徐鵬

（1廣東以色列理工學(xué)院化學(xué)工程系，廣東 汕頭 515063；2馬里蘭大學(xué)巴爾的摩分校化學(xué)、生化與環(huán)境工程系，馬里蘭州 巴爾的摩21250，美國(guó)）

1 追憶王義翹教授

王義翹先生出生于1936 年的南京，時(shí)值日軍全面侵華前夕，風(fēng)雨飄搖的故國(guó)六朝之都也給先生少年階段的成長(zhǎng)烙下了家國(guó)的印記。他的父親王守競(jìng)先生（1904—1984）早年留學(xué)美國(guó)，是近代史上最早從事量子物理研究的中國(guó)人，1926年在哥倫比亞大學(xué)取得理論物理博士學(xué)位。1929 年夏，王守競(jìng)先生學(xué)成歸國(guó)，擔(dān)任國(guó)立浙江大學(xué)教授、物理系主任，隨后組建中國(guó)物理學(xué)會(huì)。1936年，王守競(jìng)先生被國(guó)民政府任命為少將專(zhuān)員，負(fù)責(zé)籌建中央機(jī)器廠(chǎng)，主要研發(fā)大型發(fā)電機(jī)和大型汽輪機(jī)等軍工裝備?？箲?zhàn)勝利后，少年的王義翹也隨家人僑居美國(guó)馬塞諸塞州的波士頓，其父親加入了美國(guó)國(guó)防部與麻省理工學(xué)院共建的林肯國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，任職科學(xué)家。隨后王先生入讀MIT，1959 年和1961 年分別取得化學(xué)工程的學(xué)士學(xué)位和碩士學(xué)位。1963 年在賓夕法尼亞大學(xué)取得化學(xué)工程博士學(xué)位，師從生化工程先驅(qū)Arthur Humphrey 教授。王先生早期著述集中于抗生素通風(fēng)發(fā)酵過(guò)程的物質(zhì)傳遞、過(guò)程放大及生化動(dòng)力學(xué)等工程學(xué)領(lǐng)域，為Merck制藥早期抗生素工藝的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。1965 年起，王先生開(kāi)始在麻省理工學(xué)院化學(xué)工程系和生物工程系任教，于1985 年創(chuàng)建了生物工程技術(shù)中心（Biotechnology Process Engineering Center，BPEC），擔(dān)任中心主任。1986 年當(dāng)選美國(guó)國(guó)家工程院院士，1996 年成為麻省理工學(xué)院資深學(xué)院教授（MIT Institute Professor）之一（麻省理工學(xué)院最高榮譽(yù)）。

王先生一生在MIT 從教、授業(yè)55 余年，兢兢業(yè)業(yè)，幾乎從未退休。我2013 年開(kāi)始在MIT 的化工系從事博士后課題研究，經(jīng)常與王先生課題組的博士后研究員交流。我的課題研究也受益于王先生早年創(chuàng)建的生物工程技術(shù)中心。我有幸擔(dān)任過(guò)MIT 暑期課程“發(fā)酵工程”的助教（當(dāng)時(shí)王先生年事已高，由MIT 其他老師授課），王先生的“發(fā)酵工程”開(kāi)課50 余年來(lái)，其學(xué)術(shù)思想也浸潤(rùn)了幾千位生物制藥領(lǐng)域的前沿科學(xué)家和精英工程師。在MIT 56 號(hào)樓和一些校內(nèi)報(bào)告廳，以及美國(guó)化學(xué)工程師學(xué)會(huì)（AIChE）年會(huì)期間，我有幸與王先生有過(guò)幾次偶遇，王先生講話(huà)幽默風(fēng)趣，熱愛(ài)中華傳統(tǒng)文化和中式美食，對(duì)晚輩后生愛(ài)護(hù)有加。猶記得，2015 年夏天，“發(fā)酵工程”課程結(jié)業(yè)時(shí)，王先生坐著輪椅，與來(lái)自世界各地的50 多位畢業(yè)學(xué)員親切交談，對(duì)晚輩后生愛(ài)護(hù)之情溢于言表。傍晚的查爾斯河畔涼風(fēng)習(xí)習(xí)，楊柳依依，畢業(yè)晚宴上大家暢談學(xué)術(shù)理想，共享中式美食和波士頓龍蝦……

1985 年后，王先生的主要研究方向由微生物研究轉(zhuǎn)入了動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，成為了最早研究動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和生物大分子制藥（抗體蛋白等）的先驅(qū)科學(xué)家之一。王先生一生桃李滿(mǎn)天下，其弟子門(mén)生遍布美國(guó)和東亞地區(qū)，很多人都成為業(yè)界翹楚，創(chuàng)建了各種類(lèi)型的生物科技公司，比如Biogen、Moderna、義翹神州科技、Genentech 的創(chuàng)立都與王先生及其弟子的指導(dǎo)密切相關(guān)，王先生也受聘于50 多家生物制藥公司擔(dān)任科技咨詢(xún)顧問(wèn)。王先生的學(xué)生Noubar B.Afeyan 博士目前擔(dān)任旗艦先鋒創(chuàng)投（Flagship Pioneering Venture）公司的總裁，是生物制藥新銳Moderna 及其他38 家生物科技公司的創(chuàng)始人；Johnathan Dordick 博士是倫斯勒理工學(xué)院的講席教授（美國(guó)工程院院士），創(chuàng)立了三家生物科技公司（EnzyMed、Solidus Biosciences Inc、Redpin Therapeutics）；陳超群博士（Chen Chau-Chyun）目前擔(dān)任得州理工大學(xué)的講席教授（美國(guó)工程院院士），是Aspen 公司的創(chuàng)始人及副總裁；謝良志博士是義翹神州科技的創(chuàng)始人及總裁。

王先生一生著述豐厚，發(fā)表了230余篇科技論文［1］，每一篇論文都腳踏實(shí)地，注重工程實(shí)踐與基礎(chǔ)理論的結(jié)合，為我們后世生物工程學(xué)者之楷模。鑒于王先生對(duì)生物工程技術(shù)的開(kāi)創(chuàng)性工作，美國(guó)化學(xué)工程師學(xué)會(huì)（AIChE）、美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)（ACS）以及MIT 都設(shè)立了以王義翹先生名字命名的生化工程論壇，用以紀(jì)念王先生的卓越貢獻(xiàn)。本人有幸蒙先生教誨，被提名并獲取了2020 年“生物工程與生物技術(shù)王義翹獎(jiǎng)”（Biotechnology&Bioengineering Daniel IC Wang Award），于8月初在ACS 年會(huì)發(fā)表獲獎(jiǎng)報(bào)告感言并回顧先生貢獻(xiàn)，不想先生8 月29 日仙逝，心中無(wú)限悲戚，生化工程領(lǐng)域隕落了一位世界級(jí)的學(xué)者和先驅(qū)，我們也痛失了一位學(xué)貫中西、德高望重的師長(zhǎng)。王先生高風(fēng)亮節(jié)，治學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，心懷家國(guó)，提攜后進(jìn)，為我后輩楷模。此文總結(jié)的工作，很大程度上受益于王先生在MIT 創(chuàng)建的生物工程技術(shù)中心；謹(jǐn)以此文，總結(jié)并展望我和同事在MIT 所從事的主要工作，以寄托對(duì)先生的哀思，紀(jì)念先生的貢獻(xiàn)。愿我們傳承先生遺風(fēng)，肩負(fù)先生的治學(xué)理念，解決關(guān)系國(guó)計(jì)民生的實(shí)際問(wèn)題，為國(guó)為民，腳踏實(shí)地地推進(jìn)生化工程領(lǐng)域的工作，不負(fù)先生的教誨?？姼那叭嗽?shī)作一首，以作對(duì)先生家世的感懷，與讀者共勉：

不堪風(fēng)雨亂紅塵，

入山何處白云深。

故園咫尺千山路，

天涯猶有未歸人。

（作者注：前兩句出自國(guó)學(xué)大師南懷瑾的詩(shī)集，第三句源于清代詞人鄭板橋的《酷相思》，第四句出自明代文人徐熥的《寄弟》。）

2 引言

功能性油脂化合物與我們的日常生活息息相關(guān)。常見(jiàn)的功能性油脂化合物包括脂肪酸、羥基脂肪酸、脂肪醇、甘油三酯和磷酸甘油酯等（圖1）。其結(jié)構(gòu)共性為含有一個(gè)長(zhǎng)鏈的脂肪酸骨架，由于碳鏈長(zhǎng)度、不飽和度以及所攜帶的功能基團(tuán)的差異，進(jìn)而產(chǎn)生了油脂化合物獨(dú)特的雙親特性（amphiphilic）、凝固點(diǎn)（freezing point）和熱力學(xué)自組裝（thermodynamic self-assembly）特性。眾所周知，生物膜磷脂雙分子層提供了生命存在的原始屏障和生物膜的流體動(dòng)力學(xué)特性，使得細(xì)胞個(gè)體能夠在不同環(huán)境條件下，與外界保持動(dòng)態(tài)的物質(zhì)交換平衡；不同溫度和培養(yǎng)環(huán)境下，生物膜磷脂中脂肪酸的組分也迥異（在古菌等極端微生物中，細(xì)胞膜脂肪鏈以甘油醚的形式存在）。

圖1 油脂的分子結(jié)構(gòu)及重要脂肪酸分子Fig.1 The basic structure of triglyceride and the four impor?tant fatty acids:palmitic acid(C16∶0),oleic acid(C18∶1),linoleic acid(C18∶2),eicosapentaenoic acid(EPA,C20∶5)and α-linolenicacid(ALA,C18∶3).

功能性油脂廣泛應(yīng)用于食品營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)藥保健、美容護(hù)膚、動(dòng)物飼料以及農(nóng)業(yè)環(huán)保等諸多領(lǐng)域。ω-3 和ω-6 多不飽和脂肪酸，主要應(yīng)用于嬰幼兒奶粉，并有抗衰老、促進(jìn)心血管健康等保健功效［2］；羥基脂肪酸可以用于藥物傳遞載體以及聚合物單體；脂肪醇可用于保護(hù)涂層、潤(rùn)滑劑、乳化劑和化妝洗護(hù)用品領(lǐng)域。各種植物果實(shí)中的油脂（主要以甘油三酯的形式存在，比如棕櫚油、大豆油、可可脂、橄欖油、葵花籽油和花生油等），由于其獨(dú)特的結(jié)晶溫度和凝固點(diǎn)，賦予了其獨(dú)特的質(zhì)地（texture）和口感（mouthful feeling），廣泛用于食品、糖果、巧克力點(diǎn)心和美容護(hù)膚等領(lǐng)域。動(dòng)物的結(jié)構(gòu)性油脂（structuring fat）決定了大多數(shù)美食細(xì)膩豐富的口感，比如西班牙火腿、北京烤鴨、神戶(hù)牛排和法國(guó)鵝肝等（圖2），被視為肉類(lèi)中的珍品，油脂對(duì)這些美食的風(fēng)味及口感起到了不可替代的作用。黃油（butter）主要提煉自奶油，含有較多的短鏈脂肪酸，成為人們?nèi)粘ｏ嬍持斜貍涞牟牧?。臨床測(cè)試及運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)表明，健康的脂肪酸飲食，尤其是多不飽和脂肪酸中ω-3 與ω-6 脂肪酸的比例，與抗炎、皮膚健康、增肌減肥和免疫等機(jī)體功能有直接的關(guān)聯(lián)［3］。

圖2 油脂決定了一些肉類(lèi)食物的口感Fig.2 Lipids determine the mouthful feeling of major meat products:Iberico ham,Peking roasted duck,Kobe beef and Foie gras.

植物油脂的大量需求造成了熱帶雨林破壞，氣候變遷、生態(tài)多樣性的流失以及其他諸多環(huán)境和社會(huì)問(wèn)題［4-5］。微生物發(fā)酵不依賴(lài)于耕地和環(huán)境氣候，能夠高效轉(zhuǎn)化農(nóng)業(yè)廢棄可再生資源（比如生物質(zhì)纖維素等原材料），因此構(gòu)建可持續(xù)性油脂微生物發(fā)酵平臺(tái)是目前亟待解決的關(guān)鍵技術(shù)［6-7］。產(chǎn)油解脂耶氏酵母近來(lái)備受代謝工程領(lǐng)域的青睞，其原因如下：培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，能夠利用多種底物（包括揮發(fā)性有機(jī)酸及脂肪烴和石蠟等化合物）快速生長(zhǎng)［8-9］，無(wú)Crabtree效應(yīng)（不產(chǎn)乙醇）［10］，基因組中內(nèi)含子密度低，便于遺傳操作，遺傳工具特別是近年來(lái)基于Cas9［11］或者Cpf1［12-15］的基因編輯工具以及Golden-gate［16-19］和YaliBrick［20-21］克隆方法的開(kāi)發(fā)，眾多分子轉(zhuǎn)錄元件的鑒定［22-23］，以及基于Cre-LoxP 位點(diǎn)的多輪基因整合技術(shù)的實(shí)現(xiàn)［24］，使得解脂耶氏酵母成為了微生物油脂積累研究工作的新寵，解脂耶氏酵母也成為了生產(chǎn)單細(xì)胞油脂及衍生物的首選底盤(pán)宿主［25-26］。本文將從植物油脂的市場(chǎng)近況出發(fā)，引導(dǎo)讀者認(rèn)識(shí)到目前油脂供應(yīng)鏈所面臨的可持續(xù)發(fā)展等嚴(yán)峻問(wèn)題，以及發(fā)展微生物油脂轉(zhuǎn)化平臺(tái)的嚴(yán)重性和迫切性；圍繞產(chǎn)油酵母的高通量篩選及表型鑒定、碳源轉(zhuǎn)化率（yield）、發(fā)酵滴度（titer）、生產(chǎn)速率（productivity）、菌體生長(zhǎng)適用性（fitness）、代謝調(diào)控和生化動(dòng)力學(xué)模型等方面，作者將闡述關(guān)鍵的代謝工程及合成生物學(xué)策略，并對(duì)利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)高附加值植物油脂的經(jīng)濟(jì)可行性與技術(shù)可行性進(jìn)行展望。

3 棕櫚油和可可脂需求激增所帶來(lái)的負(fù)面環(huán)境效應(yīng)及可持續(xù)發(fā)展問(wèn)題

根據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部的報(bào)道，全球每年的植物油需求量達(dá)到了2 億噸，并且每年以3%～4.5%的比例增長(zhǎng)。棕櫚油占據(jù)了全球植物油脂總量的40%，2020 年全球棕櫚油的需求量為8000 萬(wàn)噸，主要用于食品飲料、能源、個(gè)人護(hù)理、化工原料以及醫(yī)藥等領(lǐng)域。棕櫚油原材料的年銷(xiāo)售額達(dá)到了800億美元（棕櫚油的價(jià)格大致為1000 美元/噸）。其他大宗植物油包括菜籽油、花生油、玉米油和葵花籽油等。全球3/4 的棕櫚油產(chǎn)自東南亞地區(qū)的馬來(lái)西亞以及印度尼西亞，棕櫚油及棕櫚園的開(kāi)發(fā)成為當(dāng)?shù)氐闹饕?jīng)濟(jì)來(lái)源。自1985 年以來(lái)，全球棕櫚油的需求每年以6%～7%的比例增長(zhǎng)，棕櫚園的過(guò)分開(kāi)發(fā)造成了熱帶雨林的破壞（deforestation）［4-5］，例如加里曼丹島（馬來(lái)西亞稱(chēng)為婆羅洲島，面積為75萬(wàn)平方公里，亞洲第一大島，世界第三大島）65%的熱帶雨林已經(jīng)消失，進(jìn)而導(dǎo)致當(dāng)?shù)貧夂蜃兓徒涤隃p少，生態(tài)多樣性的喪失、氣候的變遷以及棕櫚油產(chǎn)業(yè)帶來(lái)的環(huán)境污染進(jìn)而惡化當(dāng)?shù)氐淖貦皥@經(jīng)濟(jì)，目前的農(nóng)耕和育種技術(shù)僅能保證2%～3%的棕櫚油產(chǎn)量增長(zhǎng)，現(xiàn)實(shí)中一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題是，全球每年仍有4%的棕櫚油缺口（市值大概32億美元）亟需用可替代的生物技術(shù)加以解決。

與棕櫚油經(jīng)濟(jì)極為相似，全球可可脂的供應(yīng)鏈也受到了極大的影響。全球80%的可可脂產(chǎn)自非洲中西部國(guó)家，包括科特迪瓦、加納、喀麥隆和尼日利亞等?？煽晒╟oconuts）中提取的可可脂是制造巧克力的主要成分，全球可可果（cocoa beans）目前年均采集量為500 萬(wàn)噸，每噸可可果的價(jià)值在3300 美元，可可果原材料市場(chǎng)價(jià)值為165億美元，而成品巧克力銷(xiāo)售額已經(jīng)達(dá)到1310億美元，到2025 年，成品巧克力的市場(chǎng)預(yù)期在1800 億美元左右，目前可可果原材料的供應(yīng)遠(yuǎn)不能達(dá)到市場(chǎng)的增量需求，造成了大約500億美元成品巧克力的市場(chǎng)缺口。經(jīng)營(yíng)可可園也成為非洲中西部地區(qū)農(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源，同樣由于氣候的變遷、降雨的減少，農(nóng)耕技術(shù)的停滯不前，造成當(dāng)?shù)責(zé)釒в炅值倪^(guò)量砍伐［27-28］，進(jìn)而導(dǎo)致當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)與環(huán)境的惡化以及諸多社會(huì)倫理問(wèn)題（比如因貧困導(dǎo)致的兒童失學(xué)以及雇傭童工、奴工與男權(quán)盛行等社會(huì)問(wèn)題）。為達(dá)成可持續(xù)性的發(fā)展目標(biāo)，世界主要巧克力生產(chǎn)商，包括瑪氏（Mars）、雀巢（Nestlé）、德芙（Dove）、費(fèi)列羅（Ferrero Rocher）、好時(shí)（Hersey’s）、歌帝梵（Godiva）等公司均提出了未來(lái)5～10年用可持續(xù)性的可可脂完全替代傳統(tǒng)可可脂的發(fā)展藍(lán)圖。

從上述棕櫚油和可可脂的產(chǎn)量及未來(lái)市場(chǎng)預(yù)期，我們可以得出如下結(jié)論：植物油脂的供應(yīng)已經(jīng)成為了全球經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸之一。為了保證經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)性發(fā)展及解決當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境資源問(wèn)題，解脂耶氏酵母優(yōu)良的產(chǎn)油性能，將為我們實(shí)現(xiàn)高效細(xì)胞農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)（cellular agriculture economy）提供可能。因此，揭示產(chǎn)油酵母油脂合成的生化過(guò)程及代謝調(diào)控機(jī)制，構(gòu)建可持續(xù)的微生物油脂平臺(tái)，將能使我們較少依賴(lài)棕櫚園與可可園農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)，進(jìn)一步遏制熱帶雨林的濫伐以及降低溫室氣體的排放，由此將會(huì)帶來(lái)巨大的環(huán)境和生態(tài)效益，促進(jìn)可持續(xù)性的細(xì)胞農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，也能夠促進(jìn)當(dāng)?shù)孛裆睒s和早日實(shí)現(xiàn)全球碳達(dá)峰以及碳中和（carbon-neutrality）的目標(biāo)。

4 構(gòu)建解脂耶氏酵母油脂細(xì)胞工廠(chǎng)的代謝工程與生化工程策略

由于解脂耶氏酵母獨(dú)特的乙酰輔酶A 供應(yīng)模式和不同代謝途徑的精細(xì)分區(qū)，其合成malonyl-CoA 和HMG-CoA的效率很高。以解脂耶氏酵母為平臺(tái)，經(jīng)代謝工程改造后，該酵母已經(jīng)被用來(lái)生產(chǎn)一系列化合物，包括三乙酸內(nèi)酯（triacetic acid lactone）［29-30］、赤蘚糖醇［31］、脂肪醇［32-33］、脂肪烴［34］、ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸［35］、黃酮［36-38］、角鯊烯（squalene）［39-41］、青蒿二烯（amorphadiene）［42］、白藜蘆醇（resveratrol）［43-44］、對(duì)香豆酸（pcoumaric acid）［44］以及具有玫瑰香味的2-苯乙醇［44-45］、具有桃子香味的丁位癸內(nèi)酯（δdecalactone或γ-decalactone）［46-48］、具有抗腫瘤化療價(jià)值的紫桿菌素（violacein）［21，44］、具有抗病毒作用的天然產(chǎn)物［49］等高附加值化合物。由于細(xì)胞內(nèi)獨(dú)特的油脂疏水環(huán)境和代謝途徑的分區(qū)定位，解脂耶氏酵母尤其適合表達(dá)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝途徑［10，50］，例如萜烯類(lèi)化合物的合成需要特異性的細(xì)胞色素P450 氧化還原酶，解脂耶氏酵母內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂質(zhì)體為P450 的區(qū)位選擇性和立體選擇性以及高效電子傳遞提供了獨(dú)特的微環(huán)境［10，50］。南京師范大學(xué)的黃和課題組［51］、馬里蘭大學(xué)徐鵬課題組［10］和清華大學(xué)的李春課題組［52］已經(jīng)對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行了詳細(xì)的總結(jié)，在此不做贅述。本文將對(duì)碳源與油脂轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素，以及涉及解脂耶氏酵母代謝分區(qū)特異性的代謝工程策略進(jìn)行討論，闡明高產(chǎn)油脂解脂耶氏酵母的科學(xué)問(wèn)題所在，以期廣大代謝工程學(xué)者一起突破這一技術(shù)瓶頸，實(shí)現(xiàn)微生物油脂的可持續(xù)化生產(chǎn)。

4.1 胞質(zhì)NADPH 的供應(yīng)決定了碳源轉(zhuǎn)化率與油脂的產(chǎn)量

不同于釀酒酵母，解脂耶氏酵母細(xì)胞質(zhì)中乙酰輔酶A 主要來(lái)源于ATP：檸檬酸裂解酶。在碳源充足氮源饑餓狀態(tài)下，細(xì)胞為了充分回收利用氮源，AMP 脫氨酶活性增強(qiáng)，將細(xì)胞內(nèi)AMP 轉(zhuǎn)化為肌苷單磷酸（IMP）。AMP 為三羧酸循環(huán)中異檸檬酸脫氫酶（IDH）的天然變構(gòu)激活因子，由于AMP 水平的降低，IDH 的活性降低，將使得線(xiàn)粒體內(nèi)積累異檸檬酸。異檸檬酸經(jīng)順烏頭酸酶逆向反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)闄幟仕?，過(guò)量的檸檬酸將被排出線(xiàn)粒體，經(jīng)ATP 檸檬酸裂解酶，轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A和草酰乙酸。乙酰輔酶A 經(jīng)羧化后形成malonyl-CoA，轉(zhuǎn)?；?反應(yīng)后，malonyl-CoA 主要以malonyl-ACP 的形式存在（圖3）。β-酮酰-ACP（n）合成酶（β-ketoacyl-ACP synthase）將把malonyl-ACP 裝載到延伸的碳鏈上，依次形成β-酮酰-ACP（n+2）、β-羥酰-ACP（n+2）、β-烯酰-ACP（n+2）和β-脂酰-ACP（n+2）［7］。每?jī)蓚€(gè)碳原子的添加，需要2 個(gè)分子的還原性輔因子NADPH，依次參與β-酮酰-ACP 還原酶與β-烯酰-ACP還原酶所催化的反應(yīng)（圖3）。比如硬脂酸的合成需要8 輪malonyl-ACP 的縮合反應(yīng)，共計(jì)需要16 分子的NADPH 來(lái)完成還原反應(yīng)。由于解脂耶氏酵母細(xì)胞質(zhì)中不具有NADH 激酶或者NADH-NADPH 轉(zhuǎn)氫酶，NADH 并不能自由轉(zhuǎn)換為NADPH，在葡萄糖作為碳源情況下，解脂耶氏酵母主要的NADPH 來(lái)源為磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway）［53］。在磷酸戊糖途徑中，葡萄糖被磷酸化后，分別經(jīng)由6-磷酸葡萄糖脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，就會(huì)產(chǎn)生2 分子的NADPH。這一獲取還原力的途徑并非最佳選擇，原因在于6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶具有脫羧功能并產(chǎn)生CO2，解脂耶氏酵母每產(chǎn)生2 分子NADPH 以消耗1 分子CO2為代價(jià)。因此每合成1 分子硬脂酸（C18：0），細(xì)胞需要16 分子的NADPH，需要額外消耗4/3 分子的葡萄糖（C6H12O6）來(lái)提供這些還原力［54-55］。硬脂酸骨架中18 個(gè)碳原子，來(lái)源于9 個(gè)乙酰輔酶A 分子，相對(duì)應(yīng)于4.5 分子的葡萄糖（1/3 的碳原子經(jīng)過(guò)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體脫羧后丟失）。因此，每合成1 分子硬脂酸（C18：0），需要4.5 分子葡萄糖提供碳原子骨架，另外需要4/3 分子葡萄糖提供NADHP 還原力，對(duì)應(yīng)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系為，對(duì)應(yīng)于每消耗5.83（4.5+4/3）分子葡萄糖，產(chǎn)生1 分子硬脂酸。理論硬脂酸的得率為0.271 g 硬脂酸/g 葡萄糖［54，56］。理論得率越高，消耗的起始碳源越少；原材料通常占據(jù)生產(chǎn)成本的50%，選取高效的NADPH 替代途徑，將對(duì)提高碳源轉(zhuǎn)化率、降低碳源消耗和壓縮生產(chǎn)成本，起到至關(guān)重要的作用。

圖3 脂肪酸碳鏈延伸過(guò)程需要還原性輔因子NADPH（n表示碳鏈長(zhǎng)度）Fig.3 The enzymatic elongation cycle of fatty acids needs reducing equivalents NADPH(n is the chain-length of carbon backbones)

從以上分析可知，輔酶NADPH 的供應(yīng)效率，決定了脂肪酸的理論得率。產(chǎn)油酵母細(xì)胞中存在了諸多NADPH 的替代途徑，作者在此已將可能的替代途徑及其對(duì)應(yīng)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系歸納，并計(jì)算了各自替代途徑的脂肪酸得率。為了提高解脂耶氏酵母產(chǎn)油的得率，Stephanopoulous 課題組系統(tǒng)地測(cè)試了不同還原型輔酶（NADPH）替代途徑對(duì)解脂耶氏酵母合成甘油三酯的影響，通過(guò)NADPH的化學(xué)計(jì)量關(guān)系的理論計(jì)算并探索最佳的NADPH替換途徑［56］。作者系統(tǒng)性地分析比較了磷酸戊糖途徑，NADPH-特異性的3-磷酸甘油醛脫氫酶（NADPHspecific 3-phosphoglyceraldehyde dehydrogenase），丙酮酸-草酰乙酸-蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)氫反應(yīng)（pyruvateoxaloacetate-malate transhydrogenase cycle），以及非氧化性糖酵解途徑（non-oxidative glycolysis pathway）產(chǎn)生還原性輔因子NADPH 效率的差異（圖4），構(gòu)建了一系列重組解脂耶氏酵母，發(fā)現(xiàn)NADPH-特異性的3-磷酸甘油醛脫氫酶（NADPHspecific GAPDH）與異源表達(dá)的蘋(píng)果酸酶（malic enzyme），能夠高效地彌補(bǔ)磷酸戊糖途徑NADPH還原力的不足，改造后的解脂耶氏酵母能夠高效地整合乙酰輔酶A（acetyl-CoA）和NADPH，其產(chǎn)油量高達(dá)99.7 g/L，油脂的過(guò)程得率達(dá)到了0.27 g脂肪酸甲酯/g 葡萄糖，油脂積累速度達(dá)到了1.2 g/（L·h）［56］。這一結(jié)果使我們朝向構(gòu)建可持續(xù)性的微生物油脂平臺(tái)邁進(jìn)了一大步。

圖4 不同還原性輔因子替代途徑對(duì)脂肪酸合成效率的影響［56］（圖示中包含了以下四種途徑：①磷酸戊糖途徑；②NADPH-特異性的3-磷酸甘油醛脫氫酶；③丙酮酸-草酰乙酸-蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)氫反應(yīng)；④非氧化性糖酵解途徑）Fig.4 Carbon conversion efficiency from NADPH for fatty acids synthesis pathways[56](OxPP—oxidative pentose phosphate pathway;GAPHD—NADPH-specific glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;POM cycle—pyruvate-oxaloacetate-malate transhydrogenase cycle;NOG—non-oxidative glycolytic pathway)

基于解脂耶氏酵母的氧化應(yīng)激防御機(jī)制（oxidative stress defense pathway），Jayakody 等發(fā)現(xiàn)該酵母積累過(guò)多的親核的負(fù)電自由基，包括脂質(zhì)過(guò)氧化物、超氧化物和自由醛基等，這些負(fù)電陰離子損傷蛋白質(zhì)催化功能，影響DNA 復(fù)制的保真性［57］，并促使細(xì)胞凋零，菌體呈現(xiàn)假菌絲狀（hyphae）。為克服這一缺陷，該課題組加強(qiáng)了氧化還原的保護(hù)力，過(guò)表達(dá)了NADPH 途徑以及谷胱甘肽還原酶和過(guò)氧化酶，改造后的解脂耶氏酵母能夠更好地抵抗氧化壓力，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)單細(xì)胞、圓球形，細(xì)胞的甘油三酯含量顯著提高至81.4%，甘油三酯的生產(chǎn)速率提高至0.97 g/（L·h）［58］。

4.2 解脂耶氏酵母脂肪酸合成酶的改造以及基于酶活分區(qū)的代謝工程策略

解脂耶氏酵母能夠高效合成油脂的生物基礎(chǔ)在于其胞內(nèi)高度特異性的功能化分區(qū)［59］，其中脂肪酸的合成效率高度依賴(lài)于脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A 羧化酶以及蘋(píng)果酸酶所形成的超酶復(fù)合體（lipid metabolon）［60-61］，甘油三酯的合成與組裝需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與脂質(zhì)體的協(xié)同作用。酶分子的空間定位及細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)的分區(qū)，能夠大大增加中間底物傳遞和轉(zhuǎn)化的效率，同時(shí)能夠有效地降低不穩(wěn)定底物的流失，自然界廣泛存在的亞細(xì)胞水平超酶復(fù)合體，包括糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)以及脂肪酸合成等，均已被細(xì)胞成像技術(shù)證實(shí)。為了充分配置并利用亞細(xì)胞水平的不同功能分區(qū)，Stephanopoulos 課題組首次在解脂耶氏酵母中，將具有脂酰輔酶A（acyl-CoA）和脂酰ACP（acyl-ACP）還原以及水解功能等特異性的酶定位表達(dá)于線(xiàn)粒體、脂質(zhì)過(guò)氧化物體（peroxisome）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）等亞細(xì)胞器中，改造了產(chǎn)油酵母的生產(chǎn)性狀，并配合脂肪醛脫羰酶（aldehyde decarbonylase）或者脂酰輔酶A 還原酶（fatty acyl-CoA reductase），使得遺傳改造后的酵母產(chǎn)生成了具有生物燃料特征的烷烴類(lèi)、烯烴類(lèi)和脂肪醇等化合物［32］。釀酒酵母，經(jīng)代謝工程改造后，能夠生成10.4 g/L 的游離脂肪酸和1.5 g/L 的脂肪醇［62］。另外通過(guò)表達(dá)異源脂肪酸合成酶，于濤等在釀酒酵母中成功表達(dá)了分枝桿菌的脂肪酸合成體系，結(jié)合acyl-CoA 還原酶，生成了24 個(gè)碳原子的脂肪醇［63］。通過(guò)表達(dá)脂酰輔酶A 光脫羧酶（fatty acyl-CoA photodecarboxylase），改造后的解脂耶氏酵母能夠利用葡萄糖合成將近1.5 g/L 的脂肪烷（烯）烴［34］。

脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度，決定了生物柴油的理化性質(zhì)和燃燒性能，比如凝固點(diǎn)和揮發(fā)性等；短鏈功能性油脂分子，易于被動(dòng)物和人體吸收，通常營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也高。因此，控制脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度，成為代謝工程研究的熱點(diǎn)之一。細(xì)菌的脂肪酸合成酶由5 個(gè)單體亞基構(gòu)成，每個(gè)蛋白亞基負(fù)責(zé)不同的催化功能，其不同亞基間結(jié)合松散，易于工程改造；與細(xì)菌不同，真菌中脂肪酸合成酶由兩條肽鏈編碼，每條肽鏈大概有2000 個(gè)氨基酸，分別編碼脂肪酸合成酶的不同功能域。蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析表明，真菌脂肪酸合成酶兩條肽鏈組成一個(gè)多聚體的分子籠狀結(jié)構(gòu)，不同碳鏈長(zhǎng)度的脂酰-ACP（四碳到十四碳）中間體被包裹在脂肪酸合成酶分子籠內(nèi)部［64］，直至棕櫚酰-ACP，碳鏈增加到16才能被脂肪酸合成酶釋放，并經(jīng)過(guò)MPT 結(jié)構(gòu)域（malonyl/palmitoyl transacylase）將棕櫚酰-ACP 轉(zhuǎn)變?yōu)樽貦磅?CoA（C16∶0），所生成的棕櫚酰-CoA通過(guò)脂肪酸延長(zhǎng)酶（elongase）和去飽和酶（desaturase）依次生成硬脂酰-CoA（C18∶0）和油酰-CoA（C18∶1），并依次加載到3-磷酸甘油骨架上，合成各種脂類(lèi)化合物（圖5）。在真菌中，通過(guò)直接表達(dá)脂酰-ACP 硫解酶（fatty acyl-ACP thioesterase）來(lái)生產(chǎn)短鏈脂肪酸的效率低。通過(guò)蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)，Xu 等［32］將解脂耶氏酵母中脂肪酸合成酶的 MPT（malonyl/palmitoyl transacylase）結(jié)構(gòu)域替換為具有acyl-CoA 水解功能的結(jié)構(gòu)域，改造后的酵母能夠生產(chǎn)具有不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸分子（C12、C14和C16等），提高了解脂耶氏酵母的工業(yè)利用價(jià)值。另外通過(guò)蛋白工程手段，定向改造ACP 結(jié)構(gòu)域［65］、酮脂酰ACP合成酶結(jié)構(gòu)域和MPT 轉(zhuǎn)?；Y(jié)構(gòu)域，能夠使釀酒酵母生產(chǎn)短鏈的脂肪酸，C6和C8脂肪酸的產(chǎn)量達(dá)到了100～250 mg/L［66］。由此看出，蛋白理性改造能夠有效控制脂肪酸合成過(guò)程碳鏈的延伸，德國(guó)Max Planck Institute 的Ashwin Chari 課題組以及法蘭克福大學(xué)Eckhard Boles 課題組對(duì)此進(jìn)行了詳細(xì)的結(jié)構(gòu)生物分析［66-67］，進(jìn)一步闡釋了脂肪酸的碳鏈長(zhǎng)度調(diào)控機(jī)制，為定向改造產(chǎn)油酵母生產(chǎn)短鏈和中等碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸和油脂化合物提供了理論基礎(chǔ)。

圖5 解脂耶氏酵母合成功能性油脂的生化過(guò)程Fig.5 The biochemical scheme of synthesizing triglycerides in Y.lipolytica

4.3 解脂耶氏酵母油脂合成的分子調(diào)控機(jī)制

氮源饑餓（nitrogen starvation）所造成的異檸檬酸脫氫酶活性減弱和ATP：檸檬酸裂解酶活性增強(qiáng)是產(chǎn)油酵母開(kāi)啟油脂合成的重要生化特征。其中一個(gè)重要前提是，AMP 脫氨酶活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)AMP 水平下降，進(jìn)而導(dǎo)致異檸檬酸脫氫酶活性減弱［68］。雖然目前學(xué)術(shù)界缺乏氮源饑餓導(dǎo)致AMP 脫氨酶活性增強(qiáng)的直接生化證據(jù)，過(guò)量表達(dá)AMP 脫氨酶后能夠使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多的乙酰輔酶A，進(jìn)而使得解脂耶氏酵母積累較多番茄紅素（lycopene）［69］。然而直接過(guò)表達(dá)AMP 脫氨酶，似乎并不能顯著提高產(chǎn)油酵母油脂的積累，表明產(chǎn)油酵母油脂的積累存在其他關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，或者AMP 脫氨酶的調(diào)控有可能發(fā)生在蛋白翻譯后修飾（post-translational modification）水平上［70］。最近也有其他報(bào)道，比如過(guò)表達(dá)AMP 脫氨酶后能夠使產(chǎn)油真菌Mortierella alpina中油脂含量提高15%～34%［71］。

Snf1/AMPK 是真核生物中高度保守的碳源與能量調(diào)控蛋白。有關(guān)真菌中碳源代謝，主要涉及Snf1/AMPK 相關(guān)的應(yīng)激活化蛋白激酶，近來(lái)成為了研究解脂耶氏酵母油脂積累機(jī)理的調(diào)控?zé)狳c(diǎn)［72］。SNF1/AMPKs 通常以異三聚體復(fù)合物（heterotrimeric complex）的形式存在，主要由具催化功能的α-亞基（Snf1）和兩個(gè)調(diào)控亞基組成，調(diào)控亞基包含了β-亞基（Sip1、Sip2 或Gal83）和γ-亞基（Snf4），解脂耶氏酵母中含有高度保守的Snf1/AMPK 系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)Blast分析，Snf1、Snf4、Gal83和Sip2分別對(duì)應(yīng)于解脂耶氏酵母的YALI0D02101g、YALI0C03421g、YALI0E13926p 和YALI0C00429p 等編碼序列［72］。杜邦的科學(xué)發(fā)現(xiàn)Snf1 缺失的解脂耶氏酵母能夠高效積累油脂，包括EPA 等不飽和脂肪酸，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)基因芯片和實(shí)時(shí)定量PCR 分析，他們發(fā)現(xiàn)Snf1活性缺失，能夠激活油脂積累代謝途徑［72］。

近年來(lái)，系統(tǒng)水平的多組學(xué)分析手段，包括蛋白組、磷酸蛋白組和代謝組學(xué)分析，已經(jīng)被廣泛用于研究解脂耶氏酵母的碳源、能量代謝以及油脂積累的積累。其中，美國(guó)西北太平洋國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的Scott Baker課題組發(fā)現(xiàn)氮源氨基酸代謝，與解脂耶氏酵母脂肪酸的積累息息相關(guān)。比如，在氮源饑餓狀態(tài)下，核糖體結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)高度下調(diào)，預(yù)示油脂積累階段蛋白表達(dá)的減弱［73］；細(xì)胞為了回收利用含氮化合物，包括丙氨酸、腐胺（putrescine）、亞精胺（spermidine）和尿素（urea）等化合物將會(huì)被分解，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生糖醇和三羧酸循環(huán)代謝相關(guān)的溢出代謝物，包括甘露醇、赤蘚糖醇以及檸檬酸、富馬酸和蘋(píng)果酸等副產(chǎn)物。在氮源限制情況下，該課題組通過(guò)磷酸蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了1219 個(gè)新的磷酸化位點(diǎn)，其中133 個(gè)磷酸化位點(diǎn)與氮源饑餓顯著關(guān)聯(lián)［73］，這些磷酸化位點(diǎn)主要集中于蛋白激酶和具DNA 結(jié)合活性的轉(zhuǎn)錄因子。在酶學(xué)水平，磷酸化主要修飾脂肪合成途徑的ATP：檸檬酸裂解酶和乙酰輔酶A 羧化酶，同時(shí)磷酸化導(dǎo)致了脂肪酸氧化降解途徑的減弱，這一研究表明磷酸化調(diào)控是油脂積累的關(guān)鍵成因。

通過(guò)不同碳氮比條件下的恒化器培養(yǎng)，Nielsen 課題組對(duì)解脂耶氏酵母積累油脂的調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究。通過(guò)全基因組規(guī)模的RNAseq 測(cè)序，該課組發(fā)現(xiàn)油脂的積累，不依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控；脂肪酸碳流的代謝調(diào)控主要發(fā)生在氨基酸代謝途徑［74］，由此發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成前體acetyl-CoA，很大一部分來(lái)源于氨基酸的代謝氧化，這一結(jié)論與Alper課題組發(fā)現(xiàn)的亮氨酸/異亮氨酸代謝參與解脂耶氏酵母脂肪酸合成相互佐證［75］。有關(guān)解脂耶氏酵母中氮源代謝調(diào)控，Pomraning 等［76］最近揭示了氮源代謝阻遏（nitrogen catabolite repression）與GATA 家族鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子（GATA zinc finger transcription factors）之間的關(guān)聯(lián)。比如刪除鋅指轉(zhuǎn)錄因子gzf3和gzf2，會(huì)造成細(xì)胞氮源特異性的生長(zhǎng)缺陷和油脂的大量積累。另外碳源代謝阻遏因子mig1 也與鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的活性相關(guān)［76］。揭示碳源與氮源代謝調(diào)控因子將會(huì)加深我們對(duì)解脂耶氏酵母積累油脂的分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)。未來(lái)5～10年，我們期望解脂耶氏酵母領(lǐng)域的科學(xué)工作者，將會(huì)描繪一幅更加清晰的碳源/氮源調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為我們構(gòu)建可持續(xù)性的細(xì)胞油脂工廠(chǎng)奠定基礎(chǔ)。

4.4 產(chǎn)油酵母合成油脂的生化過(guò)程動(dòng)力學(xué)建模

在生物加工制造過(guò)程中，生化過(guò)程動(dòng)力學(xué)建模能夠給我們提供最優(yōu)化的發(fā)酵控制參數(shù)。對(duì)生物過(guò)程的動(dòng)態(tài)分析，有助于我們根據(jù)細(xì)胞的生理狀態(tài)，制定最優(yōu)化的細(xì)胞生長(zhǎng)和控制參數(shù)，從而最大限度地提高碳源的利用率，增加細(xì)胞強(qiáng)度，降低生產(chǎn)成本與提高經(jīng)濟(jì)可行性［77］。油脂分子屬于胞內(nèi)積累的代謝產(chǎn)物，油脂的過(guò)量積累會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的適應(yīng)性（growth fitness）產(chǎn)生負(fù)面影響，目前常用的動(dòng)力學(xué)模型主要考慮胞外產(chǎn)物、酶蛋白活性、或者次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累，比如檸檬酸［78］、納豆激酶［79］和靈芝酸［80］等的動(dòng)力學(xué)，此類(lèi)生化過(guò)程建模相對(duì)簡(jiǎn)單。有關(guān)油脂化合物積累的動(dòng)力學(xué)模型已經(jīng)擴(kuò)展到微藻［81］和解脂耶氏酵母［82］，所構(gòu)建的模型并沒(méi)有考慮油脂合成對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響、過(guò)程得率等經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。為了進(jìn)一步加深對(duì)解脂耶氏酵母積累油脂發(fā)酵過(guò)程的認(rèn)識(shí)，作者將細(xì)胞總生物量（Xtotal）分為油脂（P）和非油脂生物量（oil-free biomass，X），并引入一個(gè)負(fù)擔(dān)系數(shù)（γ）來(lái)描述油脂積累對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。根據(jù)生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)原則，分批培養(yǎng)條件下，油脂積累的非結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)模型可以歸納如表1。

表1 產(chǎn)油酵母胞內(nèi)積累油脂的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)描述Tab.1 Fermentation kinetics of the oil accumulation process in oleaginous yeast in batch culture

方程（1）描述細(xì)胞的生長(zhǎng)適應(yīng)性受到油脂積累的影響，負(fù)擔(dān)系數(shù)（0<γ<1）越大，油脂積累（P）越多，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率越小。負(fù)擔(dān)系數(shù)取決于菌株表達(dá)的基因多少。方程（2）描述細(xì)胞的生長(zhǎng)取決于比生長(zhǎng)速率和比死亡速率。方程（3）描述胞內(nèi)產(chǎn)物油脂的積累取決于生長(zhǎng)相關(guān)的因子（α）和非生長(zhǎng)相關(guān)的因子（β）。方程（4）則描述底物的消耗取決于細(xì)胞的生長(zhǎng)與油脂的積累，其中細(xì)胞得率系數(shù)由YX/S給出，油脂得率系數(shù)由YP/S給出。方程（5）描述總的生物量（Xtotal）由油脂（P）和非油脂生物量（oil-free biomass，X）構(gòu)成。方程（6）給出了細(xì)胞的動(dòng)態(tài)含油量。方程（7）描述了動(dòng)態(tài)過(guò)程得率（Yprocess），由初始和終態(tài)的底物濃度（S0、Sf）和產(chǎn)物濃度（Pf、P0）決定。方程（8）描述了細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)強(qiáng)度。通常過(guò)程得率（Yprocess）、生產(chǎn)強(qiáng)度（r）和產(chǎn)量（P）具有復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，細(xì)胞內(nèi)油脂含量越高，對(duì)細(xì)胞的負(fù)荷也越重，但產(chǎn)物的分離提取也越容易；生產(chǎn)強(qiáng)度越高，設(shè)備的利用率就越大，越容易降低生產(chǎn)成本；過(guò)程得率越高，單位糖耗產(chǎn)生的油脂越高，原材料成本就越低。在分批發(fā)酵下，發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化取決于最優(yōu)的含油量和含油組分，這種多產(chǎn)物多組分系統(tǒng)將會(huì)動(dòng)態(tài)影響終端產(chǎn)物的成本。獲取實(shí)罐動(dòng)態(tài)發(fā)酵數(shù)據(jù)，包括菌體濃度、含油量、底物消耗和油脂產(chǎn)量，進(jìn)一步可以通過(guò)最小二乘非線(xiàn)性回歸（least square nonlinear regression）求得各個(gè)發(fā)酵參數(shù)，進(jìn)而可以模擬不同碳源流加速率情況下，探索最優(yōu)化的發(fā)酵控制策略。在連續(xù)培養(yǎng)的恒化器中，上述動(dòng)力學(xué)模型可能存在解析解，獲取解析解，將會(huì)為我們優(yōu)化脂類(lèi)化合物生產(chǎn)和控制發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生有益的指導(dǎo)。

5 產(chǎn)油酵母的高通量篩選及表型鑒定技術(shù)

發(fā)展微生物單細(xì)胞油脂，構(gòu)建高效的底盤(pán)微生物轉(zhuǎn)化平臺(tái)，需要與之相匹配的油脂化合物高通量篩選及微生物表型鑒定技術(shù)。傳統(tǒng)的油脂分析和微生物代謝物篩選平臺(tái)，很大程度上依賴(lài)于有機(jī)溶劑萃?。ū热缃?jīng)典的Folch 方法），轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，最終油脂以脂肪酸甲酯的形式存在，須經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用，借此分析脂肪酸的組分（碳鏈長(zhǎng)度和不飽和鍵等位置）。此方法需要去除水分，機(jī)械振蕩破裂細(xì)胞，在堿性溶液中利用皂化反應(yīng)水解細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯，去除細(xì)胞膜和雜蛋白等干擾，進(jìn)一步以無(wú)水硫酸為催化劑，催化游離脂肪酸與甲醇縮合，產(chǎn)生脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯經(jīng)疏水溶劑萃取后（一般用正己烷），經(jīng)過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用分析。此法樣品回收率低，準(zhǔn)確度依賴(lài)于皂化反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)和萃取效率，反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不足以滿(mǎn)足產(chǎn)油酵母高通量篩選的要求。

高通量篩選及表型鑒定是構(gòu)建微生物油脂平臺(tái)的核心技術(shù)?；谟椭奶禺愋詿晒馊旧珓?、近紅外光譜、拉曼光譜，結(jié)合流式細(xì)胞儀與微流體技術(shù)，將會(huì)為構(gòu)建高效的油脂細(xì)胞工廠(chǎng)提供一把利刃。所謂“工欲善其事，必先利其器”。近年來(lái)，一些學(xué)者開(kāi)發(fā)了油脂分子探針（Bodipy，Invitrogen公司），能夠在活體細(xì)胞內(nèi)特異性地與長(zhǎng)鏈油脂分子結(jié)合，受到480 nm 激發(fā)，進(jìn)而釋放510 nm 波段特異性的熒光。與傳統(tǒng)的尼羅河紅染色劑（Nile red）相比，Bodipy 具有靈敏度高、樣品處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。另外，Bodipy 可用于解脂耶氏酵母脂質(zhì)體（lipid droplet 或者lipid body）的染色，用于細(xì)胞生物學(xué)和油脂積累的研究［83］?；谀崃_河紅和Bodipy，近來(lái)學(xué)者開(kāi)發(fā)了快速、簡(jiǎn)易的微藻中油脂定量方法，作者總結(jié)了兩種染色劑的應(yīng)用范圍，特別提到了各自染色劑的準(zhǔn)確性受到光譜特性、熒光染色劑濃度、有機(jī)溶劑、細(xì)胞濃度、溫度以及反應(yīng)時(shí)間的影響［84］。需要特別指出的是，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的Bodipy 方法，可以準(zhǔn)確快速地用來(lái)篩選高產(chǎn)油脂的解脂耶氏酵母［85］，篩選出的解脂耶氏酵母，產(chǎn)油量高達(dá)85 g/L，細(xì)胞含油量達(dá)到了77%，產(chǎn)油速率達(dá)到了0.73 g/（L·h）。

除了熒光劑以外，一些在線(xiàn)油脂檢測(cè)手段，比如近紅外光譜（infrared spectra）和拉曼光譜（Raman spectra），成為了研究胞內(nèi)油脂積累的新型分析工具。脂類(lèi)分子中的酯鍵含有甲氧基和羰基，脂分子中交替的亞甲基以及不飽和雙鍵，以及稀有的羥基都會(huì)產(chǎn)生特征性的紅外光譜吸收?；诖?，可以采用傅里葉變換近紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy）來(lái)檢測(cè)細(xì)胞組分的動(dòng)態(tài)變化，特別是胞內(nèi)油脂含量、胞內(nèi)碳源與氮源變化的比例，基于脂質(zhì)/氨氮和碳源/氨氮的比例，作者進(jìn)而確定了利用紅外光譜進(jìn)行精確油脂定量和微藻細(xì)胞篩選的方法［86］。為了精確確定產(chǎn)油酵母胞內(nèi)油脂積累的動(dòng)力學(xué)，近來(lái)一些學(xué)者建立了基于傅里葉變換近紅外光譜的脂類(lèi)定量模型［87］。作者選取了3 種產(chǎn)油酵母（Rhodotorula toruloidesCBS 14，Lipomyces starkeyiCBS 1807 和Yarrowia lipolyticaCBS 6114），利用偏最小二乘回歸（partial least squares regression），進(jìn)而確定了對(duì)應(yīng)3 種酵母的油脂含量定量模型，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證，混合樣品油脂含量與模型預(yù)測(cè)達(dá)到了高達(dá)90.5%的相關(guān)性，單一產(chǎn)油酵母模型預(yù)測(cè)的相關(guān)性高達(dá)96%～98%，這一方法的建立，將會(huì)極大簡(jiǎn)化產(chǎn)油酵母高通量篩選。

拉曼光譜主要來(lái)研究晶格中分子的振動(dòng)頻率或者轉(zhuǎn)動(dòng)頻率，其發(fā)射光源可以為可見(jiàn)光、近紅外光和近紫外光等。拉曼光譜，已經(jīng)用來(lái)定量檢測(cè)脂質(zhì)分子的脂肪酸組成，包括碳鏈長(zhǎng)度以及不飽和度等關(guān)鍵數(shù)據(jù)［88］，其精度也達(dá)到了傳統(tǒng)的氣質(zhì)聯(lián)用方法。此外，拉曼光譜具有不破壞細(xì)胞體、樣品處理簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。根據(jù)激發(fā)態(tài)拉曼散射光譜技術(shù)（stimulated Raman scattering microscopy），哈佛大學(xué)謝曉亮課題組在單細(xì)胞水平對(duì)3種產(chǎn)油酵母積累油脂的過(guò)程進(jìn)行了分子表征（美國(guó)能源部報(bào)告https：//doi.org/10.2172/1418344），結(jié)合微流體技術(shù)，該課題組能夠分離出高產(chǎn)油脂的酵母菌株，進(jìn)一步通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，確定了產(chǎn)油基因調(diào)控的關(guān)鍵位點(diǎn)，該研究為產(chǎn)油酵母的油脂積累機(jī)理、表型及基因型高通量鑒定提供了基礎(chǔ)。另外，最新發(fā)展的微流體微滴技術(shù)［89］也為產(chǎn)油酵母的表型快速鑒定與細(xì)胞分離提供了可能。通過(guò)光化學(xué)和級(jí)聯(lián)質(zhì)譜（photochemistry and tandem MS），最近學(xué)者也可以精確測(cè)定C==C 雙鍵的位置以及甘油三酯sn1、sn2和sn3位置的脂肪酸類(lèi)型［90］。

6 解脂耶氏酵母生產(chǎn)棕櫚油脂和可可脂的經(jīng)濟(jì)與技術(shù)可行性分析

以下我們將對(duì)解脂耶氏酵母生產(chǎn)植物油脂的經(jīng)濟(jì)可行性進(jìn)行分析。世界主要油料作物包括黃豆、葵花籽、油菜、可可果和棕櫚果等（表2）。根據(jù)主要油料作物每公頃的產(chǎn)出及其含油量，我們大致可以推算出每公頃油料作物每年的產(chǎn)油得率［t/（hm2·a）］。依據(jù)單位面積的產(chǎn)油得率（表2），棕櫚樹(shù)拔得頭籌，具有最高的產(chǎn)油率，1 hm2的棕櫚樹(shù)每年可以產(chǎn)出3.69 t棕櫚油；相比而言，1 hm2油菜和葵花每年的產(chǎn)油得率分別為0.9 t和0.85 t；其中可可樹(shù)的產(chǎn)油得率最低，1 hm2的可可樹(shù)每年可以產(chǎn)約0.4 t 可可脂。單位面積可可樹(shù)的產(chǎn)油脂率低，造成了可可脂的高價(jià)（6000～8000 美元/t，干燥可可果的價(jià)格在3000 美元/t），相比而言，棕櫚油的價(jià)格僅為900 美元/t。從這些數(shù)據(jù)，我們大致可以看出這些油料作物的產(chǎn)率及相對(duì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。更為重要的是，棕櫚樹(shù)和可可樹(shù)主要種植在熱帶雨林氣候（東南亞、拉丁美洲和非洲西部），中國(guó)的氣候不適宜種植熱帶雨林作物，這種結(jié)構(gòu)性的短缺，也會(huì)因?yàn)榈赜蚣罢蔚挠绊懠觿〈祟?lèi)油料作物價(jià)格的波動(dòng)，因此，我們亟需找到可替代的生物制造途徑，以彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)原材料供應(yīng)的短缺。

假定可以用產(chǎn)油酵母轉(zhuǎn)化淀粉質(zhì)或者蔗糖類(lèi)作物生產(chǎn)功能性油脂，解脂耶氏酵母生產(chǎn)油脂的極限得率為0.271 g 油脂/g 葡萄糖，根據(jù)主要糖料作物單位面積的產(chǎn)量和含糖量，我們可以大致推算出，1 hm2糖料作物經(jīng)酵母轉(zhuǎn)化后的最大產(chǎn)油得率（表3）。在常用的糖料作物中，種植1 hm2甘蔗，其中蔗糖經(jīng)解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化后，最大產(chǎn)油得率可以達(dá)到3.07 t/（hm2·a），接近于1 hm2棕櫚樹(shù)的產(chǎn)油率［3.69 t/（hm2·a）］（表2）；而種植1 hm2玉米，其中淀粉經(jīng)解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化后，最大產(chǎn)油得率可以達(dá)到2.15 t/（hm2·a）（表3）；甘蔗和玉米作為原材料的產(chǎn)油得率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于紅薯［1.36 t/（hm2·a）］。巴西的甘蔗年產(chǎn)量已達(dá)6.7 億噸（670 000 000 t，濕重），為產(chǎn)油酵母的工業(yè)化生產(chǎn)提供了極為廉價(jià)的原料底物。考慮到生物轉(zhuǎn)化和發(fā)酵中其他成本（比如淀粉水解，原材料預(yù)處理，氮源消耗，水電，人工以及油脂的提取分離）占理論轉(zhuǎn)化成本的50%，利用甘蔗作為原材料的油脂得率為1.54 t/（hm2·a），假定碳源轉(zhuǎn)化率占理論轉(zhuǎn)化率（0.271 g/g）的75%，實(shí)際的功能性油脂的真實(shí)得率為1.16 t/（hm2·a）?？紤]到終端產(chǎn)物的價(jià)值鏈，棕櫚油主要用于工業(yè)加工，其他植物油（玉米油、花生油和菜籽油等）主要用于食品烹炸，可可脂的主要用途是制作巧克力，以可可脂的售價(jià)為7000 美元/t 計(jì)，種植1 hm2甘蔗，所產(chǎn)蔗糖作為底物經(jīng)產(chǎn)油解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化后的毛利潤(rùn)可以達(dá)到8120 美元/（hm2·a）；玉米等主要糧食作物的價(jià)格在210 美元/t，種植1 hm2玉米的毛利潤(rùn)在2247 美元/（hm2·a），與1 hm2甘蔗的毛收益［2100 美元/（hm2·a）］相近，就價(jià)值而言，利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)可可脂，可以將原材料（甘蔗）的經(jīng)濟(jì)價(jià)值提高2.86 倍，將玉米的經(jīng)濟(jì)價(jià)值提高2.6 倍。目前Nielsen 課題組已經(jīng)在釀酒酵母中嘗試表達(dá)可可脂合成的關(guān)鍵化學(xué)步驟，所產(chǎn)的油脂成分接近于可可脂，但產(chǎn)量與工業(yè)化大規(guī)?；a(chǎn)還有一定差距［91-93］。宋元達(dá)課題組利用了解脂耶氏酵母中的sn2 特異性的脂肪酶，將羊油脂中sn2 位置的飽和脂肪酸替換為油酸，得到了更加健康且脂肪酸組成接近可可脂的組分［94］；另外該課題組也優(yōu)化了解脂耶氏酵母生產(chǎn)可可脂的發(fā)酵條件，確定了以甘油和酒石酸氨為發(fā)酵原料，并發(fā)現(xiàn)升高發(fā)酵溫度有助于促進(jìn)可可脂的生成［95］。

表2 世界主要油料作物的單位面積產(chǎn)量及產(chǎn)油得率Tab.2 The unit area output and maximal oil yield from major oil crops.

表3 以糖料作物為原料經(jīng)解脂耶氏酵母轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)油得率Tab.3 The maximal oil yield from Y.lipolytica converting sugar feedstock from corn,sweet potato or sugarcane.

更為有利的是，相比于棕櫚樹(shù)，解脂耶氏酵母所產(chǎn)油脂的結(jié)構(gòu)和功能更加多樣化，例如解脂耶氏酵母的油脂，含有高達(dá)55%的油酸（C18∶1），20%左右的棕櫚酸（C16∶0），13%的硬脂酸（C18∶0），7%的棕櫚油酸（C16∶1）以及5%左右的多不飽和脂肪酸（主要為亞麻酸C18∶3），其營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值遠(yuǎn)高于單一的棕櫚油（C16∶0）。可可脂的主要組分為：油酸（C18∶1）和硬脂酸（C18∶0）各占35%，棕櫚酸23%（C16∶0），其他不飽和脂肪酸（棕櫚油酸和亞麻酸）占7%，這一組分與解脂耶氏酵母的油脂組分較為接近。在技術(shù)角度，我們僅需將解脂耶氏酵母中一部分單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)變?yōu)轱柡椭舅?，比如?0%的油酸（C18∶1）轉(zhuǎn)化為硬脂酸（C18∶0），并 將5% 的棕櫚油酸（C16∶1）轉(zhuǎn)變?yōu)樽貦八幔–16∶0），經(jīng)改造后產(chǎn)油酵母的油脂組分將變?yōu)?5%的油酸（C18∶1）、33%的硬脂酸（C18∶0）、25%的棕櫚酸（C16∶0）以及7%左右的其他不飽和脂肪酸（主要為棕櫚油酸和亞油酸），這一脂肪酸組分與可可脂的成分極為接近，從生物技術(shù)而言，僅需控制單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的相對(duì)比例，利用CRISPRi 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平抑制（transcriptional repression），進(jìn)而減弱去飽和酶（desaturase）的活性就可以實(shí)現(xiàn)這一技術(shù)指標(biāo)。除了不飽和度決定熔點(diǎn)以外，可可脂細(xì)膩豐富的質(zhì)地和入口即化的口感也取決于甘油三酯sn1、sn2 和sn3 的三個(gè)酯鍵所連接的脂肪酸類(lèi)型。脂酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶（圖5，GPAT，LPAT 和DAGT）依次將3 個(gè)脂酰輔酶A 裝載到甘油上，因此，如果我們對(duì)脂酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的底物特異性和催化活性進(jìn)行相應(yīng)的工程改造，比如大規(guī)模的酶學(xué)篩選，或者直接從可可果中挖掘相應(yīng)的酶，將會(huì)使得改造后的解脂酵母產(chǎn)出類(lèi)似于可可脂的甘油三酯。這一工程實(shí)踐將能提供大約100 萬(wàn)噸可可脂原材料，進(jìn)而填補(bǔ)大概500 億美元的巧克力市場(chǎng)缺口。

7 結(jié)論

利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)高附加值功能性油脂具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益。植物油脂和動(dòng)物脂肪大體上有4000 億美元的年均市場(chǎng)需求。植物油脂的獲取依賴(lài)于農(nóng)業(yè)技術(shù)、育種、氣候狀況和病蟲(chóng)害等因素，熱帶雨林地域的棕櫚園和可可園提供了大量的植物性油脂，廣泛用于食品、飲料、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域。棕櫚油和可可脂也成為了東南亞、非洲西部和近赤道南美國(guó)家的主要經(jīng)濟(jì)作物。近年來(lái)，由于植物油脂市場(chǎng)需求的激增，造成了熱帶雨林過(guò)度砍伐、植被破壞以及環(huán)境氣候的變遷和生態(tài)多樣性的喪失。為了解決可持續(xù)發(fā)展的問(wèn)題，降低二氧化碳排放，保護(hù)地球環(huán)境，利用微生物細(xì)胞工廠(chǎng)生產(chǎn)功能性油脂為解決油脂的短缺提供了廣闊的前景。

本文從植物油脂的市場(chǎng)需求出發(fā)，分析了目前植物油脂的市場(chǎng)供應(yīng)現(xiàn)狀，探討了構(gòu)建高效產(chǎn)油解脂耶氏酵母細(xì)胞工廠(chǎng)的主要技術(shù)瓶頸，其中包括產(chǎn)油菌株的高通量篩選和表型鑒定技術(shù)、代謝工程遺傳改造策略和產(chǎn)油酵母的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型等，并進(jìn)一步探討了以主要糖料作物為原材料，生產(chǎn)功能性油脂的經(jīng)濟(jì)可行性和技術(shù)可行性。高效的油脂轉(zhuǎn)化率主要取決于解脂耶氏酵母內(nèi)還原性輔酶NADPH 的供應(yīng)、碳代謝流和酶生化反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)分區(qū)、在磷酸激酶（snf1/MAPK）作用下的脂肪酸代謝調(diào)控，利用分子遺傳學(xué)或者合成生物學(xué)手段，將會(huì)幫助我們進(jìn)一步理解產(chǎn)油酵母積累油脂的分子機(jī)制，促進(jìn)我們構(gòu)建高效可行的微生物細(xì)胞油脂工廠(chǎng)，朝向工業(yè)應(yīng)用邁出堅(jiān)實(shí)的一步。經(jīng)過(guò)經(jīng)濟(jì)和技術(shù)可行性分析，利用蔗糖作為原材料，可以預(yù)測(cè)，解脂耶氏酵母具有極大的潛力，能夠解決當(dāng)前高附加值油脂（比如可可脂）的市場(chǎng)缺口問(wèn)題。

健康的功能性油脂主要是含有多不飽和鍵的亞麻酸（α-linolenic acid，C18∶3）和EPA（eicosapentaenoic acid，C20∶5）等，主要有益智、降血脂、抗血栓和抗炎等功效，是人類(lèi)必需的營(yíng)養(yǎng)素之一，其中亞麻酸主要來(lái)源于植物提取，EPA主要源于深海藻類(lèi)或者魚(yú)類(lèi)。其生物合成涉及多步去不飽和酶，在微生物中合成效率較低。研究發(fā)現(xiàn)，一些微藻中多不飽和脂肪酸合成酶為一個(gè)復(fù)雜的聚酮酶復(fù)合物（polyketide synthase，PKS）結(jié)構(gòu)［96］，其合成過(guò)程不同于一般的脂肪酸合成酶。在解脂耶氏酵母中異源表達(dá)微藻類(lèi)的PKS，提高其功能活性，利用產(chǎn)油酵母的產(chǎn)油特性，將有利于我們構(gòu)建高效合成EPA 或者DHA 的酵母。微藻與解脂耶氏酵母共培養(yǎng)或許也能解決脂肪酸前體供應(yīng)的難題，從而提高多不飽和脂肪酸合成的效率。開(kāi)發(fā)產(chǎn)油酵母微生物資源，提供健康的功能性油脂，將會(huì)解決一系列能源、健康食品和環(huán)境資源等問(wèn)題，促進(jìn)我們向可持續(xù)性的低碳經(jīng)濟(jì)模式轉(zhuǎn)變。

致謝：感謝美國(guó)得州理工大學(xué)陳超群教授（美國(guó)工程院院士）校讀對(duì)王教授回憶部分的記述；感謝YaliBio 總裁CEO 陸玉麟博士關(guān)于功能油質(zhì)化合物市場(chǎng)前景及應(yīng)用的討論。