李亞莉,楊正健,*,田 盼,劉 毅,王從鋒,紀(jì)道斌,劉德富

一種浮游植物快速濃縮及固定方法的可靠性分析

李亞莉1,楊正健1,2*,田 盼1,劉 毅1,王從鋒1,紀(jì)道斌1,劉德富2

(1.三峽大學(xué),三峽水庫(kù)生態(tài)系統(tǒng)湖北省野外科學(xué)觀測(cè)研究站,湖北 宜昌 443002；2.湖北工業(yè)大學(xué),河湖生態(tài)修復(fù)與藻類利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430068)

為驗(yàn)證一種浮游植物快速濃縮固定方法——濾膜濃縮法的可靠性,采用“魯戈氏液固定沉降法”和“濾膜濃縮法”同時(shí)鑒定了不同浮游植物濃度梯度水樣,并進(jìn)行了對(duì)比分析,結(jié)果表明:魯戈氏液固定沉降法與濾膜濃縮法整體上均鑒定出7門,32屬,但不同梯度上濾膜濃縮法鑒定出的浮游植物種類較多.兩種方法門水平上除裸藻門(<0.05)外豐度均無明顯差異(>0.05),屬水平上相對(duì)豐度99%以內(nèi)的浮游植物均無明顯差異(>0.05),即無論是門還是屬水平上,濾膜濃縮法對(duì)浮游植物豐度的鑒定是可行的.采用兩種方法得到的不同梯度下藻密度擬合方程斜率差異較小(>0.05)且相關(guān)性顯著(2=0.958,<0.01),但濾膜濃縮法鑒定出的浮游植物細(xì)胞密度更大. 整體來看, 濾膜濃縮法得到的藻類鑒定結(jié)果與魯戈氏液固定沉降法基本一致.

魯戈氏液固定沉降法；濾膜濃縮法；物種種類；物種豐度；線性擬合

浮游植物是指廣泛分布于各種水體的懸浮藻類的總稱,是水體初級(jí)生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者,在水體物質(zhì)與能量循環(huán)中起到重要作用[1].浮游植物的豐富程度及群落組成是反映水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要指標(biāo),所以很多學(xué)者會(huì)根據(jù)水體浮游植物情況來判斷水體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)[2-3].

浮游植物個(gè)體微小,且種類繁多,對(duì)其快速固定與鑒定工作量較大,涉及因素較多,一直是水生態(tài)系統(tǒng)研究的難點(diǎn)[4-5].目前國(guó)際上最通用的方法為Utermhl計(jì)數(shù)法[6-7],該方法對(duì)浮游植物的監(jiān)測(cè)穩(wěn)定且準(zhǔn)確,但是需要倒置顯微鏡和特制沉淀杯[8],所以我國(guó)并不推薦使用.超聲震蕩法會(huì)將微囊藻等群體浮游植物打散成單個(gè)細(xì)胞,還可能會(huì)造成細(xì)胞破裂碎片化,計(jì)數(shù)不穩(wěn)定且影響計(jì)數(shù)結(jié)果[9].定性的浮游植物網(wǎng)在采集的過程中,粒徑小于網(wǎng)絹孔徑的部分浮游植物流失,網(wǎng)絹面積過大,在從網(wǎng)絹上清洗浮游植物時(shí),也會(huì)有大量浮游植物殘留于網(wǎng)絹上,造成損失[10-11].目前我國(guó)湖泊監(jiān)測(cè)等標(biāo)準(zhǔn)推薦使用魯戈氏液固定沉降法[12-13],該方法是利用魯戈試劑將浮游植物全部固定后通過靜置沉淀,得到浮游植物濃縮液,并在顯微鏡下計(jì)數(shù)[14].該方法利用浮游植物自身的重量沉淀到沉淀器底部以達(dá)到濃縮的效果,所以上清液中會(huì)殘留部分自身重量較小的浮游植物,虹吸和多次轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致大量的細(xì)胞損失[15],并且需要控制虹吸速度,所有的操作都存在很大的經(jīng)驗(yàn)性.利用該方法在浮游植物濃縮過程中,至少要沉淀24h,耗時(shí)過長(zhǎng).野外采樣沒有較好的沉淀環(huán)境,運(yùn)輸水樣時(shí)很難保證沉淀濃縮過程不受擾動(dòng),擾動(dòng)沉淀會(huì)導(dǎo)致已經(jīng)沉淀到底部的浮游植物又回到上清液中,需要重新沉淀,拉長(zhǎng)濃縮時(shí)間,對(duì)于野外采樣天數(shù)較長(zhǎng)的,會(huì)導(dǎo)致水樣中的浮游植物分解,無法及時(shí)動(dòng)態(tài)的了解浮游植物的演替情況[16].在比較大型的水體監(jiān)測(cè)中,采集大量水體樣品,需要耗費(fèi)較大的人力和運(yùn)輸成本.

本文提出了一種浮游植物快速固定的方法——濾膜濃縮法,該方法利用濾膜的物理截留作用達(dá)到濃縮效果.該方法使用的濾膜孔徑小,所以浮游植物流失量會(huì)更小,對(duì)環(huán)境條件要求小,且耗費(fèi)的時(shí)間較少,能夠滿足浮游植物野外監(jiān)測(cè)的時(shí)效性要求,對(duì)研究人員的經(jīng)驗(yàn)性要求較小,可以簡(jiǎn)化采樣過程,縮短時(shí)間,降低采樣成本,解決“魯戈氏液固定沉降法”固定并鑒定浮游植物過程中的問題.

1 材料與方法

1.1 浮游植物水樣制備

為了使實(shí)驗(yàn)鑒定更為精確,需采用藻密度較大的水體配置不同濃度的樣品,于是用采水器在含有不同藻種的香溪河取水8L,置于10L的藻類養(yǎng)殖框中,分別加入1mL濃度為1mg/mL的氨氮,總氮,總磷營(yíng)養(yǎng)液,露天放置在有自然氣候影響的場(chǎng)所培養(yǎng)一周,每天多次攪拌,使浮游植物密度增長(zhǎng)且不生長(zhǎng)附著藻并防止藻類絮凝,將此用作母液.配置樣品時(shí),分別取母液0、25、50、100、200、400、800mL于1L棕色定量瓶中,加入蒸餾水,定容至1L,形成7個(gè)體積相同,但濃度不同的浮游植物梯度樣品,梯度為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4?0.8,按照同樣的方法配置兩組,一組用于“魯戈氏液固定沉降法”,一組用于“濾膜濃縮法”.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與過程

1.2.1 魯戈氏液固定沉降法 按圖1所示流程,取一組配置好梯度的樣品(體積為1L),在每個(gè)樣品中加入配置好的魯戈試劑固定在干凈的樣品瓶中,用量為水樣體積的1%～1.5%,避光靜置沉淀8h后,用虹吸法吸去上清液,余下300mL沉淀物,將沉淀轉(zhuǎn)移到300mL棕色沉淀瓶中,再避光靜置沉淀8h,利用虹吸法吸去上清液,轉(zhuǎn)為150mL,再避光自然沉淀8h,利用虹吸法吸去上清液,余下40～45mL沉積物,將沉淀轉(zhuǎn)移至50mL棕色定量瓶,用少許上清液沖洗沉淀器幾次, 沖洗液加到定量瓶中,最后定容至50mL,用于浮游植物分類鑒定和計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì),每次轉(zhuǎn)移用上清夜清洗3次沉淀器,且沉淀過程不可擾動(dòng),虹吸過程也不可擾動(dòng)下層沉淀物,若有擾動(dòng),需重新靜置沉淀.虹吸過程中流速不宜過大,且虹吸管應(yīng)低于水面,避免漂浮于水面的微小生物進(jìn)入虹吸管.

圖1 魯戈氏液固定沉降法流程

1.2.2 濾膜濃縮法 按圖2所示流程,取另一組已配置好梯度的樣品(體積為1L),利用抽濾裝置,把每個(gè)樣品分別用孔徑為0.45mm的醋酸纖維膜抽濾(抽濾時(shí)避免抽干),得到濾紙,將要鑒定的浮游植物通過物理截留作用富集在濾膜上,直接取濾膜,用洗瓶裝蒸餾水將濾膜上的浮游植物沖洗入50mL定量瓶中,并用玻璃棒搗下濾膜上的浮游植物,再將濾膜放入瓶中,加蒸餾水,用玻璃棒充分?jǐn)嚢?使濾膜上的浮游植物全部到水中,取出濾膜,用蒸餾水沖洗濾膜上殘留的浮游植物到定量瓶中,得到含有和采樣水體一致浮游植物種類和數(shù)量的混合水樣,定容到50mL,將樣品混合均勻,這樣得到的待檢測(cè)的樣品任取一定量,濃度和含量都一致,本實(shí)驗(yàn)將每個(gè)樣品得到的濾紙上的浮游植物分別清洗進(jìn)50mL棕色瓶中,加入蒸餾水定容至50mL,并用玻璃棒充分?jǐn)嚢柚聊ど系母∮沃参锶窟M(jìn)入水體,再加入魯戈試劑染色并搖勻,用量為濃縮水樣體積的1%～1.5%(若要鑒定活體浮游植物可不加入魯戈試劑并及時(shí)鑒定).

圖2 濾膜濃縮法流程

1.2.3 計(jì)數(shù)與鑒定 浮游植物分類鑒定及計(jì)數(shù)之前,將濃縮樣品震蕩均勻,利用新S300藻類智能鑒定計(jì)數(shù)儀進(jìn)行鑒定,在棕色試劑瓶中取0.1mL混合均勻的待測(cè)樣品,置于光學(xué)顯微鏡載玻片生物計(jì)數(shù)框的計(jì)數(shù)區(qū)上,然后輕輕蓋上蓋玻片,注意不能在蓋玻片下產(chǎn)生氣泡,調(diào)整光學(xué)顯微鏡的物鏡?目鏡?反光鏡等,使視野清晰,選用視野計(jì)數(shù)法,在光學(xué)顯微鏡下選取100個(gè)視野拍照記錄,并鑒定得到最終的種類和數(shù)量,計(jì)數(shù)兩片取平均值,若兩片的數(shù)值與其平均值之差大于±15%,需進(jìn)行第3片計(jì)數(shù)[19].

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每升水體中浮游植物數(shù)量按下式計(jì)算[17]:

2 結(jié)果與分析

2.1 浮游植物種類鑒定結(jié)果比較分析

將利用魯戈氏液固定沉降法及濾膜濃縮法鑒定出的所有梯度上浮游植物種類總結(jié)如表1,魯戈氏液固定沉降法與濾膜濃縮法均鑒定出7門,32屬,甲藻門均鑒定出4屬,隱藻門和裸藻門各1屬,金藻門2屬,其中也各有兩屬不同,通過濾膜濃縮法鑒定出的硅藻門中的脆桿藻屬及綠藻門的微芒藻屬在魯戈氏液固定沉降法中未鑒定出,魯戈氏液固定沉降法所鑒定出來的綠藻門的衣藻屬和藍(lán)藻門的節(jié)旋藻屬在濾膜濃縮法中未鑒定出.

表1 浮游植物種類

續(xù)表1

注:+表示含有該屬浮游植物;-表示不含有該屬浮游植物.

根據(jù)不同梯度下利用兩種方法鑒定出的藻種的種類,得到不同梯度下兩種方法種類數(shù)的對(duì)比圖,如圖3所示,魯戈沉降法鑒定出浮游植物種類平均值為19種,其種類變化范圍為4～29種,即該方法至少鑒定出4種,而利用濾膜濃縮法鑒定出浮游植物平均值為21種,變化范圍為8～29種,利用該方法至少鑒定出8種,利用濾膜濃縮法比魯戈氏液固定沉降法鑒定出的種類數(shù)更多,但兩種方法不同梯度上所鑒定出的浮游植物種類數(shù)無明顯差異(=0.528> 0.05).結(jié)合整體上的門水平及屬水平鑒定的浮游植物種類及不同梯度上的鑒定結(jié)果來看,濾膜濃縮法能夠鑒定出的浮游植物種類更多.

圖3 不同梯度下種類數(shù)對(duì)比分析

2.2 浮游植物豐度結(jié)果比較分析

2.2.1 門水平物種豐度 在所培養(yǎng)的浮游植物水樣中,利用魯戈氏液固定沉降法和濾膜濃縮法均鑒定出7門(圖4),主要包括金藻門(4.7×105、5.3×105(個(gè)/L))、裸藻門(2.9×104、7.4×105(個(gè)/L))、藍(lán)藻門(7.0×107、7.2×107(個(gè)/L))、隱藻門(2.4×106、3×105(個(gè)/L))、綠藻門(7.6×108、2.0×109(個(gè)/L))、硅藻門(3.6×109、4.0×109(個(gè)/L))、甲藻門(2.2×106、9.3×105(個(gè)/L)),兩種方法所得結(jié)果中均為硅藻門豐度最大,按照梯度來看,魯戈氏液固定沉降法(圖4a)所鑒定得到的硅藻門豐度分別為5.8×104、3.6×107、6.7×107、1.9×108、3.4×108、8.0×108、2.1×109(個(gè)/L),其次是綠藻門,豐度分別為5.2×105、1.2×107、2.5×107、5.6×107、8.3×107、2.6×108、3.3×108(個(gè)/L),此外隱藻門和裸藻門只檢測(cè)出一屬.按照梯度來看,濾膜濃縮法(圖4b)所鑒定得到的硅藻門豐度分別為1.1×106、9.3×107、1.3×108、2.7×108、7.0×108、1.1×109、1.7×109(個(gè)/L),綠藻門次之,為4.6×106、6.5×107、7.7×107、1.5×108、3.7×108、5.6×108、8.0×108(個(gè)/L).

用魯戈氏液固定沉降法與濾膜濃縮法鑒定浮游植物門水平種群豐度的標(biāo)準(zhǔn)誤差具有一定的差異(圖5),總體而言,采用濾膜濃縮法的標(biāo)準(zhǔn)誤差及其波動(dòng)程度比魯戈氏液固定沉降法小,其中魯戈氏液固定沉降法對(duì)于硅藻門的鑒定的標(biāo)準(zhǔn)誤差隨著藻濃度變大有增大趨勢(shì),對(duì)于綠藻門的鑒定標(biāo)準(zhǔn)誤差波動(dòng)較小.濾膜濃縮法在梯度為0.4時(shí),標(biāo)準(zhǔn)誤差最大,硅藻門和綠藻門的豐度除開梯度為0.4時(shí),標(biāo)準(zhǔn)誤差均較小,對(duì)于藍(lán)藻門鑒定的標(biāo)準(zhǔn)誤差較小,其余豐度較小不作具體分析.對(duì)兩種方法鑒定出的浮游植物門水平上的豐度進(jìn)行差異性分析,如表2所示,可知,除開裸藻門差異性顯著(=0.018<0.05),其他門均無顯著性差異.其中甲藻門顯著性為=0.451>0.05,硅藻門顯著性為=0.856> 0.05,綠藻門顯著性為=0.167>0.05,藍(lán)藻門顯著性為=0.961>0.05,隱藻門顯著性為=0.112>0.05,金藻門顯著性為= 0.823>0.05.

2.2.2 屬水平物種豐度 屬水平的物種豐度鑒定結(jié)果如圖6所示,從圖6可以看出,魯戈氏液固定沉降法共鑒定出32屬,包括甲藻門4屬,硅藻門6屬,綠藻門11屬,藍(lán)藻門7屬,金藻門2屬,隱藻們和裸藻門各1屬.濾膜濃縮法鑒定結(jié)果除硅藻門7屬,藍(lán)藻門6屬外,其余與魯戈氏液固定沉降法一致.其中魯戈氏液固定沉降法與濾膜濃縮法結(jié)果顯示硅藻門的橋彎藻屬豐度最大,分別為2.9×104、3.4×107、6.4×107、1.9×108、3.3×108、7.7×108、2.1×109(個(gè)/L).綠藻門的小球藻次之,為9.4×105、9.1×107、1.3×108、2.6×108、6.7×108、1.1×109、1.7×109(個(gè)/L).

表2 門水平上豐度差異性分析結(jié)果

對(duì)兩種方法所得屬水平99%相對(duì)豐度的藻屬的豐度進(jìn)行差異性分析,如表3所示,橋彎藻及小球藻豐度的顯著性=0.856>0.05和=0.16>0.05,均無明顯差異,小環(huán)藻豐度差異性分析結(jié)果顯著性=0.875>0.05,微囊藻顯著性=0.836>0.05,色球藻顯著性=0.875>0.05,空星藻顯著性=0.54>0.05,均無明顯差異.

表3 屬水平上豐度差異性分析

用魯戈氏液固定沉降法與濾膜濃縮法鑒定浮游植物屬水平種群豐度的標(biāo)準(zhǔn)誤差具有一定的差異(圖7),總體而言,采用濾膜濃縮法標(biāo)準(zhǔn)誤差及其波動(dòng)程度比魯戈氏液固定沉降法小,其中魯戈氏液固定沉降法對(duì)于橋彎藻和小球藻鑒定的標(biāo)準(zhǔn)誤差隨著藻濃度變大有增大趨勢(shì),對(duì)小環(huán)藻?微囊藻?色球藻和空星藻的鑒定標(biāo)準(zhǔn)誤差波動(dòng)較小.濾膜濃縮法在梯度為0.4時(shí),硅藻門和綠藻門標(biāo)準(zhǔn)誤差最大,除此之外,其標(biāo)準(zhǔn)誤差均較小,對(duì)于其他屬的鑒定標(biāo)準(zhǔn)誤差及波動(dòng)程度均較小,其余豐度較小不作具體分析.所以浮游植物種類鑒別屬水平,濾膜濃縮法的鑒定結(jié)果與魯戈氏液固定沉降法無明顯差異,即在屬水平上看,濾膜濃縮法對(duì)浮游植物物種豐富度的鑒定上是可行的.

2.3 浮游植物稀釋梯度相關(guān)性比較分析

從兩種方法的屬水平上的99%相對(duì)豐度的浮游植物擬合結(jié)果來看(圖8),對(duì)于小粒徑的小球藻屬(圖8b),濾膜濃縮法較魯戈沉降法穩(wěn)定性高2抽濾= 0.939>2沉淀=0.930,藻密度大.對(duì)于群體型和大型浮游植物微囊藻(圖8d)及空星藻(圖8f),濾膜濃縮法鑒定出的藻密度較魯戈沉降法大.對(duì)于粒徑較大的橋彎藻(圖8a)?小環(huán)藻(圖8c)及色球藻(圖8e)來說,兩種方法鑒定出藻密度擬合方程斜率相差較小,即變化趨勢(shì)基本一致,穩(wěn)定性相差不大,但濃度較低時(shí),利用濾膜濃縮法鑒定得到的藻密度更大,濃度較高時(shí),利用魯戈沉降法較好.對(duì)兩種方法鑒定所得的浮游植物藻密度進(jìn)行差異性分析顯示,均無明顯差異(>0.05),且顯著正相關(guān)(表4).實(shí)際的浮游植物采集過程中,各類浮游植物混合在一起,無法進(jìn)行分開采集,所以需從整體來分析比較兩種方法.

根據(jù)兩種方法不同梯度水樣中總的藻密度,繪制出魯戈氏液固定沉降法和濾膜濃縮法的梯度擬合線,擬合結(jié)果如圖9所示.由圖9可知,兩種方法得到的擬合方程式的斜率相差不大,魯戈氏液固定沉降法梯度擬合結(jié)果2沉淀=0.992,濾膜濃縮法梯度擬合結(jié)果2抽濾=0.959<2沉淀,因此利用魯戈氏液固定沉降法進(jìn)行浮游植物固定及鑒定,在浮游植物的個(gè)體及細(xì)胞數(shù)量方面比濾膜濃縮法更穩(wěn)定,作出魯戈氏液固定沉降法和濾膜濃縮法的藻密度差異性分析,分析結(jié)果如表4所示,差異的顯著性=0.622> 0.05,即魯戈氏液固定沉降法與濾膜濃縮法藻密度鑒定結(jié)果無顯著性差異,并作出魯戈氏液固定沉降法與濾膜濃縮法的相關(guān)性分析,結(jié)果見表4,2= 0.958(<0.01),兩種方法得到的藻密度呈顯著正相關(guān)關(guān)系,說明濾膜濃縮法在浮游植物固定及鑒定的個(gè)體和細(xì)胞數(shù)量方面也是可行的.且濾膜濃縮法所作擬合線位于魯戈氏液固定沉降法上方,說明濾膜濃縮法鑒定出來的藻細(xì)胞較多,即濾膜濃縮法的細(xì)胞損失量較少,再結(jié)合差異性及相關(guān)性分析結(jié)果,得到使用濾膜濃縮法檢測(cè)水體中的浮游植物生物量更為準(zhǔn)確.

表4 兩種方法藻密度差異性及相關(guān)性

注:**.在0.01級(jí)別(雙尾),相關(guān)性顯著;*.在0.05級(jí)別(雙尾),相關(guān)性顯著.

圖9 總體藻密度線性擬合結(jié)果

3 討論

3.1 濾膜濃縮法誤差分析

本實(shí)驗(yàn)控制變量為濃度梯度,為了得到濃度有線性梯度變化的水樣,需將水體中的藻培養(yǎng)至較大濃度,進(jìn)行稀釋,最后取水體積定為1L,但在實(shí)際的采樣過程中,會(huì)面臨不同富營(yíng)養(yǎng)化程度的水域,其藻類含量也不一樣,可根據(jù)其富營(yíng)養(yǎng)化程度選擇合適的采樣體積[17].利用濾膜濃縮法采水濃縮時(shí),采集水樣后立即進(jìn)行抽濾,并洗脫濾膜上的浮游植物,得到濃縮液,加入魯戈氏液固定,帶回鏡檢.Zarauz 等[18]比較分析了直接鑒定活體樣品與加固定劑后再鑒定的樣品在生物量上的差別,表明在溫度很低的條件下,僅能保證浮游植物在幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)不出現(xiàn)明顯的細(xì)胞分解和衰亡.還可能會(huì)產(chǎn)生新浮游植物個(gè)體,這種動(dòng)態(tài)變化將不可避免的使浮游植物的群落組成發(fā)生改變,導(dǎo)致樣品無法反映環(huán)境的真實(shí)情況,因此采集水樣后加入固定劑是比較重要的程序.固定劑不僅會(huì)殺死浮游植物并染色,而且在樣品濃縮沉淀過程時(shí),增大浮游植物重量,幫助排出可能保留在特定生物的液泡中的氣體,更利于細(xì)胞沉淀[17].所以即使使用濾膜濃縮法,也要盡可能的縮短采水到加入固定劑的時(shí)間,否則會(huì)造成較大的實(shí)驗(yàn)誤差.若不能及時(shí)進(jìn)行鏡檢,還需加入甲醛保存[19].目前藻類鑒定儀器尚不完全成熟,顯微鏡計(jì)數(shù)法仍是浮游植物計(jì)數(shù)的主流方法,能直觀?準(zhǔn)確的得到浮游植物的藻密度及種類[20],對(duì)于濾膜濃縮法鏡檢,可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇合適的儀器設(shè)備,本次實(shí)驗(yàn)選擇新S300藻類智能鑒定計(jì)數(shù)儀進(jìn)行鑒定[21],雖有誤差,但考慮浮游植物的監(jiān)測(cè)過程會(huì)經(jīng)歷多次重新抽樣,且兩種方法均采用此儀器,進(jìn)行對(duì)比時(shí)可消除儀器帶來的差異.

水體中的藻類直徑基本大于2μm[22],所以使用0.45μm的濾膜過濾定能將大部分浮游植物截留在濾膜上,在定容后,將已經(jīng)清洗的濾膜再用蒸餾水進(jìn)行清洗攪拌,只檢測(cè)出極個(gè)別細(xì)胞,說明之前的清洗比較徹底.但是濾膜更換過多,藻細(xì)胞會(huì)隨濾膜流失更多.聚集在濾膜上的浮游植物清洗下來后,為防止凝在一起,加入魯戈后必須搖勻使其分散并充分固定,鑒定之前需重新?lián)u勻.Paxinos等[23]曾改進(jìn) Utermhl[6]的靜置沉降濃縮為壓濾濃縮,結(jié)果與Utermhl 沉降濃縮結(jié)果具有很好的相關(guān)性(2= 0.98),但水樣中沒有加入魯戈試劑進(jìn)行固定,濃縮過程需2h,所以浮游植物結(jié)構(gòu)會(huì)受到影響,產(chǎn)生誤差.而濾膜濃縮法從樣品處理到加入魯戈試劑固定的過程只經(jīng)歷10min左右,浮游植物群落結(jié)構(gòu)變化不大,且與魯戈氏液固定沉降法有很好的相關(guān)性(2= 0.958).

3.2 濾膜濃縮法與魯戈氏液固定沉降法差異分析

魯戈氏液固定沉降法沉淀時(shí)間與浮游植物形態(tài)?大小和生理狀態(tài)有關(guān),也與沉淀器的深度及介質(zhì)的溫度有關(guān),沉淀時(shí)間越長(zhǎng),殘留在上清液中的浮游植物數(shù)量越少,一般不少于24h[24].虹吸流速過大會(huì)造成水分子與藻體之間的黏連性變大,造成擾動(dòng)或直接將底部浮游植物吸走,所以虹吸流速不能超過150mL/min,吸至澄清液1/3時(shí)降低流速到10～ 20mL/min[25].所以方法歷時(shí)長(zhǎng),且對(duì)沉淀環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員的實(shí)驗(yàn)操作要求嚴(yán)格[26].在野外采樣時(shí),不僅要攜帶大量水體樣品,而且難以進(jìn)行沉淀,又進(jìn)一步拉長(zhǎng)了時(shí)間,最終對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度和結(jié)果造成影響.而濾膜濃縮法時(shí)間取決于抽濾的樣品數(shù),一個(gè)樣品只需十幾分鐘,極大的縮短了濃縮時(shí)間,滿足水質(zhì)監(jiān)測(cè)對(duì)數(shù)據(jù)時(shí)效性的要求.抽濾過程對(duì)環(huán)境要求小,避免了實(shí)驗(yàn)人員專業(yè)水平等因素影響.

魯戈氏液固定沉降法作為國(guó)內(nèi)通用方法,可作為判斷濾膜濃縮法是否可行的標(biāo)準(zhǔn).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出兩種方法裸藻門豐度存在顯著差異,且有兩屬種類不一致,但其密度較小,考慮整個(gè)實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷 3 次重新抽樣:從母液中隨機(jī)取浮游植物水樣進(jìn)行稀釋;從樣品中取0.1mL 計(jì)數(shù);從計(jì)數(shù)框選擇觀察的視野面積,造成實(shí)驗(yàn)誤差,說明濾膜濃縮法在浮游植物種類鑒定方面是可行的[14].鑒定結(jié)果中空白樣中含有藻分析可能是計(jì)數(shù)框殘留或采樣瓶殘留的浮游植物個(gè)體.

對(duì)比擬合效果,整體上兩種方法斜率相差較小,且濾膜濃縮法得到的藻密度大于魯戈氏液固定沉降法,分析可能是魯戈氏液固定沉降法樣品經(jīng)過多次轉(zhuǎn)移,上清液中及沉淀器壁流失的浮游植物較多造成[9].但從99%相對(duì)豐度上的屬水平的物種擬合效果來看,不同藻屬利用兩種方法達(dá)到的效果不一致,分析可能是不同屬藻類的大小?形態(tài)及生理狀態(tài)不一致導(dǎo)致.小球藻等粒徑較小的浮游植物在沉淀時(shí)容易附著于沉淀器底部或壁,也會(huì)因重力太小,而造成沉淀不充分,虹吸時(shí)被抽走造成損失.微囊藻等大型藻類在水樣中的分布不均勻[27],用兩種方法鑒定結(jié)果會(huì)因此產(chǎn)生誤差,濾膜法在清洗濾膜過程中,微囊藻等群體浮游植物更容易清洗,損失量會(huì)較少.所以濾膜濃縮法對(duì)較小粒徑和群體浮游植物的固定濃縮更優(yōu).對(duì)于較大的橋彎藻?色球藻及小環(huán)藻,兩種方法鑒定結(jié)果的藻密度差異不顯著,其中濃度較低時(shí)濾膜濃縮法鑒定出藻密度較大,但在浮游植物濃度高時(shí),生物自身的截留作用強(qiáng),甚至?xí)枞麨V孔,需更換多張濾膜,更換數(shù)量越多,滯留的浮游植物越多.沖洗時(shí),藻和雜質(zhì)越多,越難以清洗干凈,導(dǎo)致更多的浮游植物損失,計(jì)數(shù)時(shí),雜質(zhì)與藻會(huì)產(chǎn)生重疊,出現(xiàn)計(jì)數(shù)誤差,所以濾膜濃縮法鑒定粒徑較大的浮游植物損失量可能會(huì)大于魯戈試液固定沉降法的損失量.

表5 兩種方法可靠性對(duì)比

由以上對(duì)比分析總結(jié)如表5所示,濾膜濃縮法細(xì)胞損失較小,受環(huán)境干擾程度小,設(shè)備簡(jiǎn)單,成本低廉,效率高,實(shí)驗(yàn)時(shí)間短,且消耗的人力及運(yùn)輸成本較小,實(shí)驗(yàn)過程具有可操作性,其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有準(zhǔn)確性.但當(dāng)環(huán)境條件較好時(shí),魯戈氏液固定沉降法更加穩(wěn)定,但兩種方法在藻體數(shù)量多時(shí),小型藻容易被不透明雜質(zhì)遮擋,或附著于腐殖質(zhì)上,造成鏡檢誤差.所以沒有一種采樣濃縮方法能滿足所有浮游植物的研究需要.我們可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境和要求選取不同的方法進(jìn)行樣品處理,對(duì)于野外不同程度富營(yíng)養(yǎng)化水體的監(jiān)測(cè),也需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)后得到方法的適用性.

4 結(jié)論

4.1 魯戈氏液固定沉降法與濾膜濃縮法均鑒定出7門,32屬,濾膜濃縮法鑒定出的浮游植物種類較多,兩種方法不同梯度上所鑒定出的浮游植物種類數(shù)無明顯差異(>0.05),浮游植物種類鑒定方面,利用濾膜濃縮法比魯戈氏液固定沉降法更優(yōu).

4.2 總體上,濾膜濃縮法標(biāo)準(zhǔn)誤差及波動(dòng)程度比魯戈氏液固定沉降法小,兩種方法門水平上的豐度進(jìn)行差異性分析結(jié)果除裸藻門(=0.018<0.05)外均無明顯差異,在門水平上看,濾膜濃縮法對(duì)浮游植物物種豐富度的鑒定上是可行的.屬水平上相對(duì)豐度99%以內(nèi)的藻屬進(jìn)行差異性分析,顯著性>0.05,均無明顯差異,在屬水平上看,濾膜濃縮法對(duì)浮游植物物種豐富度的鑒定上是可行的.

4.3 同一梯度下,總體上兩種方法擬合方程斜率均相差不大,但總體上魯戈氏液固定沉降法(沉淀2= 0.992)的擬合效果更好(2抽濾=0.959<2沉淀),卻又無明顯差異,并顯著相關(guān)(2=0.958**,<0.01).且濾膜濃縮法鑒定出的浮游植物細(xì)胞密度更大,所以濾膜濃縮法更優(yōu).但對(duì)于屬水平上的主要藻種,對(duì)相對(duì)豐度99%以內(nèi)的屬水平的浮游植物的擬合結(jié)果分析得到,兩種方法所造成的損失量與浮游植物的粒徑及濃度有關(guān),不同種類的浮游植物在不同的濃度下適合采用不同的濃縮方法.

4.4 濾膜濃縮法受環(huán)境干擾程度小,設(shè)備簡(jiǎn)單,成本低廉,效率高,滿足野外監(jiān)測(cè)對(duì)時(shí)效性的要求,且消耗的人力及運(yùn)輸成本較小,實(shí)驗(yàn)過程具有可操作性.

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Reliability analysis of a method to rapidly concentrate and fix phytoplankton.

LI Ya-li1, YANG Zheng-jian1,2*, TIAN Pan1, LIU Yi1, WANG Cong-feng1, JI Dao-bin1, LIU De-fu2

(1.Hubei Field Observation and Scientific Research Stations for Water Ecosystem in Three Gorges Reservoir, China Three Gorges University, Yichang 443002, China；2.Hubei Key Laboratory of Ecological Restoration of River-lakesand Algal Utilization, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)., 2021,41(9)：4300～4309

In order to verify the reliability of a membrane concentration method to rapidly concentrate and fixe phytoplankton in the field, the "Lugol's solution fixed sedimentation method (LSM)" and "membrane concentration method (MCM)" were comparatively used here to authenticate different phytoplankton samples. The results show that: (1) 7 phyla and 32 genera were both identified by the two method, but using the MCM could authenticate more phytoplankton species than the LSM method; (2) There was no significant difference not only in phytoplankton abundance between the two methods except(<0.05) at the phylum level (>0.05), but also in phytoplankton relative abundance within 99% at the genus level (>0.05). Which meant that, at the phylum and genus levels, the MCM was feasible to identify the phytoplankton abundance; (3) There was no significant difference in the slope of fitting equation of different algae biomass gradients (>0.05), and they showed a high correlation coefficient (2=0.958,<0.01), however, algal biomass of the MCM seemed to be a little larger. On a conclusion, the results of the MCM was consistent with the LSM, and the MCM had more advantages in less environmental condition requirement, easier for field monitoring, and save time.

Lugol's solution fixed sedimentation method；membrane concentration method；phytoplankton species；species abundance；linear fitting

X52,X171.5

A

1000-6923(2021)09-4300-10

李亞莉(1997-),女,湖北恩施人,碩士研究生,主要研究方向?yàn)樯鷳B(tài)水利.發(fā)表論文2篇.

2021-01-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51879099、51779128和51909135)

* 責(zé)任作者, 教授, yangzj1984@ctgu.edu.cn