錢坤 張浩 劉學慧 曹蕊 安同偉 楊慧杰 李平

摘? ? 要：為評價四種替米考星制劑在豬體內(nèi)的藥代動力學，試驗采用高效液相分析法（HPLC），對32頭體重70 kg左右健康杜長大豬（雌雄各半）進行研究。結(jié)果表明，替米考星無論是內(nèi)服還是皮下注射給藥，吸收均極為迅速，達峰快，血液中藥物半衰期長，藥物組織穿透力強，體內(nèi)分布容積大，在組織中藥物濃度高，維持時間長，這些特殊的藥動學特性尤其適合于家畜肺炎、乳房炎等感染性疾病的治療，可安全用于臨床。

關(guān)鍵詞：替米考星; 豬; 藥代動力學; 血藥濃度; 穩(wěn)定性試驗

中圖分類號：S859.79? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.08.008

Pharmacokinetics of? Four Tilmicosin Preparations in Swines

QIAN Kun1， ZHANG Hao1， LIU Xuehui1， CAO Rui2， AN Tongwei3， YANG Huijie4， LI Ping5

（1. Tianjin Agricultural Ecological Environment Monitoring and Agricultural Product Quality Testing Center， Tianjin 300402， China; 2. Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center， Tianjin 300402， China; 3. Tianjin Heliente Biotechnology Limited Company，? Tianjin 301702， China; 4.Liaoning Inspection and Testing Certification Center， Liaoning 110016， China; 5. Tianjin Academy of Agricultural Sciences，? Tianjin 300381， China）

Abstract： In order to evaluate the pharmacokinetics of four tilmicosin preparations in swines， 32 healthy Duroc Landrace swines （half male and half female） weighing about 70 kg were studied by High Pertormance Liquid Chromatography（HPLC）. The results showed that： the absorption was very fast， the peak reached quickly， the half-life of drug in blood was long， the drug tissue penetration was strong， the distribution volume in vivo was large， the drug concentration in tissue was high， and the maintenance time was long. These special pharmacokinetic properties were especially suitable for the treatment of infectious diseases such as domestic animal pneumonia and mastitis， and could be safely used in clinical practice.

Key words： tilmicosin; swine; pharmacokinetics; plasma concentration; stability test

替米考星（Tilmicosin）是美國禮來公司（Lilly）于20世紀80年代開發(fā)的半合成的具有16環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素。替米考星具有強抗菌性，耐藥性低，抗菌譜廣，對所有的革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌、霉形體、螺旋體等均有抑制作用，抗菌活性優(yōu)于泰樂菌素、單諾沙星、土霉素、氟苯尼考和壯觀霉素等多種抗生素[1]。替米考星的抗菌機理與其他大環(huán)內(nèi)醋類相似，與細菌的核蛋白體的50S大亞基相結(jié)合，作用于P位結(jié)合點，抑制轉(zhuǎn)移酶[2-4]，主要通過抑制細菌的蛋白質(zhì)合成而起到殺菌作用[5]。

Ose[6]報道替米考星對無乳葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和產(chǎn)膿葡萄球菌的MIC分別為3.12，0.78，0.02 μg·mL-1。Modric等[7]報道給綿羊和牛皮下注射10 mg·kg-1替米考星，血中峰濃度分別為0.822，0.873 μg·mL-1，達峰時間分別為3.9，0.5 h。同時，比較了牛和綿羊的藥代動力學特征，結(jié)果沒有差異。Thomson等[8]測定了替米考星按200 mg·kg-1和400 mg·kg-1飼料拌料給藥在豬體內(nèi)組織的濃度。Blackall等[9]用瓊脂稀釋法測得替米考星對澳大利亞臨床分離的51株多殺性巴氏桿菌的MIC≤12.5 μg·mL-1，其中48株高度敏感，3株中度敏感。用同樣的方法測得藥物對在澳大利亞臨床分離的25株多殺性巴氏桿菌的MIC≤3.12 μg·mL-1[10]。Inamoto等[11]報道，對日本1985—1989年間豬肺炎損害部位分離出的61株多殺性巴氏桿菌和35株胸膜肺炎放線桿菌的抗菌作用，大多數(shù)菌株對替米考星、金霉素敏感。Ziv等[12]報道了替米考星在奶牛的藥動學特征，給藥30 min內(nèi)乳中藥物高于血液濃度近50倍，乳中消除半衰期為21.6 h。Ramadan等[13]報道了替米考星在奶牛和山羊體內(nèi)的藥動學特征，乳中濃度遠高于血清中的藥物濃度。Keles等[14]報道了給家禽口服50 mg·kg-1.替米考星藥動學符合有吸收的二室開放模型。Thomson等[15]測定了替米考星按200，400 mg·kg-1飼料拌料給藥在豬體內(nèi)組織的濃度，相當于10.97和21.34 mg·kg-1·d-1連續(xù)給藥14 d后肺組織中藥物濃度分別為0.73～1.43 μg·mL-1和1.11～2.59 mg·kg-1·d-1。從而證實約70%～80%替米考星的細胞分布是定位于溶酶體中。由此可見，家畜肺泡巨噬細胞對替米考星的高度積累為臨床上肺炎的有效防治提供了基礎(chǔ)，即使血液和肺組織中藥物水平低于致病菌的MIC值。

1 材 料

1.1 試驗動物

健康杜長大豬32頭，體重70 kg左右，4月齡，雌雄各半。給藥前在清潔、安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，每日定量喂給不含任何藥物的基礎(chǔ)日糧，自由飲水。

1.2 主要藥品

標準品： 替米考星標準品，含量95.0%，批號101655，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

供試樣品： 替米考星腸溶顆粒，規(guī)格：20%，瑞普（天津）生物藥業(yè)有限公司。

替米考星預混劑1，規(guī)格：20%，以C46H80N2O13計，北京康牧生物科技有限公司。

磷酸替米考星可溶性粉，規(guī)格：20%，以C46H80N2O13計，保定冀中藥業(yè)有限公司。

對照藥品：替米考星預混劑2，規(guī)格：20%，以C46H80N2O13計，北京康牧生物科技有限公司。

試驗試劑： 二正丁胺（分析級），購自天津市元立化工有限公司;磷酸（分析級），購自國藥集團化學試劑有限公司;乙腈（色譜級），Sigma-Aldrich;甲醇（色譜級），Sigma-Aldrich;四氫呋喃（色譜級），購自天津市光復科技發(fā)展有限公司。

1.3 主要儀器

高效液相色譜儀：Waters e2695，紫外檢測器：Waters 2489，沃特世科技（上海）有限公司;C18色譜柱： Sagix Copsil? ?C18（4.6×250 mm，5 μm）;C18固相萃取柱：Aglient Bond Eliut C18（500 mg/6 mL）;高速冷凍離心機：H1850R型，長沙湘儀離心機儀器有限公司;酸度計：PHS-3C型，上海精密科學儀器有限公司;水浴氮吹儀：CM-24型，北京成萌偉業(yè)科技有限公司;電子天平：BT25S、BSA224S-CW型，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;渦旋混合器：VORTEX-5型，Kylin-Bell;可調(diào)微量移液器：Thermo。

1.4 替米考星標準儲備液配制

替米考星標準溶液：精密稱取替米考星標準品適量，置于100 mL棕色容量瓶中，用流動相配制成濃度為200 μg·mL-1的儲備液，置于4 ℃冰箱保存，待需要時用流動相逐級稀釋配成所需濃度標準工作液。

2 方 法

2.1 動物給藥、血樣采集和血樣處理

2.1.1 試驗分組及給藥劑量 將32頭試驗豬隨機分為4組，每組6頭，雌雄各半。前3組為受試藥物組，第四組為對照藥物組，其中第1組給予替米考星腸溶顆粒，第2組給予磷酸替米考星可溶性粉，第3組給予替米考星預混劑1，第4組給予替米考星預混劑2，給藥劑量均為20 mg·kg-1，均以替米考星計。

2.1.2 給藥方式 單劑量口服一次性給予。

2.1.3 血樣采集 給藥前（0 min）、給藥后15，30，45 min及1，2，3，4，6，8，10，12，18，24，36，48，60，72 h在前腔靜脈竇采集血液，采血量為5 mL，肝素鈉抗凝。血樣4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液于另一管中保存在-20 ℃待測。

2.1.4 樣品的處理 確取混勻后的血漿樣品1 mL，加入3 mL提取液（乙腈：甲醇為95∶5（v∶v）），渦旋混勻，超聲5 min，3 500 r·min-1，4 ℃離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入10 mL水，混勻，即為樣品提取液。將C18固相萃取柱置于固相萃取裝置上，依次用10 mL甲醇和10 mL水平衡，將樣品提取液過柱，自然流干，依次加入10 mL水和10 mL乙腈洗滌，抽真空干燥3 min，用2.5 mL洗脫液洗脫，收集洗脫液，30 ℃水浴中氮氣吹干。加250 μL流動相溶解，渦旋混勻，靜置15 min，經(jīng)微孔濾膜過濾，供高效液相色譜分析。

2.2 色譜條件

色譜柱：Sagix Copsil? ? C18（4.6×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈-四氫呋喃-1 mol·L-1二丁胺磷酸緩沖液，130+55+25，v/v/v;流速：1.0 mL·min-1;進樣量：100 μL;檢測波長：290 nm;柱溫：30 ℃。

2.3 標準曲線和線性范圍

取空白血漿，分別加入標準工作液，制備成替米考星含量分別為0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，2.5 μg·mL-1的空白添加樣品。在選定的色譜條件下，按濃度從低到高的順序分別進樣100 μL作HPLC分析。以替米考星濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，確定回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

2.4 定量限和檢測限的測定

取空白血漿，分別加入標準工作液，制備成替米考星含量分別為0.005，0.01，0.02，0.05 μg·mL-1空白添加樣品，按樣品的處理方法處理。每個濃度各5個平行，測得基線噪音值，按信噪比S/N≥3為檢測限，S/N≥10為定量限。

2.5 精密度及回收率的測定

取空白血漿，分別加入標準工作液，制備成替米考星含量分別為0.02，0.5，2.5 μg·mL-1空白添加樣品，按樣品的處理方法處理，分別取100 μL進行HPLC檢測。每批每個濃度平行設(shè)5個重復樣品，共進行3個平行批次分析。根據(jù)測定結(jié)果分別計算出提取回收率、精密度及批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

2.6 樣品穩(wěn)定性試驗

取空白血漿，添加標準工作液，使血漿中藥物濃度為0.5 μg·mL-1，在室溫、4 ℃及-20 ℃條件下分別存放于0，6，12，24，36，48 h后，用HPLC測定響應值。

2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用WinNonLin 8.1藥代動力學分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計。

3 結(jié)果與分析

3.1 血藥濃度的測定方法

3.1.1 色譜分離 分別吸取替米考星對照品血漿溶液、空白血漿溶液進行樣品處理，按上述色譜條件測定。由血漿色譜圖可知目標化合物的兩個峰與雜質(zhì)完全分離，無相互干擾，替米考星順式和反式異構(gòu)體的保留時間分別為11.5，9.8 min。實測血漿樣品與標準品峰值和保留時間一致，確定為替米考星物質(zhì)。

3.1.2 標準曲線與線性范圍 分別取900 μL空白血漿，各添加100 μL替米考星系列標準工作液，使血漿中替米考星的濃度分別為0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，2.5 μg·mL-1，將逐級稀釋的標準品進樣檢測，以替米考星峰面積（y）對血漿濃度（x）進行線性回歸，相關(guān)系數(shù)良好，標準曲線見表1。

3.1.3 定量限與檢測限 取空白血漿，分別加入標準工作液，制備成替米考星含量分別為0.005，0.01，0.02，0.05 μg·mL-1空白添加樣品，按樣品的處理方法操作。每個濃度各5個平行，測得基線噪音值，按信噪比S/N=3為檢測限（LOD），S/N=10為定量限（LOQ）。其中檢測限為0.01 μg·mL-1，定量限為0.02 μg·mL-1。

3.1.4 提取回收率、精密度與準確度 將峰面積代入回收率計算公式：回收率=×100%

（式中，A為添加樣品中替米考星實測峰面積;As為對應標準液中替米考星峰面積）。替米考星低、中、高（0.02，0.5，2.5 μg·mL-1）濃度的血漿樣品測定結(jié)果的回收率見表3，結(jié)果表明，在低、中、高（0.02，0.5，2.5 μg·mL-1）3個濃度下分析方法的平均回收率（%）分別是89.32±3.46，92.37±2.65，94.83±4.49，RSD均小于10%，能滿足后續(xù)藥代動力學分析要求 。

3.2 血漿中藥物濃度

分別給豬灌服替米考星制劑，各時間點的血漿中替米考星濃度測定結(jié)果見下表3-表6，藥時曲線圖見圖1。

3.3 藥物動力學參數(shù)

采用WinNonlin 8.1藥動學軟件處理，用實測血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，計算出替米考星藥動學參數(shù)，結(jié)果見下表7-表10。

豬按20 mg·kg-1的劑量口服替米考星腸溶顆粒后，血藥濃度4 h達峰值，Cmax為1.04±0.14 μg·mL-1，藥物在體內(nèi)消除緩慢，消除半衰期為14.13±0.78 h。AUClast為12.27±1.43 μg·h·mL-1，AUC0～∞為13.04±1.17μg·h·mL-1，Vz_F_obs為33.62±6.46 L·kg-1，Cl_F_obs為1.54±0.14 L·h-1·kg-1，MRT為21.65±3.51 h，Tlag為0.59±0.19 h，與替米考星預混劑2相比，相對生物利用度F為133.93±12.03%。

豬按20 mg·kg-1的劑量口服替米考星預混劑1后，血藥濃度1.25±0.27 h達峰，Cmax為0.87±0.04 μg·mL-1，藥物在體內(nèi)消除緩慢，消除半衰期為9.94±1.00 h。AUClast為8.66±0.81 μg·h·mL-1，AUC0～∞為9.00±0.90 μg·h·mL-1，Vz_F_obs為31.95±2.46 L·kg-1，Cl_F_obs為2.24±0.23 L·h-1·kg-1，MRT為13.61±1.25 h，與替米考星預混劑2相比，相對生物利用度F為92.40±9.20%。

豬按20 mg·kg-1的劑量口服磷酸替米考星可溶性粉后，血藥濃度1.63±0.23 h達峰，Cmax為0.83±0.03 μg·mL-1，藥物在體內(nèi)消除緩慢，消除半衰期為1.22±0.44 h。AUClast為9.77±0.98 μg·h·mL-1，AUC0～∞為10.13±1.01 μg·h·mL-1，Vz_F_obs為29.33±2.71 L·kg-1，Cl_F_obs為1.99±0.18 L·h-1·kg-1，MRT為14.62±0.79 h，與替米考星預混劑2相比，相對生物利用度F為100.33±10.08%。

豬按20 mg·kg-1的劑量口服替米考星預混劑2后，血藥濃度1.81±0.26 h達峰，Cmax為0.86±0.04 μg·mL-1，藥物在體內(nèi)消除緩慢，消除半衰期為10.60±3.70 h。AUClast為9.33±0.47 μg·h·mL-1，AUC0～∞為9.74±0.39 μg·h·mL-1，Vz_F_obs為31.52±11.71 L·kg-1，Cl_F_obs為2.06±0.08 L·h-1·kg-1，MRT為13.35±1.45 h。

4 結(jié) 論

本試驗采用高效液相分析法，四種替米考星制劑在豬體內(nèi)的藥代動力學進行評價，考慮到非房室模型不受經(jīng)典房室模型的影響，適用于任何房室，目前體內(nèi)數(shù)據(jù)解析中多采用此法，且各國藥品評審當局也陸續(xù)采用推薦，固本試驗所測血藥經(jīng)時數(shù)據(jù)均采用非房室模型進行分析。結(jié)果表明，四種制劑血液中藥物半衰期長，藥物組織穿透力強，體內(nèi)分布容積大，在組織中藥物濃度高，維持時間長，具有一定的生物安全性。

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