李 斌，吳壇光，胡惠英，李建華，陳開文，李書庭，甘秋枝

（中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院麻醉科，武漢 430012）

0 引言

富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是自體全血經(jīng)離心后得到的血小板濃縮物，PRP被激活后可釋放生長因子及細胞因子等多種生物活性物質(zhì)，具有良好的促進組織修復再生作用。PRP療法已經(jīng)成為近年來國際上興起的治療軟組織損傷的新型生物療法[1-4]。如何從自體血液里面提取不小于5倍血小板濃縮倍數(shù)、無污染的PRP是PRP療法的關鍵。

現(xiàn)有的2種PRP提取裝置分別為分離管型和注射器型[5-7]。分離管型PRP提取裝置需要在注射器和PRP提取器中反復轉移血液，存在二次污染的隱患，且提取流程對操作環(huán)境的消毒要求較高。注射器型PRP提取裝置需要采用第二注射器從中空的第一注射器桿芯及錐形橡膠活塞的中心開口處抽取血液離心后的上清層，由于受所用活塞的錐形結構限制，導致位于活塞的中心開口水平面上的上清層無法抽出，使血小板富集程度降低，而橡膠活塞與血液的直接接觸存在過敏反應的可能，不適用于有既往橡膠制品過敏史的患者。因此針對現(xiàn)有PRP提取裝置技術上的不足，亟須研制一種操作簡便、使用安全，能提高血小板富集程度的注射器型PRP提取裝置，有利于PRP療法的臨床推廣應用。

1 注射器型PRP提取裝置設計

1.1 結構設計

注射器型PRP提取裝置以臨床使用的螺口注射器為基礎進行改進，設計為桿芯活塞可拆裝式結構，配合使用魯爾接頭設計的可拆裝式封堵帽。其組件包括外筒、可在外筒內(nèi)腔滑動且與外筒可拆卸連接的桿芯、可將外筒內(nèi)腔密封的活塞、封堵帽、斜面注射針和頭皮針（如圖1所示）?；钊O于外筒的內(nèi)腔且與桿芯可拆卸連接，外筒的一端設有與內(nèi)腔聯(lián)通的端口且端口可與頭皮針連接，封堵帽用于將端口密封，斜面注射針用于穿過封堵帽插入外筒內(nèi)腔抽吸液體。

圖1 注射器型PRP提取裝置結構示意圖

活塞包括活塞密封圈和螺母結構的活塞基座，活塞密封圈套接在活塞基座上，桿芯末端為螺栓結構，與活塞基座間形成可拆卸的螺栓連接。活塞密封圈采用橡膠材質(zhì)制成，活塞基座采用聚丙烯材質(zhì)制成。端口外圍設有螺口套，封堵帽包括具有中空腔體的本體部、位于本體部底部將中空腔體的下端口密封的硅膠膜以及設于本體部兩側的凸耳，本體部可與外筒底端的端口套接，使本體部的中空腔體與外筒的內(nèi)腔連通，凸耳用于與螺口套配合連接進而實現(xiàn)封堵帽與端口的連接密封。凸耳設計為外螺紋結構，可與螺口套內(nèi)壁的內(nèi)螺紋螺紋連接。

1.2 結構轉換

本裝置設計為一次性使用醫(yī)用耗材，可以根據(jù)臨床治療需要，提供20或50 mL 2種規(guī)格。其注射器拆除桿芯，安裝封堵帽后，可轉為密閉離心管結構，置于配套的離心機中使用。反之，安裝桿芯，拆除封堵帽則還原為注射器結構，可連接注射針采血或注射，如圖2所示。

圖2 注射器型PRP提取裝置的結構轉換圖

2 注射器型PRP提取裝置使用方法

采用二次離心法[7-8]制備PRP，配套使用DT5-2型低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司）進行離心，20 mL規(guī)格的注射器型PRP提取裝置需加用離心機適配器，血液離心過程如圖3所示。

圖3 血液離心過程圖

2.1 采血

采用本裝置抽取20 mL枸櫞酸鈉抗凝靜脈血，抗凝劑與血液體積比為1∶9。

2.2 一次離心

拆卸桿芯安裝封堵帽，將注射器轉換為離心管，使兩邊離心管平衡。第一次離心轉速為1 500 r/min（377g），持續(xù)10 min。離心后血液分為3層：上層為貧血小板血漿，中層為黃衣層（即濃縮的血小板），下層為紅細胞層[如圖4（a）所示]。重新安裝桿芯并拆卸封堵帽，將離心管轉換為注射器，推出下層大部分的紅細胞（剩余約0.5 mL紅細胞）。

2.3 二次離心

將注射器再次轉換為離心管，重新使兩邊離心管平衡。第二次離心轉速為1 800 r/min（500g），持續(xù)10 min。離心后血液分為2層，用規(guī)格為10 mL且針頭為斜面的注射器穿過封堵帽的硅膠膜，抽取上層約3/4的血漿，下層即為含少量紅細胞的PRP，體積約為2.5 mL[如圖4（b）所示]。經(jīng)全血細胞計數(shù)檢測，所制備的PRP中血小板濃度平均值為靜脈全血血小板濃度平均值的5.5倍。

圖4 血液離心后分層情況

2.4 注射

重懸并充分混勻PRP，將離心管轉換為注射器結構，即可進行局部注射。

3 產(chǎn)品測試

3.1 實驗試劑和主要儀器

注射器型PRP提取裝置由武漢普創(chuàng)模型技術有限公司依據(jù)本課題組提供的設計圖3D打印，經(jīng)低溫等離子體滅菌后備用。實驗涉及儀器與試劑包括枸櫞酸鈉抗凝劑（四川南格爾生物科技有限公司），DT5-2型低速臺式離心機（北京時代北利離心機有限公司），P20002K-精密電子秤（常州銳品精密儀器有限公司），LK/KS150-A1型過氧化氫低溫等離子體滅菌器（成都老肯科技股份有限公司），BACT/ALERT 3D全自動細菌分岐桿菌培養(yǎng)箱（美國Biomerirux公司），BC-6800全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

3.2 實驗設計

本研究獲得中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會審批通過，入選健康志愿者30例。納入標準：符合《中華人民共和國獻血法》和《獻血體格檢查標準》的相關規(guī)定；年齡18～65周歲，男女不限；血常規(guī)檢查正常，本人自愿簽署知情同意書并遵循研究方案的要求。排除標準：孕期及哺乳期婦女；采血前2周內(nèi)有吸煙飲酒史；既往有傳染性疾病、影響血小板計數(shù)或功能的疾病史和藥物服用史；體檢醫(yī)生認為有不能采血的其他疾病者。退出和終止標準：采血中出現(xiàn)暈厥等嚴重不良反應；受試者要求退出本研究；研究者認為受試者不宜繼續(xù)參加本研究。

3.3 注射器型PRP提取裝置的密封性檢測

取注射器型PRP提取裝置30套，各抽取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血20 mL，組裝為離心管結構并以精密電子秤稱重平衡后，置于DT5-2型低速臺式離心機，分別在相對離心力為500g、1 000g、2 000g和4 000g離心10 min，觀察離心前后血液體積的變化和密閉圈封堵帽周圍血液的泄漏情況。

3.4 注射器型PRP提取裝置所制備PRP的無菌性檢測

30例健康志愿者每例抽取20 mL外周靜脈枸櫞酸鈉抗凝全血，以二次離心法（第一次離心1500r/min×10 min，第二次離心1 800 r/min×10 min）制備PRP，取2 mL PRP行細菌培養(yǎng)（作為實驗組），抽取2 mL外周靜脈全血行細菌培養(yǎng)（作為對照組）。抽血和提取PRP均在醫(yī)院治療室內(nèi)完成，注意手衛(wèi)生和無菌操作，細菌培養(yǎng)瓶瓶口采用0.5%的醫(yī)用活力碘消毒3次。血細菌培養(yǎng)采用BACT/ALERT 3D全自動細菌分岐桿菌培養(yǎng)箱，持續(xù)觀察5 d無陽性結果則視為血培養(yǎng)陰性。

3.5 注射器型PRP提取裝置所制備PRP的血小板富集程度檢測

30例健康志愿者每例抽取20 mL外周靜脈枸櫞酸鈉抗凝全血，以二次離心法（第一次離心1500r/min×10 min，第二次離心1 800 r/min×10 min）制備PRP，取2 mLPRP行血常規(guī)檢查（作為實驗組），抽取2 mL外周靜脈全血行血常規(guī)檢查（作為對照組）。血常規(guī)檢查采用BC-6800全自動血液細胞分析儀。血小板富集程度=PRP中血小板濃度/自體全血中血小板濃度。

3.6 統(tǒng)計學方法

應用Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，各測量指標的計量資料以±s表示。2組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，樣本率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 一般資料

招募的30例健康志愿者包括男性13例、女性17例，年齡17～54歲，均在2 min內(nèi)完成靜脈采血，采血過程中未見不適反應。

4.2 裝置密封性檢測結果

離心前后比較，30套提取裝置內(nèi)的血容量未見減少，活塞密封圈周圍未見血液泄漏，封堵帽未見形變，封堵帽底部及與注射器乳頭魯爾接頭連接處無血液泄漏，表明注射器型PRP提取裝置密封性良好。

4.3 制備PRP的無菌性檢測結果

實驗組和對照組在5 d的血細菌培養(yǎng)周期內(nèi)，均未見細菌生長，表明本裝置及提取PRP過程均滿足無菌操作要求。

4.4 制備PRP中血小板濃度及富集程度檢測結果

實驗組血小板濃度為（1 101±248）×109/L，顯著高于對照組血小板濃度[（204±40）×109/L]，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001)。所制備PRP中血小板富集程度為（5.52±0.77）倍。既往研究表明[8]，血小板富集程度介于2～6倍之間的PRP對組織修復的促進作用最為顯著，因此本裝置所提取PRP可以達到臨床治療所需的有效濃度。

5 結語

裝置的密封性是確保PRP提取過程無外源性污染的重要前提條件。本研究結果顯示，20 mL規(guī)格的注射器型PRP提取裝置抽取20 mL血液后，可承受DT5-2型低速臺式離心機以最高離心力4 000g離心10 min，未見形變和血液泄漏，提示其密封性良好。評價PRP品質(zhì)的關鍵指標是PRP中血小板富集程度，其血小板濃度達到自體全血中血小板濃度的3～5倍，即視為合格品質(zhì)的PRP。本裝置所制備的PRP中血小板富集程度為5.5倍左右，符合該關鍵指標要求。所提取的PRP血培養(yǎng)未見細菌生長，提示本產(chǎn)品在普通治療室按標準操作流程操作即可確保制備PRP的無菌安全性，便于廣大基層部隊衛(wèi)生隊在普通診室開展PRP技術對急慢性訓練傷的治療。未來將進一步觀察不同離心參數(shù)對創(chuàng)傷應激狀態(tài)患者提取PRP質(zhì)量的影響。