劉 賀 賀 陽(yáng) 谷家棟 文連奎

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

酒精是一種嗜神經(jīng)類脂性中樞神經(jīng)抑制劑，能夠通過機(jī)體血腦屏障與腦組織卵磷脂結(jié)合產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞毒性作用[1]。長(zhǎng)期過量飲酒會(huì)使人依賴成癮導(dǎo)致慢性酒精中毒(Chronic alcoholism，CA)，增加機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成大腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)被破壞甚至凋亡，導(dǎo)致中樞膽堿能系統(tǒng)功能紊亂和神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)異常，從而引發(fā)認(rèn)知功能障礙[2-3]。據(jù)報(bào)道[4]，CA發(fā)病率逐年增長(zhǎng)且發(fā)病人群趨于年輕化。目前主要采取強(qiáng)制戒酒和臨床藥物改善CA導(dǎo)致的認(rèn)知障礙，但強(qiáng)制戒酒具有極強(qiáng)的個(gè)體差異性且臨床治療副作用大，因此尋求天然安全的功能因子改善CA導(dǎo)致的認(rèn)知障礙具有重大意義[5]?；ㄇ嗨厥翘烊活慄S酮多酚類化合物，對(duì)阿爾茲海默癥以及東莨菪堿誘導(dǎo)認(rèn)知障礙具有改善作用[6-8]，但對(duì)CA導(dǎo)致認(rèn)知障礙的改善作用未見報(bào)道。山葡萄作為花青素良好來(lái)源，物質(zhì)資源豐富但利用率低[9]。

試驗(yàn)擬以山葡萄花青素為試材，采用Morris水迷宮和跳臺(tái)試驗(yàn)評(píng)價(jià)山葡萄花青素對(duì)CA小鼠認(rèn)知功能的影響，探討山葡萄花青素對(duì)CA小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)及膽堿能系統(tǒng)的改善作用，旨在為山葡萄花青素保健食品以及臨床藥物深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用無(wú)特定病原體動(dòng)物雄性ICR小鼠：許可證號(hào)SCXK(京)2019-0008，體重約25～30 g，飼養(yǎng)于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(批號(hào)NO.1103221911001900)屏障環(huán)境中，北京華阜康生物科技有限公司；

山葡萄花青素：參照He等[10]的方法自制；

56%vol二鍋頭酒：食品級(jí)，北京紅星股份有限公司；

二氧化硅：分析純，北京化工廠；

4%多聚甲醛溶液、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乙酰膽堿(ACh)、乙酰膽堿酯酶(AChE)、蛋白定量測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子分析天平：CPA-125型，德國(guó)Sartorius公司；

離心機(jī)：KL04-A型，美國(guó)Agilent公司；

Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)：WMT-100型，成都泰盟科技有限公司；

跳臺(tái)儀：DTT-2型，上海欣曼科教有限公司；

酶標(biāo)儀：HBS-1096B型，美國(guó)Molecular Devices公司；

電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)：DY89-Ⅱ型，寧波新芝生物科技有限公司；

超低溫保存箱：MDF-382E型，日本SANYO電器公司；

奧林巴斯生物顯微鏡：BX53型，北京瑞科中儀科技有限公司；

輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)：RM2016型，德國(guó)徠卡公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組 將40只小鼠飼養(yǎng)在(23±2) ℃，相對(duì)濕度(55±10)%，明暗交替各12 h，自由攝食和進(jìn)水的屏障環(huán)境中，適應(yīng)7 d后隨機(jī)分為4組：空白組(CK，等體積生理鹽水)、模型組[NC，30%乙醇，10 mL/(kg·d)]、山葡萄花青素低劑量組[LD，25 mg/(kg·d)]和山葡萄花青素高劑量組[HD，50 mg/(kg·d)]。

1.2.2 模型建立 參照蔣曦等[11-12]的方法修改如下：造模共30 d并分為兩個(gè)階段：CK灌胃生理鹽水，其他組動(dòng)物每天灌胃30%乙醇溶液，連續(xù)灌胃15 d；從第16天開始，灌胃乙醇溶液1 h后開始灌胃相應(yīng)劑量的山葡萄花青素，連續(xù)灌胃15 d。第31天開始Morris水迷宮試驗(yàn)(MWM)，第37天開始跳臺(tái)試驗(yàn)。試驗(yàn)期間每3 d記錄小鼠體重。

1.2.3 Morris水迷宮試驗(yàn) 參照盧聰[13]的方法修改如下：水池內(nèi)置圓形透明安全平臺(tái)(直徑80 mm，高150 mm)。試驗(yàn)開始時(shí)將水池水面分成4個(gè)象限，將安全平臺(tái)放置于第Ⅳ象限中央，向水池中加水至水面高出安全平臺(tái)1 cm，調(diào)整水溫為(25.0±0.5) ℃，加入300 g二氧化鈦，混勻成乳白色液體，隱藏透明安全平臺(tái)所在位置。小鼠給藥1 h后進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)。

(1) 定位巡航階段(5 d)：除第Ⅳ象限外，小鼠從其他3個(gè)象限邊緣中點(diǎn)位置進(jìn)入水池，每只小鼠每天訓(xùn)練3次，每次訓(xùn)練時(shí)間120 s。記錄逃避潛伏期(即小鼠從入水到找到安全平臺(tái)所需時(shí)間。若小鼠未找到安全平臺(tái)，則需將其引導(dǎo)至安全平臺(tái)并停留10 s，記錄其逃避潛伏期為120 s)、小鼠總游程。

(2) 空間探索階段(1 d)：試驗(yàn)開始撤掉水中安全平臺(tái)，第Ⅱ象限為小鼠入池位置，入水時(shí)間固定120 s。記錄小鼠首次登臺(tái)時(shí)間、穿臺(tái)次數(shù)、第Ⅳ象限停留時(shí)間、第Ⅳ象限路程百分比及小鼠游泳軌跡。

1.2.4 跳臺(tái)試驗(yàn) 參照王方[14]的方法修改如下：小鼠置于跳臺(tái)儀中自由探索30 s，將小鼠放在橡膠圓臺(tái)上，小鼠跳下圓臺(tái)給予電流刺激，重復(fù)2～3次，24 h后開始試驗(yàn)。

(1) 獲得階段(1 d)：將小鼠置于橡膠圓臺(tái)上，電柵欄通電(24 V，3 s)。記錄300 s內(nèi)小鼠跳臺(tái)潛伏期(即第一次跳下平臺(tái)的時(shí)間，若300 s內(nèi)未跳下平臺(tái)，則記錄其潛伏期為300 s)和錯(cuò)誤次數(shù)(即300 s內(nèi)跳下平臺(tái)次數(shù))。

(2) 鞏固階段(1 d)：將小鼠置于橡膠圓臺(tái)，電柵欄通電。記錄300 s內(nèi)小鼠潛伏期和錯(cuò)誤次數(shù)。

1.2.5 生化指標(biāo)測(cè)定 水迷宮和跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)束，各組小鼠禁食不斷水12 h后進(jìn)行眼球取血，靜止30 min，4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，取上清液；取腦組織在冰上分離海馬體，并與冷生理鹽水按m海馬體∶m生理鹽水為1∶9混合勻漿，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液。測(cè)定血清和海馬體上清液T-SOD、MDA、CAT、GSH、GSH-Px、Ach及AChE含量。

電視畫面中的字幕發(fā)布了首相的指示：“你們中的許多人都安全地聚集在學(xué)校禮堂和社區(qū)中心里。我們要求你們待在原地，這樣你們能得到處理。假如你們待在家中，請(qǐng)待在原地；我們會(huì)找到你。”

1.2.6 海馬體組織病理學(xué)觀察 用生理鹽水將小鼠海馬體洗凈，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，用乙醇脫去組織中水分，用透明劑二甲苯替換出組織中的乙醇，再經(jīng)石蠟包埋、切片、染色、脫蠟、脫水、封片后，于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素ANOVA分析比較組間差異，P<0.05為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山葡萄花青素對(duì)小鼠Morris水迷宮試驗(yàn)的影響

2.1.1 定位巡航階段 由表1可知，訓(xùn)練5 d后，CK、NC、HD潛伏期分別縮短了48.50%，25.91%，41.38%，小鼠逃避潛伏期雖有所縮短，但與CK比較NC明顯延長(zhǎng)，且從試驗(yàn)第1天開始差異極顯著(P<0.01)，表明CA能夠顯著延長(zhǎng)小鼠逃避潛伏期，造成空間學(xué)習(xí)及記憶保持能力損傷?；ㄇ嗨馗深A(yù)后，訓(xùn)練第2天開始逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05或P<0.01)，這是由于山葡萄花青素增強(qiáng)了小鼠對(duì)于水中安全平臺(tái)所在位置的記憶能力，使小鼠在短時(shí)間內(nèi)找到并登陸安全平臺(tái)。

表1 山葡萄花青素對(duì)小鼠逃避潛伏期的影響?

由表2可知，各組小鼠經(jīng)過訓(xùn)練后總游程均有所縮短，CK、NC、HD小鼠總游程分別縮短了35.82%，21.41%，28.53%。與CK相比NC在第1天總游程開始差異顯著(P<0.05或P<0.01)，NC小鼠在水迷宮中緩慢沿著邊緣循環(huán)式游動(dòng)，基本無(wú)空間探索行為，CA造成小鼠機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力和認(rèn)知能力失調(diào)；與NC相比HD在第3～5天總游程極顯著縮短(P<0.01)，說(shuō)明花青素可提高小鼠機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力，期間產(chǎn)生平臺(tái)探索行為，提高認(rèn)知能力。

表2 山葡萄花青素對(duì)小鼠總游程的影響?

2.1.2 空間探索階段 由表3可知，與CK相比，NC首次登臺(tái)時(shí)間極顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，穿臺(tái)次數(shù)、第Ⅳ象限停留時(shí)間和路程百分比均極顯著減少(P<0.01)，表明CA導(dǎo)致小鼠不能準(zhǔn)確定位到安全平臺(tái)所在區(qū)域以及具體位置，產(chǎn)生空間記憶能力障礙。與NC相比花青素干預(yù)后首次登臺(tái)時(shí)間顯著縮短了27.00%(P<0.01)，穿臺(tái)次數(shù)顯著增加至(3.00±2.55)次(P<0.05)，第Ⅳ象限停留時(shí)間及路程百分比分別增加了21.13%和24.24%(P<0.01)，這是因?yàn)樯狡咸鸦ㄇ嗨卮x產(chǎn)物進(jìn)入到腦中增強(qiáng)了海馬體對(duì)外界刺激信號(hào)接受及傳導(dǎo)能力，增加了小鼠對(duì)安全平臺(tái)的位置記憶能力和位置探索行為，并提高了其空間記憶能力。

表3 山葡萄花青素對(duì)小鼠空間探索階段試驗(yàn)指標(biāo)的影響?

由圖1可知，CK小鼠游泳軌跡大多呈直線式且能夠產(chǎn)生安全平臺(tái)定位探索行為，在短暫搜索后即可定位并登陸平臺(tái)。NC和LD游泳軌跡呈邊緣循環(huán)軌跡，沒有明確目標(biāo)。HD軌跡呈趨向式，有探索安全平臺(tái)位置行為，穿臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)所在象限游泳軌跡增加。MWM試驗(yàn)表明，CA能夠降低小鼠的空間記憶及學(xué)習(xí)能力，與王蓉等[5，15-16]的結(jié)果吻合。山葡萄花青素能夠提高CA導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷，與原花青素[1]、大豆異黃酮[17]等類黃酮多酚物質(zhì)對(duì)于認(rèn)知障礙改善作用相似。

圖1 山葡萄花青素對(duì)小鼠游泳軌跡的影響

2.2 山葡萄花青素對(duì)小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響

由表4可知，與CK相比，NC跳臺(tái)潛伏期極顯著縮短(P<0.01)，跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)極顯著增加(P<0.01)，表明CA對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)和被動(dòng)回避記憶能力產(chǎn)生損傷作用。與NC相比，HD在獲得階段和鞏固階段的跳臺(tái)潛伏期分別延長(zhǎng)了26.39%和26.61%(P<0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)分別減少至(3.38±0.92)，(2.63±0.74)次(P<0.05或P<0.01)，花青素干預(yù)后小鼠延長(zhǎng)安全平臺(tái)停留時(shí)間，且跳下平臺(tái)受到強(qiáng)直刺激后能夠立即跳回平臺(tái)。由于海馬體CA1區(qū)對(duì)于強(qiáng)直刺激反應(yīng)明顯，花青素能夠改善該區(qū)域神經(jīng)元受損，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)于該種刺激記憶及反射進(jìn)而跳回安全平臺(tái)。跳臺(tái)試驗(yàn)表明CA會(huì)造成小鼠認(rèn)知障礙且山葡萄花青素對(duì)此有顯著改善作用，與石哲[12]的結(jié)果不同，可能是干預(yù)物質(zhì)不同，在機(jī)體代謝中生成的產(chǎn)物不同導(dǎo)致其改善作用存在差異，其具體機(jī)制有待深入研究。

表4 山葡萄花青素對(duì)小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)的影響?

2.3 山葡萄花青素對(duì)小鼠抗氧化應(yīng)激的影響

機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中，SOD/GSH-Px/CAT共同發(fā)揮抵御氧化應(yīng)激損傷作用[18]。由表5可知，與CK相比NC小鼠血清和海馬體中T-SOD、CAT、GSH、GSH-Px水平均極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著增加(P<0.01)，這是由于CA導(dǎo)致血液中酒精含量增加，酒精代謝產(chǎn)物乙醛可通過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)元產(chǎn)生大量活性氧，抑制抗氧化酶活性并降低抗氧化蛋白含量，攻擊血腦中多不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過氧化形成過氧化脂質(zhì)，造成核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)損傷，與吳偉青[5]的結(jié)果一致。與NC相比HD小鼠血清和海馬體中T-SOD分別增加了8.62%和6.80%，CAT分別增加了25.34%和17.39%，GSH分別增加了28.14%和3.57%，GSH-Px分別增加了16.14%和25.85%，MDA分別降低了21.24%和27.70%，這是由于山葡萄花青素進(jìn)入血腦屏障，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，抑制質(zhì)脂過氧化，修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞損傷，平衡細(xì)胞間神經(jīng)興奮傳導(dǎo)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步加強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力，與榮爽[19]的結(jié)果相近。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T-SOD差異不顯著但活性增加明顯，CAT和GSH分別在海馬體和血清中具有顯著性，可能是由于花青素在機(jī)體不同位置的代謝產(chǎn)物不同，具體原因仍需進(jìn)一步研究。Cui等[20]研究發(fā)現(xiàn)，花青素抑制腦缺血模型小鼠腦組織中MDA的增加和SOD的減少，能夠激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)和HO-1蛋白表達(dá)，通過Nrf-2/HO-1途徑減輕氧化應(yīng)激損傷保護(hù)神經(jīng)元；Ali等[21]研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茲海默癥模型中花青素能夠調(diào)節(jié)磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/糖原合成酶激酶3β(p-PI3K/Akt/GSK3β)途徑，進(jìn)而刺激Nrf-2/HO-1內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，降低氧化應(yīng)激損傷，改善認(rèn)知功能障礙?；ㄇ嗨卣{(diào)節(jié)PI3K/Akt/GSK3β途徑激活內(nèi)源性抗氧化劑Nrf2/HO-1途徑，可能是其抗氧化應(yīng)激的可能通路，可以此作為切入點(diǎn)探究關(guān)于花青素改善CA導(dǎo)致認(rèn)知障礙的通路。

表5 山葡萄花青素對(duì)小鼠抗氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響?

2.4 山葡萄花青素對(duì)小鼠膽堿能系統(tǒng)指標(biāo)的影響

研究[5]表明，CA引起機(jī)體大腦相關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，通過引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)紊亂中樞膽堿能系統(tǒng)平衡，引起神經(jīng)信息傳遞功能障礙，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)多種神經(jīng)行為改變。ACh是關(guān)于認(rèn)知功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用，AChE作為膽堿能神經(jīng)元生理活性特異性標(biāo)記物的蛋白質(zhì)酶，在神經(jīng)元乙酰膽堿的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。由圖2可知，與CK相比NC中AChE極顯著升高(P<0.01)，ACh含量極顯著降低(P<0.01)，AChE活性升高會(huì)過量分解ACh，引發(fā)中樞膽堿能系統(tǒng)失衡，無(wú)法作用于突觸后膜發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用，導(dǎo)致興奮傳導(dǎo)及記憶存儲(chǔ)信號(hào)混亂，甚至導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。與NC相比HD能顯著抑制AChE活性(P<0.05)，顯著增加ACh含量(P<0.05)，花青素干預(yù)后能夠有效改善海馬體中膽堿能系統(tǒng)損傷，增強(qiáng)ACh與突觸后膜特異性受體的結(jié)合，增強(qiáng)突觸可塑性及突觸后效應(yīng)，使神經(jīng)元突觸間的信息傳遞效率增強(qiáng)，促進(jìn)記憶形成。

與CK組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；與NC組比較，#為P<0.05，##為P<0.01

2.5 山葡萄花青素對(duì)小鼠海馬體組織的影響

海馬體是機(jī)體中神經(jīng)元可塑性區(qū)域，在學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能過程中發(fā)揮重要作用。酒精造成學(xué)習(xí)記憶損傷的一個(gè)重要原因是其對(duì)海馬體神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用[22]。由圖3可知，CK海馬體CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞層次分明，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整形態(tài)清晰可見。NC海馬體CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列分散層次混亂，細(xì)胞數(shù)目減少，部分細(xì)胞變性、壞死溶解呈空泡且難以辨別。這與石哲等[12，23]的結(jié)果相似，表明CA會(huì)導(dǎo)致海馬體CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷。與NC組比較HD海馬體CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，細(xì)胞數(shù)目增多，表明山葡萄花青素可以改善CA導(dǎo)致的小鼠海馬神經(jīng)元受損。

圖3 山葡萄花青素小鼠海馬體CA1區(qū)神經(jīng)元的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，慢性酒精中毒會(huì)導(dǎo)致小鼠認(rèn)知功能障礙；酒精導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激水平增加，引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中膽堿能穩(wěn)態(tài)失衡，這是慢性酒精中毒導(dǎo)致認(rèn)知障礙的可能機(jī)制之一。山葡萄花青素對(duì)此具有改善作用，可顯著提高慢性酒精中毒小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高血腦中抗氧化應(yīng)激水平，調(diào)節(jié)海馬體膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，恢復(fù)受損神經(jīng)元，改善認(rèn)知障礙。后續(xù)將深入分析山葡萄花青素抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)靶點(diǎn)，并進(jìn)行PI3K/Akt/GSK3β-Nrf2/HO-1途徑機(jī)制研究。