夏丹豪 項(xiàng)志 付雨 鄭倩藝 王玖琦 滕軍放

帕金森?。≒arkinson disease，PD）患者存在運(yùn)動遲緩、肌強(qiáng)直和靜止性震顫等癥狀[1]，非典型帕金森綜合征（atypical parkinsonism，AP）包括多系統(tǒng)萎縮（multiple system atrophy,MSA）、進(jìn)行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy,PSP）等[2]，與PD臨床特征相似，尤其在疾病早期，給診斷帶來了一定困難。因此，需要特定標(biāo)志物幫助醫(yī)生對此類患者進(jìn)行更及時、準(zhǔn)確的診斷。盡管PD和不同AP的病因未知，但腦實(shí)質(zhì)炎癥可能參與病程[3]，PD、MSA和PSP患者尸檢均發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活[4-6]。已在腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）中檢測到了由類淋巴系統(tǒng)等通路[7-8]進(jìn)入的小膠質(zhì)細(xì)胞源性細(xì)胞因子[9-10]。本研究評估了PD、MSA、PSP和對照組CSF細(xì)胞因子譜差異，并探討其在疾病鑒別診斷中的價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2018年4月到2019年12月我院神經(jīng)內(nèi)科收治的34例PD患者、18例MSA患者和23例PSP患者為研究對象，見表1。所有診斷均由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)內(nèi)科主任醫(yī)師完成，并使用修正Hoehn-Yahr（H-Y）分級量表對患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評估。納入標(biāo)準(zhǔn)：①PD的診斷參考國際帕金森和運(yùn)動障礙協(xié)會（International Parkinson and Movement Disorder Society，MDS）2015年制定的原發(fā)性PD診斷標(biāo)準(zhǔn)完成[11]，MSA的診斷參考第二版的統(tǒng)一專家診斷共識及《多系統(tǒng)萎縮診斷標(biāo)準(zhǔn)中國專家共識》完成[12-13]，PSP的診斷參考2015年MDS制定的PSP診斷標(biāo)準(zhǔn)完成[14]；②能完成本研究量表評估及臨床指標(biāo)水平檢測。另納入同時間段來本院體檢健康人員29名為對照組，簽署知情同意書后于神經(jīng)內(nèi)科病房抽取CSF標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：①較嚴(yán)重的頭顱外傷史和手術(shù)史；②伴有嚴(yán)重心血管、肝腎疾病；③精神病史、認(rèn)知功能障礙者；④由藥物或腦血管疾病誘發(fā)的帕金森病；⑤老年性、癔癥性或緊張性震顫患者；⑥伴有免疫系統(tǒng)疾?。虎呱窠?jīng)系統(tǒng)腫瘤、感染等器質(zhì)性病變及腦血管疾病者；⑧長期使用非甾體抗炎藥物、糖皮質(zhì)激素類藥物治療。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，且研究對象均知情同意。

1.2 CSF標(biāo)本收集通過腰椎穿刺獲取研究對象的CSF，立即在 4℃以2000 r/min離心10 min，將上清液等量分裝到400 μL無菌聚丙烯試管中，儲存在-80℃。從腰椎穿刺開始獲取CSF標(biāo)本到標(biāo)本凍存的時間控制在60 min以內(nèi)。

1.3 細(xì)胞因子測定采用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒 （購自伊萊瑞特或欣博盛生物科技有限公司）并嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書檢測所有研究對象CSF細(xì)胞因子水平，包括C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、白介素（interleukin，IL）-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-18、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、干擾素（interferon，IFN）-γ 和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β。每位研究對象的樣本重復(fù)測3次，結(jié)果取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0、GraphPad Prism 8和MedCalc 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料若為正態(tài)分布以±s表示，若為非正態(tài)分布以M（QL,QU）表示。多組間比較采用單因素方差分析或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，兩兩比較相應(yīng)采用LSD-t法或Dunn法。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析各細(xì)胞因子，ROC曲線下面積（area under the curve，AUC）表示其統(tǒng)計(jì)學(xué)效能（0.5＜AUC＜0.7為診斷準(zhǔn)確性較低；0.7＜AUC＜0.9為診斷準(zhǔn)確性尚可；0.9＜AUC為診斷準(zhǔn)確性較高）。使用logistic回歸模型確定鑒別診斷的最佳細(xì)胞因子組合。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料PD、PSP、MSA組和對照組四組間平均年齡、性別及修正H-Y分級評分比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表 1。

表1 各組一般資料對比

2.2 CSF細(xì)胞因子水平比較四組研究對象CSF細(xì)胞因子水平見表 2。PSP組的 CRP、TNF-α、IL-1β、IL-4和 IL-6水平較 PD組高；MSA組與PD組的各細(xì)胞因子水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與對照組相比，PD組只有IL-4水平顯著降低；PSP組的IFN-γ和IL-1β水平顯著升高；MSA組所有細(xì)胞因子水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。各組間IL-10、IL-18和TGF-β水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 各組CSF細(xì)胞因子水平（pg/mL）

2.3 細(xì)胞因子水平用于鑒別PD與AP的ROC曲線分析用ROC曲線分析細(xì)胞因子，以評估其鑒別各組患者的能力。當(dāng)PD組與PSP組進(jìn)行比較時，單個細(xì)胞因子中鑒別能力最強(qiáng)的是IL-4，AUC為0.79，IL-4低于截?cái)嘀堤崾綪D可能，敏感度為94.12%，特異度為 52.17%。此外 CRP、TNF-α、IL-1β和IL-6低于各自截?cái)嘀狄蔡崾綪D可能（表3，圖1A，AUC＜0.7的數(shù)據(jù)未顯示）；在MedCalc軟件中通過建立logistic回歸方程探索PD組與PSP組鑒別診斷的最佳細(xì)胞因子組合，最終納入IFN-γ（X1）和 IL-4（X2）作為協(xié)變量，模型表達(dá)式為：logit（P）=2.52+5.63X2-2.65X2。將原始協(xié)變量X1和X2擬合成聯(lián)合預(yù)測因子Pre 1，其對應(yīng)AUC為0.88（表3，圖 1B，P＜0.01，95%CI：0.77～0.95），Pre 1 大于截?cái)嘀堤崾綪D可能，敏感度為91.18%，特異度為82.61%。

表3 各指標(biāo)以及聯(lián)合檢測對PD組和PSP組的鑒別診斷效能

當(dāng)PD組與MSA組進(jìn)行比較時，單個細(xì)胞因子中鑒別能力最強(qiáng)的是IL-4，AUC為0.74，IL-4低于截?cái)嘀堤崾綪D可能，敏感度為47.06%，特異度為94.44%。此外CRP低于截?cái)嘀狄蔡崾綪D可能（表 4，圖 1C，AUC＜0.7 的數(shù)據(jù)未顯示）；同樣建立logistic回歸方程探索PD組與MSA組鑒別診斷的最佳細(xì)胞因子組合，最終納入 IFN-γ（X1）、IL-1β（X2）和 TGF-β（X3）作為協(xié)變量，模型表達(dá)式為：logit（P）=-10.04+7.57X1-5.25X2+0.01X3。將原始協(xié)變量X1、X2和X3擬合成聯(lián)合預(yù)測因子Pre 2，其對應(yīng) AUC 為 0.96（表 4，圖 1D，P＜0.01，95%CI:0.86～0.99），Pre 2大于截?cái)嘀堤崾綪D可能，敏感度為88.24%，特異度為94.44%。

圖1 各指標(biāo)ROC曲線 A為PD組與PSP組單個細(xì)胞因子的ROC曲線，B為PD組與PSP組聯(lián)合細(xì)胞因子的ROC曲線，C為PD組與MSA組單個細(xì)胞因子的ROC曲線，D為PD組與MSA組聯(lián)合細(xì)胞因子的ROC曲線。

表4 各指標(biāo)以及聯(lián)合檢測對PD組和MSA組的鑒別診斷效能

3 討論

在本研究中，與對照組相比，PD組IL-4顯著減少。IL-4可誘導(dǎo)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，與炎癥抑制、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)等過程相關(guān)[15]，因此PD患者IL-4減少可能會加重神經(jīng)元損傷。PD組與對照組其余細(xì)胞因子均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。先前文獻(xiàn)報(bào)道，與對照組相比PD患者CSF的IL-1β和TNF-α水平上調(diào)[16]。然而也有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)二者CSF的TNF-α水平無差異[17]。這可能與不同研究納入對象的差異有關(guān)。MSA組與PD組或?qū)φ战M相比，各細(xì)胞因子均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與先前的文獻(xiàn)報(bào)告一致[18-19]。

與 PD 組相比，PSP組 CSF中 CRP、IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的水平顯著升高。PD和MSA的病理特征均是神經(jīng)系統(tǒng)中異常聚集的α-突觸核蛋白包涵體，前者包涵體位于神經(jīng)元中[20]，而后者包涵體則位于少突膠質(zhì)細(xì)胞[21]。不同于PD和MSA，PSP屬于tau蛋白病，神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中可見病理性tau蛋白包涵體[22]。PSP組患者CSF中細(xì)胞因子較PD組與MSA組的高，可能是因?yàn)椴煌膊〔±砩系牟町悓?dǎo)致了炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子的差異。CRP是一種急性期蛋白，在大腦內(nèi)可以由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生成[23-24]，與非運(yùn)動癥狀如抑郁和癡呆等顯著相關(guān)[25-26]。TNF-α和IL-1β是由活化的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的促炎性細(xì)胞因子，不僅誘導(dǎo)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞和維持慢性炎癥[27]，還與tau蛋白的過度磷酸化修飾和神經(jīng)元丟失有關(guān)[28]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)tau蛋白可以誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平升高[29-30]。IL-6對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響是雙向的。海馬細(xì)胞經(jīng)IL-6處理后可通過cdk5/p53等通路誘導(dǎo)tau蛋白的磷酸化來促進(jìn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成[31]。在淀粉樣前體蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠中過表達(dá)IL-6減少了β-淀粉樣蛋白斑塊的沉積，這可能是由于IL-6誘導(dǎo)M2型小膠質(zhì)細(xì)胞激活，增強(qiáng)了對β-淀粉樣蛋白的吞噬作用[32]。

本研究另一目的是評估所選細(xì)胞因子用于鑒別診斷PD與AP的能力。PD與MSA或PSP在疾病的早期常常表現(xiàn)出相似癥狀，準(zhǔn)確的診斷將對臨床評估、治療和預(yù)后產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。本研究中，利用 CSF中 IFN-γ、IL-1β和 TGF-β鑒別 PD組和MSA組患者敏感度和特異度分別為88.2%和94.4%，IFN-γ和IL-4鑒別 PD組和 PSP組患者敏感度和特異度分別為91.2%和82.6%。雖然腰椎穿刺實(shí)施的難度較高，在診治過程中較采血不易被患者接受，然而PHILIPP等[33]的研究發(fā)現(xiàn)PD，MSA和PSP患者血清中174種細(xì)胞因子僅2種的表達(dá)發(fā)生明顯變化，并且不能區(qū)分疾病。

本研究表明，PD和AP患者CSF中細(xì)胞因子水平在早期的臨床鑒別診斷中有重要意義。通過聯(lián)合檢測細(xì)胞因子，可顯著提高診斷結(jié)果的可靠性，有望成為臨床輔助診斷的手段之一。本研究的不足可能在于：①相對較小的樣本量；②診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”需要神經(jīng)病理學(xué)證據(jù)，可能存在錯誤的臨床診斷。因此，更深入的PD和AP患者CSF細(xì)胞因子譜差異及診斷價值評估有待進(jìn)一步的大樣本量研究。