劉潔云，吳艷艷，牟海飛，溫 放，田青蘭，韋毅剛，張英俊，符龍飛，彭嘉宇，黃偉華*

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006；3.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】百香果學(xué)名西番蓮(Passifloraedulis)，為西番蓮科西番蓮屬多年生常綠藤本植物[1]，在我國種植已有20多年歷史，主要分布于廣西、廣東、云南、貴州、福建和臺灣等省(區(qū))。由于百香果可當(dāng)年種植當(dāng)年采收，生長周期短，產(chǎn)量高，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)效益好，種植百香果已成為廣西、海南和貴州等地貧困村脫貧致富的好項(xiàng)目。百香果分為紫果種、黃果種和雜交種三大類[2]，其中黃果種百香果主要包括小果型黃果(小黃金)、大果型黃果(大黃金)和原生黃果。大果型黃百香果單果重200～500 g，果形較大且產(chǎn)量、果實(shí)出汁率均較高，適于加工和鮮食。但是，大果型黃百香果自然授粉結(jié)實(shí)率低，需進(jìn)行人工授粉提高座果率，而授粉后花粉管能否萌發(fā)對能否完成受精起著決定性作用[3]。因此，分析不同配方培養(yǎng)基及貯藏條件對大果型黃百香果花粉離體萌發(fā)效果的影響，對大果型黃百香果的花粉活力鑒定、人工輔助授粉及雜交育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花粉活力是影響大果型黃百香果授粉受精的關(guān)鍵因素之一，不同貯藏條件直接影響人工授粉的成功率[4]。已有研究表明，多數(shù)植物的花粉在低溫低濕條件下能貯藏較長時間且保持活力[5-7]?；ǚ刍盍z測方法不同其檢測結(jié)果存在一定差異。張藝萍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，離體萌發(fā)法的測定結(jié)果較染色法更能反映不同百合品種的花粉活力。任少華等[9]研究認(rèn)為，TTC染色法測定的香榧花粉萌發(fā)情況與離體培養(yǎng)法基本一致。Oliveira等[10]以染色法分析有機(jī)栽培條件下黃果西番蓮的花粉活力，發(fā)現(xiàn)其具有活力的花粉比率達(dá)99.8%。Soares等[11]利用花粉離體培養(yǎng)和組織化學(xué)分析兩種方法分析5份百香果屬植物的花粉活力，結(jié)果顯示組織化學(xué)分析法檢測的花粉活力高于離體培養(yǎng)法。吳斌等[12]研究表明，適宜小黃金百香果花粉培養(yǎng)的蔗糖濃度為20%，硼酸濃度為0.06%，固體和液體培養(yǎng)基對其花粉萌發(fā)率影響較小。蔡昭艷等[13]以臺農(nóng)一號百香果花粉為材料開展離體萌發(fā)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度、硼酸濃度、聚二乙醇(PEG-4000)、pH和培養(yǎng)時間對其花粉萌發(fā)均具有顯著影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)百香果花粉活力測定的研究較少，針對不同配方培養(yǎng)基及貯藏條件對大果型黃百香果花粉離體培養(yǎng)效果影響的研究未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以大果型黃百香果花粉為試驗(yàn)材料，采用L25(54)正交試驗(yàn)設(shè)計，探究適宜大果型黃百香果花粉離體培養(yǎng)的蔗糖、硼酸和硝酸鈣濃度及pH，分析花朵采樣時間、貯藏濕度和溫度對花粉活力的影響，篩選適宜大果型黃百香果花粉離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方并開展花粉離體貯藏試驗(yàn)，為百香果花粉活力鑒定、人工輔助授粉及雜交育種等提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為本課題組選育的大果型黃百香果優(yōu)異品系‘黃優(yōu)6號’(暫定名)，種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院院本部基地(東經(jīng)108°14′57.70″，北緯22°51′02.75")。于2020年10月選天氣晴朗時將整朵花摘下迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，用藥勺將花粉輕輕刮至硫磺紙上備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉離體培養(yǎng)基篩選 取花瓣剛好完全展開大果型黃百香果花朵的花粉，采用液體培養(yǎng)法，通過L25(54)正交試驗(yàn)設(shè)計(4因素5水平)共25個處理組合(表1)篩選適宜的花粉離體培養(yǎng)基配方。每處理組合設(shè)3個重復(fù)。用膠頭滴管將配制好的培養(yǎng)基滴于雙凹載玻片，用藥勺蘸取少量花粉置于培養(yǎng)基中，輕微攪拌使其散布均勻，蓋上蓋玻片后放入培養(yǎng)皿中，于26 ℃下暗培養(yǎng)3 h后在顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況。每處理隨機(jī)選取3個不重復(fù)的視野，每個視野花粉不少于30粒，以花粉管長度大于花粉粒直徑判定為萌發(fā)的花粉，統(tǒng)計花粉總數(shù)和萌發(fā)花粉數(shù)，計算花粉萌發(fā)率，篩選最佳培養(yǎng)基配方?；ǚ勖劝l(fā)率(%)=花粉萌發(fā)數(shù)/花粉總數(shù)×100。

表1 百香果花粉離體培養(yǎng)基篩選的L25(54)正交試驗(yàn)設(shè)計

1.2.2 不同采集時間花朵的花粉萌發(fā)情況 經(jīng)觀察，在一天中大果型黃百香果植株的開花時間集中在12:30—14:30。本研究分別在8:30、9:30、10:30、11:30、12:30、13:30、14:30、15:30、16:30、17:30和18:30采集花粉。其中，在8:30—12:30采集未開放花朵的花粉，在13:30采集花瓣剛好完全展開花朵(以13:30為花朵開放時間)的花粉，14:30—18:30采集在13:30開花后進(jìn)行套袋處理花朵的花粉，使用1.2.1中篩選的最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)操作、培養(yǎng)條件及統(tǒng)計方法同1.2.1。

1.2.3 不同貯藏條件下花粉的萌發(fā)情況 取花瓣剛好完全展開大果型黃百香果花朵的花粉，分別在不同濕度和溫度條件下貯藏0、1、2、3、4、5、6、7、24和48 h，開展花粉活力試驗(yàn)。貯藏濕度設(shè)密封于離心管中常溫貯藏、平鋪在硫磺紙上自然風(fēng)干和平鋪在硫磺紙上置于干燥器中貯藏3個處理，分別編號A1、A2和A3；貯藏溫度設(shè)密封于離心管中4 ℃貯藏、自然風(fēng)干5 h后密封于離心管中4 ℃貯藏、密封于離心管中-20 ℃貯藏和自然風(fēng)干5 h后密封于離心管中-20 ℃貯藏4個處理，分別編號B1、B2、B3和B4。使用1.2.1中篩選的最佳培養(yǎng)基配方進(jìn)行培養(yǎng)，試驗(yàn)操作、培養(yǎng)條件及統(tǒng)計方法同1.2.1。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，以SPSS 19.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對大果型黃百香果花粉離體萌發(fā)的影響

由表2可知，不同培養(yǎng)基處理組合對大果型黃百香果花粉離體萌發(fā)率具有較大影響。其中，各因素的極值(R)排序?yàn)镃(45.06)>A(34.62)>B(17.49)>D(16.53)，說明4個因素對花粉萌發(fā)率影響的排序?yàn)橄跛徕}>蔗糖>硼酸>pH；根據(jù)不同因素的均值(K)可知，最佳培養(yǎng)基處理組合為A3B2C3D1，但該處理組合未出現(xiàn)在正交設(shè)計表中；表2中處理組合A3B2C4D1的平均花粉萌發(fā)率最高，為81.30%。由表3的方差分析結(jié)果可知，C因素對大果型黃百香果花粉萌發(fā)率的影響達(dá)極顯著水平(P<0.01)，A因素的影響達(dá)顯著水平(P<0.05，下同)，B因素和D因素對花粉萌發(fā)率的影響未達(dá)顯著水平(P>0.05，下同)。以處理組合A3B2C3D1進(jìn)行大果型黃百香果花粉離體培養(yǎng)，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)其萌發(fā)率達(dá)85.55%?？梢姡?00.00 g/L蔗糖+0.02 g/L硼酸+0.40 g/L硝酸鈣，pH 5.0，為大果型黃百香果花粉離體萌發(fā)的最適培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對大果型黃百香果花粉離體萌發(fā)的影響

表3 大果型黃百香果花粉離體萌發(fā)率的方差分析結(jié)果

2.2 大果型黃百香果花朵不同采樣時間對其離體花粉活力的影響

從圖2可看出，一天內(nèi)大果型黃百香果不同采樣時間花朵的花粉萌發(fā)率呈先升高后降低的變化趨勢。其中，開花時(13:30)采集花朵的花粉萌發(fā)率高于開花前采集花朵的花粉萌發(fā)率；在開花前采集花朵時間越早，其萌發(fā)率越低，尤其8:30采集花朵的花粉萌發(fā)率僅67.78%，顯著低于其他采樣時間，即此時采集的花粉活力最弱；開花后采集花朵的花粉萌發(fā)率總體上呈先升高后降低的變化趨勢，以16:30采集的花粉萌發(fā)率最高，為89.79%，但與13:30和15:30采集的花粉萌發(fā)率差異不顯著；在18:30采集花朵的花粉萌發(fā)率仍較高，為78.56%，即此時采集花粉的活力仍較強(qiáng)；11:30—17:30采集花朵的花粉萌發(fā)率均在80.00%以上?？梢?，在11:30—17:30采集的大果型黃百香果花朵其花粉活力均較強(qiáng)，其中開花后3 h(16:30)的花粉活力最強(qiáng)。

2.3 不同貯藏濕度對大果型黃百香果離體花粉活力的影響

從圖3可看出，A1和A2處理大果型黃百香果花粉的萌發(fā)率隨著離體貯藏時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢，A3處理的花粉萌發(fā)率隨著離體貯藏時間的延長呈降低趨勢。其中，A1處理離體貯藏1 h花粉的萌發(fā)率最高，為87.36%，之后隨著離體貯藏時間的延長，花粉萌發(fā)率持續(xù)降低，至處理24 h時為38.95%，至處理48 h時為15.73%；A2處理的離體貯藏花粉萌發(fā)率下降較另2個處理緩慢，在處理3～48 h時均顯著高于A1和A3處理，在處理5 h時仍達(dá)80.76%，處理24 h時為48.76%，處理48 h時為34.28%；A3處理的離體貯藏花粉萌發(fā)率下降最明顯，在處理1～48 h時均顯著低于另2個處理，處理7 h時為2.55%，處理24和48 h時均為0。可見，大果型黃百香果花粉平鋪在硫磺紙上自然風(fēng)干貯藏，其活力強(qiáng)于密封于離心管中常溫貯藏和平鋪在硫磺紙上置于干燥器中貯藏。

2.4 不同貯藏溫度對大果型黃百香果離體花粉活力的影響

從圖4可看出，B1處理1～3 h大果型黃百香果離體貯藏花粉的萌發(fā)率均明顯高于同時間段B2處理的花粉，之后B2處理花粉的萌發(fā)率高于B1處理；B2處理24 h時的花粉萌發(fā)率為61.49%，處理48 h時的花粉萌發(fā)率仍達(dá)55.22%，均顯著高于同時間段其他溫度處理；B3處理的花粉萌發(fā)率下降明顯，處理1～48 h時均顯著低于同時間段其他溫度處理，其中在處理3 h時的萌發(fā)率僅為26.76%，處理7、24和48 h時萌發(fā)率均為0；B4處理的花粉萌發(fā)率下降趨勢較B3處理平緩，處理7 h時為43.83%，處理48 h時為5.41%?？梢?，大果型黃百香果花粉在4 ℃下的貯藏效果優(yōu)于在-20 ℃下貯藏，而自然風(fēng)干5 h后密封于離心管中4 ℃貯藏的花粉活力最強(qiáng)。

3 討 論

花粉離體萌發(fā)過程中受多種因素影響，其中培養(yǎng)基配方的影響較大。蔗糖是花粉離體培養(yǎng)基的主要成分，不僅為花粉萌發(fā)提供營養(yǎng)，還發(fā)揮調(diào)節(jié)滲透勢的作用[14]。硼是植物有性生殖過程中必需的微量元素，在培養(yǎng)基中添加硼酸有利于花粉萌發(fā)及花粉管伸長[15]。鈣是花粉生長所需的物質(zhì)成分，杜兵帥等[16]研究表明，鈣離子對調(diào)控花粉管極性生長具有重要作用，且是影響花粉管萌發(fā)和生長的重要因素?；ǚ勰茉谝欢ǖ膒H范圍內(nèi)萌發(fā)，王玉林等[17]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的pH在6.5～7.5時，火龍果花粉離體萌發(fā)率較高。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，其中，硝酸鈣對大果型黃百香果花粉離體萌發(fā)的影響達(dá)極顯著水平，當(dāng)硝酸鈣濃度為0時，花粉萌發(fā)率較低或不萌發(fā)；蔗糖對大果型黃百香果花粉萌發(fā)的影響達(dá)顯著水平，蔗糖濃度為100.00 g/L時花粉萌發(fā)率最高，蔗糖濃度過低或過高均影響花粉萌發(fā)；硼酸和pH對大果型黃百香果花粉離體萌發(fā)影響較小。吳斌等[12]研究認(rèn)為蔗糖和硼酸濃度對小黃金百香果的花粉萌發(fā)具有顯著影響，蔡昭艷等[13]研究表明pH、蔗糖和硼酸對“臺農(nóng)一號”百香果花粉萌發(fā)均具有影響顯著，本研究結(jié)果與吳斌等[12]的研究結(jié)果存在差異，可能與培養(yǎng)基組分對不同百香果品種花粉萌發(fā)的影響不同有關(guān)。

植物雜交育種過程中常出現(xiàn)親本花期不遇或需要異地雜交等情況，因此研究花粉的貯藏條件以保持花粉活力至關(guān)重要?；ǚ鄣馁A藏力受自身遺傳特性和外界因素影響，外界因素中溫度和濕度對花粉活力的影響均較大[18]。潘磊等[19]研究發(fā)現(xiàn)，低溫有利于煙草花粉形態(tài)和活力保持。本研究中，大果型黃百香果開花前一定時間內(nèi)的花粉活力與開花時相近，開花后3 h的花粉活力有所提升，之后顯著下降，說明大果型黃百香果開花前后一定時間內(nèi)的花粉均具有較強(qiáng)活力，可用于人工授粉。本研究探討了密封于離心管、自然風(fēng)干和置于干燥器中的3種濕度條件及4 ℃和-20 ℃溫度條件下的4種貯藏方法對百香果花粉離體萌發(fā)的影響，結(jié)果表明自然風(fēng)干5 h后密封于離心管中4 ℃貯藏效果最佳，貯藏48 h時花粉的萌發(fā)率仍達(dá)55.22%，說明貯藏濕度和溫度對大果型黃百香果花粉的活力均具有明顯影響。其中，平鋪在硫磺紙上置于干燥器中貯藏及密封于離心管中-20 ℃貯藏的花粉活力下降較快，可能與干燥器貯藏濕度過低，花粉中的水分蒸發(fā)過快，以及在濕度較大情況下置于-20 ℃貯藏花粉中的水分容易產(chǎn)生結(jié)晶，從而導(dǎo)致花粉失活有關(guān)。本研究中設(shè)置的花粉貯藏時間最長為48 h，下一步可通過超低溫保存技術(shù)進(jìn)一步探究如何延長百香果花粉的貯藏時間。

4 結(jié) 論

100.00 g/L蔗糖+0.02 g/L硼酸+0.40 g/L硝酸鈣及pH 5.0為大果型黃百香果花粉離體萌發(fā)的最適培養(yǎng)基。當(dāng)天采集大果型黃百香果花朵的花粉自然風(fēng)干5 h后密封于離心管4 ℃貯藏其萌發(fā)效果最佳。