēng)之為免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。

1.2 應(yīng)用方法

本次主要是觀察免疫熒光法診斷豬流行性腹瀉的效果，所以選取的檢驗(yàn)對(duì)象應(yīng)為病豬，需要對(duì)病豬實(shí)施解剖操作，并取部分小腸，將其作為冰凍切片，也可以選取小腸黏膜進(jìn)行抹片，然后將獲取的標(biāo)本防治在自然環(huán)境之中自然風(fēng)干，完成風(fēng)干操作后需要通過(guò)丙酮對(duì)其實(shí)施固定，然后將熒光抗體加入完成染色操作，染色程序如下。

（1)標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)性抗原片以及陰性抗原片通過(guò)0.01MPBS（pH7.4)進(jìn)行預(yù)濕。

（2)應(yīng)將被檢血清進(jìn)行稀釋?zhuān)⑾蛲科貎r(jià)，然后放置37℃的恒溫盒之中感做30min。

（3)使用濃度為0.1%吐溫80的0.01MPBS（pH7.4)清洗4次，每次清洗持續(xù)10min，然后使用無(wú)離子水及PBS再次清洗，清洗次數(shù)各1次。

（4)滴加濃度為0.1%的伊文思藍(lán)溶液，將豬IgG熒光抗體進(jìn)行稀釋?zhuān)缓髮⑵渫坑跇?biāo)本上，并將其置放在37℃恒溫盒之中進(jìn)行染色，染色持續(xù)時(shí)間為30min。

（5)使用0.01MPBS（pH7.4)清洗3次，清洗時(shí)間分別為3、5和8min，然后使用無(wú)離子水清洗1次。

（6)滴加碳酸緩沖甘油，并封片。

完成染色操作后需要對(duì)其全面水洗，水洗完成后需要對(duì)其封蓋進(jìn)行鏡檢，并得出相應(yīng)的檢驗(yàn)結(jié)果，除此之外，還應(yīng)對(duì)病豬進(jìn)行電鏡檢查，從而同免疫熒光法的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

可以采用熒光顯微鏡對(duì)涂片進(jìn)行觀察，當(dāng)陰性血清和陽(yáng)性血清與PBS對(duì)照之后均符合的情況下可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)養(yǎng)性抗原片上面的腸絨毛上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)部的熒光亮度進(jìn)行判定，判定方法是觀察熒光亮度強(qiáng)弱。若熒光呈現(xiàn)閃亮綠色熒光的情況下，則可以將其判定為強(qiáng)陽(yáng)性；若熒光呈現(xiàn)明亮及普通綠色，則可將其判定為陽(yáng)性；若熒光呈現(xiàn)出比較弱的綠色，則可判定為弱陽(yáng)性；若熒光呈現(xiàn)出微弱綠色，則可將其判定為疑似病例；若熒光呈現(xiàn)為紅色，則可將其判定為陰性。

2 案例分析

2.1 案例概況

某種豬養(yǎng)殖場(chǎng)共養(yǎng)殖種豬1263頭，在養(yǎng)殖的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)個(gè)別種豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、食欲不振等癥狀，養(yǎng)殖場(chǎng)負(fù)責(zé)人張某立即采取隔離措施，將出現(xiàn)癥狀的種豬單獨(dú)隔離于隔離觀察區(qū)，并對(duì)病豬之前所處環(huán)境進(jìn)行消毒。由于發(fā)現(xiàn)癥狀的78頭種豬之前與豬群混養(yǎng)，故需要做好相關(guān)的隔離措施。與此同時(shí)，張某因懷疑種豬患得豬流行性腹瀉，故立即向當(dāng)?shù)貏?dòng)物檢疫部門(mén)報(bào)告?zhèn)浒?，由?dāng)?shù)貏?dòng)物檢疫部門(mén)攜帶檢疫設(shè)備和試劑前來(lái)該養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行檢疫工作。

2.2 診斷過(guò)程

養(yǎng)殖場(chǎng)負(fù)責(zé)人張某在養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)豬群中個(gè)別種豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、食欲不振、脫水等一系列癥狀，初步懷疑種豬患傳染性胃腸炎，為了避免傳染同圈的其他種豬，張某立即采取了隔離查看措施，2d后脫水種豬死亡，張某見(jiàn)狀立即向其所在地防疫部門(mén)說(shuō)明情況，由上級(jí)部門(mén)委派專(zhuān)業(yè)防疫人員前往該養(yǎng)殖場(chǎng)參與檢疫工作，通過(guò)防疫人員根據(jù)種豬的臨床癥狀觀察，初步懷疑種豬患有流行性腹瀉或者是傳染性胃腸炎，為了對(duì)患病種豬進(jìn)一步確診，對(duì)該豬場(chǎng)已死亡種豬共22例實(shí)施實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，所采用方法即免疫熒光法，檢測(cè)流程與上述方法內(nèi)容一致。最后將診斷結(jié)果與病理診斷進(jìn)行對(duì)比。

2.3 檢測(cè)結(jié)果

此次采用免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的目標(biāo)為豬流行性腹瀉病毒，通過(guò)全面的排查，得出的檢測(cè)結(jié)果如附表所示。

由附表可知，該種豬養(yǎng)殖場(chǎng)死亡病豬中陰性及疑似病例無(wú)，可見(jiàn)所有種豬均可能患有豬流行性腹瀉，對(duì)于22病死豬又進(jìn)行了病例診斷，經(jīng)病理診斷得出確診病例為21例，免疫熒光法診斷準(zhǔn)確率可達(dá)95.45%。此結(jié)果說(shuō)明針對(duì)豬流行性腹瀉采取免疫熒光法進(jìn)行診斷能獲取良好的診斷效果。

附表 種豬養(yǎng)殖場(chǎng)免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果 單位：%

3 討論

豬流行性腹瀉是一種高發(fā)性傳染病，發(fā)病后主要癥狀為腹瀉，并且疫情傳播速度比較慢，在診斷方面容易與其他疾病之間混淆，尤其是豬養(yǎng)殖時(shí)容易出現(xiàn)的傳染性胃腸炎等病，兩種疾病的相似度比較高，所以在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中，若豬出現(xiàn)以上癥狀容易誤診，所以在對(duì)病豬診斷時(shí)，不應(yīng)僅依賴(lài)于病豬臨床癥狀和流行病學(xué)對(duì)其進(jìn)行確診，還應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的方法提升診斷有效性和真實(shí)性[1]。

當(dāng)前針對(duì)豬流行性腹瀉的診斷手段很多，如病毒分離鑒定、微量血清中和試驗(yàn)、電鏡檢查、免疫熒光法檢測(cè)等，這些方法已經(jīng)得到普及推廣的診斷方法是電鏡檢查和免疫熒光法，這兩種方法雖然在試驗(yàn)操作嚴(yán)格性方面表現(xiàn)一般，但對(duì)操作人員的熟練度和專(zhuān)業(yè)度方面要求比較低，可以推廣。在兩種方法中，電鏡法的操作非常簡(jiǎn)便，且可以獲取直觀的定性結(jié)果，但儀器設(shè)備價(jià)格方面比較昂貴，且檢測(cè)報(bào)告結(jié)果需要在3～7d內(nèi)才能形成，容易導(dǎo)致傳染病傳播蔓延。但免疫熒光法這種診斷方法則能在非常短的時(shí)間內(nèi)將相關(guān)檢測(cè)結(jié)果得出，并且不會(huì)與輪狀病毒、傳染性胃腸炎病毒、大腸桿菌及豬細(xì)小病毒等混淆，所以免疫熒光法檢測(cè)的結(jié)果更準(zhǔn)確，在此次觀察試驗(yàn)中，通過(guò)案例調(diào)查分析得出，該養(yǎng)殖場(chǎng)通過(guò)免疫熒光法共檢測(cè)陽(yáng)性病例22例，通過(guò)病理診斷得出確診病豬共21例，準(zhǔn)確率高達(dá)95.45%。說(shuō)明免疫熒光法的診斷準(zhǔn)確率非常高，適合在豬養(yǎng)殖場(chǎng)推廣使用[2]。

在此次觀察試驗(yàn)中需要說(shuō)明的是，免疫熒光法在操作過(guò)程中主要以病豬小腸等相關(guān)部位取樣當(dāng)作檢驗(yàn)標(biāo)本，所以免疫熒光法檢驗(yàn)并不能在疾病初診階段全面應(yīng)用，但由于豬流行性腹瀉是一種傳染性疾病，需要病豬死亡后及時(shí)對(duì)病死豬進(jìn)行檢查，從而如實(shí)反映其死因，更重要的是當(dāng)病豬出現(xiàn)癥狀后，需要養(yǎng)殖人員立即采取隔離措施，并加強(qiáng)監(jiān)控，以免造成疾病蔓延，同時(shí)，還需要根據(jù)免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果對(duì)其他豬群作出有效的治療干預(yù)，以保證豬群安全，防止此病傳染蔓延。

總而言之，免疫熒光法在對(duì)豬流行性腹瀉診斷有突出效用，基于此病傳染性這一特點(diǎn)及免疫熒光法自身的優(yōu)勢(shì)，可將其在豬養(yǎng)殖方面全面推廣應(yīng)用，從而能及時(shí)、有效的保證疾病得到控制，促進(jìn)養(yǎng)殖安全。