焦文鵬 郭秀娟 焦文靜 馬鳴 張金艷

肝癌是全球范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤，最新數(shù)據(jù)顯示，2018年全球新發(fā)肝癌病例1 033 701 例，居惡性腫瘤發(fā)病率第7 位；死亡病例782 685 例，死亡率居惡性腫瘤第2 位[1]。我國癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示肝癌是我國常見惡性腫瘤，其死亡率和發(fā)病率均高于世界平均水平，是我國的第二大惡性腫瘤死亡原因[2]。且大多數(shù)肝癌發(fā)生于乙型或丙型肝炎病毒感染或酒精濫用等潛在肝病患者，加大早期診斷的難度，同時肝癌患者的預(yù)后較差，其3年生存率低于20%[3]。同時肝癌的的發(fā)病機制尚未明確，缺乏針對性治療方法，因此尋找特異性的早期診斷和治療的腫瘤標志物對于肝癌的早期診斷、治療和改善肝癌患者的預(yù)后尤為重要。

MicroRNA（miRNA）是控制基因表達和癌癥發(fā)展的內(nèi)源性小型非編碼RNA，可以靶向結(jié)合蛋白編碼基因而影響靶基因的穩(wěn)定性或在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達[4-7]。尤其是在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[8-10]。多項研究表明miR-221 在宮頸癌[11-12]、喉癌[13]、前列腺癌[14-15]和胃癌[16]中異常表達，發(fā)揮著重要的作用。而miR-221 在肝癌中的研究較少，本研究利用基因表達數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus database，GEO）[17]公共數(shù)據(jù)庫的肝癌大樣本數(shù)據(jù)和臨床樣本驗證的方式分析miR-221 在肝癌織中的表達水平及其與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，進一步分析miR-221 在肝癌患者診斷及臨床預(yù)后方面的價值。利用生物信息學(xué)的手段分析了miR-221 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的機制，以期為肝癌患者的診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的選擇和芯片數(shù)據(jù)的差異性分析

本次研究所用到的公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)集是來自基因表達數(shù)據(jù)庫GEO 中的GSE10694 和GSE108724兩個芯片數(shù)據(jù)集，且芯片數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理。R 軟件中Limma 包[18]用于數(shù)據(jù)的標準化以及癌組織和正常組織的差異性分析。利用Targetscan、miRWalk和miRTarBase 數(shù)據(jù)庫進行miR-221 的靶基因預(yù)測，利用韋恩圖取交集，對所得的靶基因利用Clusterprofile 包進行基因本體論（gene ontology，GO）與京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2 臨床樣本信息

本次實驗所用臨床樣本均收集于2016年1月至2018年12月間河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院手術(shù)切除的74 例肝癌患者，所有患者術(shù)前均未接受過放射治療和化療。此外，分別收集了25 例肝癌患者和正常人的血漿樣本，用于評估m(xù)iR-221 在血漿中的表達水平。同時收集患者原發(fā)灶組織及距腫瘤原發(fā)灶邊緣>5 cm 的癌旁非腫瘤組織，且獲得患者知情同意以及本次研究通過河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.3 細胞及主要試劑

人肝癌細胞系HepG2 和MHCC97H 細胞由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院和河北醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院保留并傳代培養(yǎng)。重組質(zhì)粒及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000和MTS 試劑均購自美國Promega公司，胰蛋白酶和TRIzol 試劑購自北京索萊寶科技有限公司，胎牛血清購自美國BI 公司，RPMI 1 640 培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司。兔抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）與波形蛋白（vimentin）及GAPDH 單克隆抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG）購自美國KPL 公司，電化學(xué)發(fā)光試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 RNA 提取及實時熒光定量PCR 法檢測肝癌組織和血漿中miR-221 的表達 按TRIzol 試劑說明書提供的操作流程，采用苯酚-氯仿抽提法分別提取肝癌及癌旁組織中總RNA。用紫外分光光度計檢測各組織中總RNA 的濃度和純度，并進行瓊脂糖凝膠電泳以評估RNA 的完整性。將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA 為模板進行實時熒光定量PCR 檢測。miR-221 的正義鏈：5'-GGGAAGCTACTAAGTCTGC-3';反義鏈：5'- GTGCGTGTCGTGGAGTCG -3'。U6 為實時熒光定量PCR 驗證時的內(nèi)參，其正義鏈序列為：5'-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3，反義鏈序列為5'-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3'。應(yīng)用實時定量熒光PCR 法檢測miR-221 在肝癌組織及癌旁正常組織和血漿中的表達水平，反應(yīng)條件為95℃，30 s 預(yù)變性，95℃，12 s，62℃，30 s，72℃延伸40 s，共40 個循環(huán)。以每個熒光信號達到閾值時經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)作為Ct 值，U6 作為miR-221 的內(nèi)參，ΔCt=Ct（miR-221）-Ct（U6），miR-221 的相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.4.2 miR-221 與肝癌患者預(yù)后相關(guān)性的分析及其在診斷肝癌患者方面的能力 用R 軟件中的pROC[19]包進行的受試者工作特征（ROC）曲線分析，以探索miR-221 區(qū)分肝癌患者與健康個體的敏感性和特異性。Kaplan-Meier plotter （http://kmplot.com/）[20]是一個在線數(shù)據(jù)庫，包含了多基因大樣本的預(yù)后分析。為了分析miR-221 的表達水平與肝癌患者生存時間之間的相關(guān)性，本研究將肝癌患者分為miR-221 高表達組和miR-221 低表達組，利用K-M 生存曲線分析了miR-221 表達水平與肝癌患者的總生存時間（overall survival，OS）以及無病生存時間(disease-free Survival，DFS）之間的相關(guān)性。

1.4.3 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的HepG2 和MHCC97H 細胞接種于6 孔板中，接種密度以過夜培養(yǎng)后細胞融合度為70%～80% 為標準。按照Lipofectamine2000說明書提供的操作流程，以無血清DMEM培養(yǎng)液配制轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒工作液，分別向HepG2和MHCC97H 細胞中轉(zhuǎn)染兩種miR-221inhibitor 及陰性對照（NC 組）。轉(zhuǎn)染6 h 后更換為含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，收集HepG2 和MHCC97H 細胞，提取總RNA，采用實時熒光定量PCR 法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4.4 MTS法檢測低表達miR-221 對HepG2 和MHCC97H 細胞增殖能力的影響 轉(zhuǎn)染后的HepG2和MHCC97H 細胞培養(yǎng)24 h 后常規(guī)消化并重懸于培養(yǎng)液中，調(diào)整細胞密度，分別接種于96 孔培養(yǎng)板中（1×103個/孔），每組設(shè)置6 個復(fù)孔。分別于細胞貼壁生長后0、24、48、72 和96 h 時在每孔加入20 μL MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm處檢測各孔的OD 值，表示細胞的增殖水平。

1.4.5 細胞克隆形成實驗 轉(zhuǎn)染后的HepG2 和MHCC97H 細胞培養(yǎng)24 h 后常規(guī)消化并重懸于培養(yǎng)液 中，調(diào)整細胞密度分別接種于6 孔板（5×103個/孔），常規(guī)培養(yǎng)1 周。用4%多聚甲醛溶液固定30 min 后，0.1% 結(jié)晶紫染色30 min，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)克隆形成數(shù)（>50 個細胞計為1 個克隆），并計算克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.4.6 Transwell 小室實驗檢測肝癌細胞侵襲能力 轉(zhuǎn)染后的HepG2 和MHCC97H 細胞培養(yǎng)24 h后常規(guī)消化并重懸于培養(yǎng)液 中，調(diào) 整細胞密度為1×105個/mL。將細胞懸液 以100 μL/孔接種于Transwell 小室的上室中，下室中加入750 μL/孔完全培養(yǎng)液。將細胞懸液接種于基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室。將接種細胞后的Transwell 小室置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，用4%多聚甲醛溶液固定，并進行結(jié)晶紫染色。棉簽擦去上室面殘余細胞，在倒置相差顯微鏡下計數(shù)穿過小室膜的細胞數(shù)量，以此反映細胞的侵襲能力。

1.4.7 實時熒光定量PCR 法檢測低表達miR-221對EMT 標志物mRNA 水平的影響 應(yīng)用實時熒光定量PCR 法檢測低表達miR-221 后HepG2 和MHCC97H 細胞中E-cadherin、N-cadherin 及vimentin mRNA 的表達情況。E-cadherin 的正義鏈：5'-CGAG AGCTACACGTTCACGG-3';反義鏈：5'- GGCCTTT TGACTGTAATCACACC-3'。N-cadherin 的正義鏈：5'-CAACTTGCCAGAAAACTCCAGG-3';反義鏈：5'-ATGAAACCGGGCTATCTGCTC-3'。Vimentin 的正義鏈：5'-CGCCTGCAGGATGAGATTCAG-3';反義鏈：5'- TCAGGGAGGAAAAGTTTGGAAA-3'。

1.4.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測低表達miR-221 對EMT 標志物蛋白表達水平的影響 按照蛋白提取試劑盒操作流程抽提細胞總蛋白。按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進行10% SDS-PAGE 分離蛋白，以80 V 為起始電壓進行電泳，分離膠電壓至120 V，電泳約90 min。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，取出后放入含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫孵育1 h，加入稀釋后的一抗 [兔抗人E-cadherin、N-cadherin、vimentin 及GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體（體積稀釋比例分別為1∶2 000、1∶6 000、1∶2 000 和1∶10 000）]，在搖床上4℃孵育過夜；用TBST 清洗膜3 次，每次5 min；加入稀釋的二抗[辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶100 000）]，室溫孵育1 h 后，用TBST 清洗膜3 次，每次5 min；在PVDF 膜上滴加電化學(xué)發(fā)光劑，曝光，顯影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0 和R 3.6.2 軟件對所有的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗均獨立重復(fù)3 次，計量資料以xˉ ±s表示。MiR-221 在肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織和血漿中的表達差異及其與臨床病理資料間的關(guān)系均采用秩和檢驗，兩獨立樣本比較采用t檢驗和近似t檢驗，且均為雙側(cè)檢驗。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意 義。

2 結(jié)果

2.1 miR-221 在GEO 數(shù)據(jù)集中的表達水平

本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫中下載獲得GSE10694和GSE108724 兩個數(shù)據(jù)集，利用R 和Graphpad 軟件分析發(fā)現(xiàn)，miR-221 在肝癌患者腫瘤組織中的表達水平顯著高于正常組織。MiR-221 在GSE10694 和GSE108724 兩個數(shù)據(jù)集中的相對表達量分別為：13.58±0.11vs. 12.05±0.09（P<0.001圖1A，1B）和7.42±0.43vs.3.25±0.83（P<0.001 圖1C，1D）。

圖1 miR-221 在GEO 數(shù)據(jù)集中的表達水平

2.2 miR-221 在肝癌患者腫瘤組織和血漿中的表達及其表達水平與肝癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性

本研究經(jīng)過實時熒光定量PCR 法檢測結(jié)果顯示，miR-221 在肝癌患者腫瘤組織中的表達水平顯著高于對應(yīng)癌旁正常組織中的表達水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其相對表達量分別為：5.51±0.11vs. 4.05±0.09（P<0.001，圖2A）。此外，實時熒光定量PCR 結(jié)果顯示，在25 例肝癌患者血漿中miR-221 的相對表達水平顯著高于正常健康人群，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其相對表達量分別為：4.04±0.20vs. 2.54±0.16（P<0.001，圖2B）。

圖2 miR-221 在肝癌組織和血漿中的表達水平

進一步分析miR-221 的表達水平與74 例肝癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，miR-221 的表達水平與肝癌患者的TNM 分期和腫瘤大小顯著相關(guān)（P<0.05，表1）。

表1 miR-221 的表達水平與74 例肝癌患者臨床病理特征之間的相關(guān)性

2.3 miR-221 在肝癌患者中的診斷及預(yù)后價值

利用74 例肝癌患者組織中miR-221 的表達量分析其在診斷肝癌患者方面的價值，ROC 分析結(jié)果顯示曲線下面積為0.967（圖3A），說明miR-221 具有較強的診斷價值。進一步利用Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫分析了miR-221 的表達水平與肝癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示低miR-221 表達組的肝癌患者的總生存時間（圖3B）和無病生存時間（圖3C）均顯著長于高miR-221 表達組的肝癌患者。

圖3 miR-221 在肝癌診斷方面的價值及其表達水平與肝癌患者預(yù)后之間的相關(guān)性

2.4 miR-221 靶基因的富集分析

對所獲得的miR-221 的包括軸形成抑制因子2（the Axin-related protein 2，AXIN2）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 10，MAPK10）、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1（endothelin converting enzyme 1，ECE1）等基因在內(nèi)的456 個靶基因進行GO 和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-221 主要參與的生物過程包括調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育細胞生長、肌醇脂質(zhì)介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、細胞對肽激素刺激的反應(yīng)以及磷脂酰肌醇3-激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控等（圖4A）。而所參與的信號通路主要為p53 信號通路、調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路、ErbB 信號通路、RNA 轉(zhuǎn)運、mTOR 信號通路、cGMP-PKG 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和MAPK信號通路（圖4B）。此結(jié)果可表明miR-221 在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。

圖4 miR-221 靶基因的功能富集分析

2.5 沉默miR-221 的表達顯著抑制肝癌細胞的增殖和侵襲能力

MTS 分析結(jié)果顯示，與空白對照組相比，48、72和96 h miR-221 inhibitor 轉(zhuǎn)染組HepG2 和MHCC97H 細胞的OD 值顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖5A）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，沉默miR-221 的表達后，HepG2 和MHCC97H 的細胞克隆形成數(shù)明顯減少（P<0.01，圖5B）。Transwell 小室分析結(jié)果顯示，敲低miR-221 可顯著抑制HepG2 和MHCC97H 細胞的侵襲能力（P<0.01，圖5C）。

2.6 沉默miR-221 對EMT 過程相關(guān)分子表達的影響

實時熒光定量PCR 分析結(jié)果顯示，敲低miR-221 后，肝癌HepG2 和MHCC97H 細胞的E-cadherin mRNA 表達水平顯著上調(diào)（P<0.01），N-cadherin 和vimentin mRNA 的表達水平明顯降低（P<0.01）（圖6A，B）。蛋白質(zhì)印記法分析結(jié)果顯示（圖5C），下調(diào)miR-221 表達后，肝癌HepG2 和MHCC97H 細胞中E-cadherin 蛋白表達水平顯著上調(diào)（P<0.01），而N-cadherin 和vimentin 蛋白的表達水平明顯降低（P<0.01）（圖6C）。此結(jié)果表明miR-221 可能通過調(diào)控肝癌細胞的EMT 進程而影響肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

圖5 低表達miR-221 對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響

圖6 分別采用實時熒光定量PCR 法（A 和B）和蛋白質(zhì)印跡法（C）檢測miR-221 低表達后對HepG2 和MHCC97H 細胞中EMT 標志物Ecadherin、N-cadherin 和vimentin mRNA 和蛋白表達水平的影響

3 討論

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一，盡管近年來診療手段的快速發(fā)展，使得肝癌的診斷和治療效果顯著，但3年生存率僅為18%，因此尋找特異性的腫瘤標志物對于肝細胞癌的治療尤為迫切。越來愈多的研究表明miR-221 在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Dong 等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-221-3p 在肝癌組織和細胞系中顯著高表達，且與肝癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，且通過促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移而促進肝癌的發(fā)生和發(fā)展。Shanmugapriya 等[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-221 在宮頸癌HeLa 細胞系中高表達，且過表達miR-221 可顯著促進HeLa 細胞的增殖能力，并減少癌細胞的凋亡。zhang 等[12]通過微陣列的基因表達譜及RT-qPCR 驗證分析發(fā)現(xiàn)miR-221 在宮頸癌組織和細胞中明顯高表達，且通過上調(diào)MAPK10 的表達來抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲、遷移以及血管生成。Shi 等[13]分析發(fā)現(xiàn)miR-221 在喉癌組織中表達顯著升高，且通過PI3K/AKT 信號通路顯著抑制喉癌細胞的增殖和細胞周期，并誘導(dǎo)喉癌細胞的凋亡。有研究[22]發(fā)現(xiàn)miR-221 在復(fù)發(fā)性乳頭狀甲狀腺癌中的表達水平顯著高于非復(fù)發(fā)性乳頭狀甲狀腺癌，且與初始手術(shù)時的腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征顯著相關(guān)。同樣Wang 等[23]通過生物信息學(xué)手段分析發(fā)現(xiàn)miR-221在乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達水平顯著高于正常組織，且通過ErbB 信號通路而在乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，認為miR-221 可以作為乳頭狀甲狀腺癌診斷和治療的潛在靶標。Neagu[24]分析發(fā)現(xiàn)miR-221 在皮膚癌中異常高表達，且在皮膚癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。而Krebs 等[14]的研究發(fā)現(xiàn)miR-221 在前列腺癌組織中的表達顯著下調(diào)，抑制前列腺癌的增殖和誘導(dǎo)凋亡，進一步分析發(fā)現(xiàn)miR-221 主要通過調(diào)節(jié)致癌基因SOCS3 和PIK3R1 的表達使前列腺癌細胞對酪氨酸激酶抑制劑敏感性增加。而Krebs 研究[15]發(fā)現(xiàn)miR-221 在前列腺癌組織中顯著高表達，且與高危前列腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，且靶向VEGFR2 而發(fā)揮著致癌基因的作用。

有研究[25]發(fā)現(xiàn)miR-221 在乳腺癌組織中低表達，且主要作為長非編碼RNA 生長停滯特異性5（GAS5）的海綿體而抑制Wnt /β-catenin 途徑的激活，進而在阿霉素的耐藥性中發(fā)揮作用。Li 等[26]研究發(fā)現(xiàn)miR-221 在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于正常組織，且與乳腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。Jiang 等[16]發(fā)現(xiàn)miR-221-5p 在胃癌組織和細胞系中的表達顯著降低。miR-221-5p 的高表達降低了胃癌細胞對順鉑的耐藥性，并抑制了胃癌細胞的增殖和遷移。此外，機制研究miR-221-5p 的表達水平升高通過靶向DDR1 來提高胃癌細胞對順鉑的化學(xué)敏感性，并抑制GC 細胞的增殖、侵襲、遷移和EMT 進程。本研究通過分析GEO 數(shù)據(jù)庫中的大樣本樣本發(fā)現(xiàn)miR-221 在肝癌組織中的表達水平顯著高于正常組織，進一步利用臨床患者的腫瘤組織和血漿樣本同樣發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織和血漿中顯著高表達，且與肝癌患者的腫瘤大小、TNM分期和不良預(yù)后顯著相關(guān)。靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)軸形成抑制因子2（AXIN2）、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK10)、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1（ECE1）等基因可能是miR-221 的關(guān)鍵靶基因，而AXIN2[21]以及MAPK10[12]已經(jīng)實驗驗證過，本研究將在接下來的研究中實驗驗證ECE1 是否是miR-221 的下游關(guān)鍵靶基因。功能富集分析發(fā)現(xiàn)miR-221 主要參與p53 信號通路、調(diào)節(jié)干細胞多能性的信號通路、ErbB 信號通路、RNA 轉(zhuǎn)運、mTOR信號通路、cGMP-PKG 信號通路、PI3K-Akt 信號通路和MAPK 信號通路以及細胞生長等而在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，且PI3K-Akt 信號通路所富集的靶基因最多。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)miR-221主要通過調(diào)控EMT 進程相關(guān)分子的表達水平變化而促進肝癌的發(fā)生發(fā)展。今后，本課題組將會進一步擴大樣本量，并研究體內(nèi)實驗miR-221 在肝癌中的具體作用機制，以期為肝癌的診斷和靶向治療提供更多的依據(jù)。