操曉亮，張峰，柴國璧，劉加增，洪祖燦，周培琛，孫世豪，胡軍，茅中一，姬凌波，付英杰，席輝*

1 福建中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，福建省廈門市集美區(qū)濱水路298號 361021；

2 中國煙草總公司鄭州煙草研究院 煙草行業(yè)煙草香料基礎研究重點實驗室，鄭州高新技術產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號 450001

鐵觀音（Tie Guanyin），又名紅心鐵觀音，原產(chǎn)于福建泉州市安溪縣，屬于中國傳統(tǒng)名茶中青茶的代表之一[1-2]。該茶具有獨特的清香雅韻、芬芳馥郁的花香和果香，深受消費者的青睞[3]。茶葉提取物中有非常豐富的香氣成分，其中有許多成分與煙草相同[4-6]，因此，許多研究者采用水蒸氣蒸餾[7-8]、溶劑浸提[9]、亞臨界提取[10]等不同的提取方法制備茶葉提取物并應用于卷煙加香，結果表明茶葉提取物不僅能夠豐富煙香、賦予卷煙茶香風格特征，而且能夠改善煙氣狀態(tài)，提升卷煙的吸食品質。

茶葉中香味物質種類多、含量較低[11-12]，使茶葉提取物得率低，對提取物香味物質含量的精確檢測帶來一定困擾，也導致在卷煙中使用成本高、范圍受限。研究表明，感官導向凝膠色譜分離法較好地實現(xiàn)了煙葉提取物中關鍵香味[13]、甜味[14]、酸味[15]成分的分離及定性（量）分析；香氣活性值分析也分別確定出了煙葉[16]、煙葉提取物[17]的香氣關鍵貢獻成分；而針對米酒[18]、煎烤白蘑菇[19]、蔓越莓[20]、芒果[21]等食品風味關鍵貢獻成分的重組較好地實現(xiàn)了其特征香氣模擬。

本研究以鐵觀音茶葉提取物為對象，通過感官導向凝膠色譜、頂空-固相微萃取、氣相色譜-質譜聯(lián)用等技術對其成分進行分離、定性（量）分析，利用三點選配法確定出具有關鍵感官貢獻作用的特征香味成分，通過關鍵香氣物質的重組實驗進行感官作用驗證，并將香氣重組物質添加入天然提取物及卷煙中，考察其作用效果，為天然香料特征香味關鍵貢獻成分的分析、重構、風格特征強化與卷煙加香應用提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

鐵觀音茶葉（2019年安溪祥華紅心鐵觀音秋茶）；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare公司）。

正己醛（純度＞95%，TCI公司），葉醇（純度98%，Aladdin公司），2（5H）呋喃酮（純度＞93%，TCI公司），γ-丁內(nèi)酯（純度99%+，Acros Organics公司），苯甲醛（純度≥99.5%，Aladdin公司），月桂烯（純度＞75%，TCI公司），己酸己酯（純度99%+，Chemicell公司），α-水芹烯（純度97%，Sigma-Aldrich公司），α-萜品烯（純度＞90%，TCI公司），對傘花烴（純度99%，Sigma-Aldrich公司），檸檬烯（純度98.4%，Chem service公司），苯甲醇（純度≥99%，Sigma-Aldrich公司），2-甲基丁酸丁酯（純度98%+，阿達瑪斯試劑有限公司），苯乙醛（純度98%，Acros Organics公司），丙酸-3-己烯酯（純度98%+，阿達瑪斯試劑有限公司），芳樟醇（純度97%，Acros Organics公司），苯乙醇（純度＞99%，Sigma-Aldrich公司），茶香酮（純度＞95%，Aladdin公司），1-苯基-1，2-丙二酮（純度99.8%，Ark Pharm公司），苯甲酸乙酯（純度99%，TCI公司），4-萜烯醇（純度97%，Acros Organics公司），2-（4-甲基苯基）丙-2-醇（純度≥99.5%，Sigma-Aldrich公司），水楊酸甲酯（純度≥99%，Sigma-Aldrich公司），α-松油醇（純度99%，Acros Organics公司），癸醛（純度96%，阿達瑪斯試劑有限公司），橙花醇（純度98%，TRC公司），香葉醇（純度98%，阿達瑪斯試劑有限公司），乙酸苯乙酯（純度95%，F(xiàn)luka公司），檸檬醛（純度95%，Sigma-Aldrich公司），2-苯基巴豆醛（純度97%，阿法埃莎化學有限公司），吲哚（純度99.5%，Chem service公司），茶香螺烷（純度98%+，阿達瑪斯試劑有限公司），γ-壬內(nèi)酯（純度＞98%，TCI公司），茉莉酮（純度＞93%，TCI公司），丁酸苯乙酯（純度98%+，阿達瑪斯試劑有限公司），γ-癸內(nèi)酯（純度98%，阿法埃莎化學有限公司），可卡醛（純度＞90%，TCI公司），橙花叔醇（純度97%，J&K公司），二氫獼猴桃內(nèi)酯（純度98%+，阿達瑪斯試劑有限公司），茉莉酸甲酯（純度98%，Aladdin公司），氧化芳樟醇-吡喃型（純度＞98%，TCI公司），氧化芳樟醇-呋喃型（純度＞97%，TCI公司），丙酮（色譜純，TCI公司），乙醇（色譜級，TCI公司），去離子水（中國屈臣氏公司）；內(nèi)標：丙酸蘇合香酯（純度98%，Acros Organics公司）。

冷凍干燥機（德國Christ公司）；7890A/5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；SPME手柄、SPME萃取纖維頭（美國Supelco公司，60 μm PEG、100 μm PDMS、75 μm Carboxen/PDMS、65 μm PDMS/DVB（Fused Silica & Metal alloy）、50/30 μm DVB/ CAR/ PDMS、85 μm PA、30 μm PDMS、7 μm PDMS、85 μm Carboxen/PDMS）；帶橡膠墊螺紋頂空進樣玻璃瓶（美國CNW公司）；CP2245電子天平（感量0.0001 g，德國Sartorius公司）；天然香料中試實驗線（廈門煙草工業(yè)有限責任公司）；RNF-2500型卷式膜多功能中試設備（廈門世達膜科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 鐵觀音茶葉提取物制備方法

參考文獻[8]方法，以鐵觀音茶葉為原料，投料30 kg，采用水蒸氣蒸餾法提取香氣成分餾出液，其中，蒸餾方式為直通蒸汽，蒸餾速率為20 kg/h，蒸餾時間2.5 h；然后采用反滲透膜濃縮富集香氣成分而獲得具有鐵觀音茶香特征香韻的茶葉提取物，得率為1.04%。

1.2.2 茶葉提取物關鍵貢獻組分分離方法

感官導向凝膠色譜分離法：取茶葉提取物300 mL，經(jīng)冷凍干燥后得0.79 g凍干物，用10 mL乙醇多次洗脫后合并，得茶葉提取物香味物質溶液，以蒸餾水作為流動相，以Sephadex LH-20作為填料，以流速3 mL/min，進行凝膠色譜分離，通過收集器每3 min收集一個流份，紫外檢測儀監(jiān)測以確定收集流份的起點和終點。通過此法共收集117個流份，由10位評價人員以直接嗅聞的方式對各流份的香氣特征進行評價。

1.2.3 茶葉提取物及其特征香味物質組分的定性分析

固相微萃取分析方法：取茶葉提取物或特征香味物質組分樣品1 g，置于20 mL螺紋頂空瓶中，用聚四氟乙烯襯里的硅橡膠墊密封。分別使用10種市售的萃取頭30℃頂空吸附1 h，利用氣質聯(lián)用儀對吸附在纖維頭上的組分進行解吸附及分析。

色譜柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：He；恒流模式：1.0 mL/min；升溫程序：50℃保持0 min，以3℃/min的速率升至300℃，保持0 min；進樣方式：不分流進樣；進樣口溫度：280℃；解吸附時間：5 min；傳輸線溫度：280℃；電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度230℃；四極桿溫度：150℃；掃描質量范圍：33～500 amu；溶劑延遲：0 min。

1.2.4 特征香味物質的定量分析方法

前處理方法：取100 mL的鐵觀音茶葉提取物樣品于表面皿中，冷凍處理。將完全冷凍的樣品放入冷凍干燥機中進行干燥處理。稱量凍干后的鐵觀音茶葉提取物樣品，將樣品轉移到容量瓶中，加入50 μL濃度為1 mg/mL以丙酮配制的丙酸蘇合香酯內(nèi)標儲備液定容至5 mL，配制成內(nèi)標濃度10 μg/mL的樣品溶液。

分析方法：采用內(nèi)標法進行定量分析，色譜柱：DB-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：He；柱流量：1 mL/min；進樣口溫度：280℃；進樣量：1 μL；程序升溫：起始溫度50℃，以3℃/min的速率升至300℃，保持1 min；分流模式：不分流進樣；GC/MS傳輸線溫度：280℃；EI離子源溫度：230℃；四級桿溫度：150℃；EI電離能量：70 eV；掃描模式：SIM。

1.2.5 特征香味物質的貢獻度分析方法

閾值測定方法：依據(jù)《GB/T 22366-2008 感官分析 方法學 采用三點選配法（3-AFC）測定嗅覺、味覺和風味覺察閾值的一般導則》測定茶葉提取物各特征香氣成分在乙醇中的嗅覺閾值。

香氣活性值（OAV）計算方法：參考文獻[1]的方法進行，具體為香氣成分在香氣體系中的絕對質量濃度（C）與其覺察閾值（T）的比值，即OAV=C/T。

1.2.6 感官評價方法

香氣嗅辨方法：參考文獻[22]方法，以香味輪廓法對茶葉提取物及其特征香氣成分進行嗅辨評價。

加香評價方法：將鐵觀音茶葉提取物與特征香氣關鍵貢獻成分重組物用75%的乙醇進行稀釋，按照0.01%的質量均勻注射到空白卷煙中，得到試驗卷煙樣品。以注射等量75%乙醇的卷煙為空白卷煙樣品。所有樣品均放置于溫度（22±1）℃和濕度（60±2）%的環(huán)境中平衡48 h，參考《YC/T 497—2014 卷煙 中式卷煙風格感官評價方法》對卷煙進行感官評價，評價小組由10名具有評吸資質的人員組成。

1.2.7 特征香味物質關鍵貢獻成分的重組及應用

依據(jù)鐵觀音茶葉提取物關鍵香氣成分的定量與貢獻度排序結果，進行鐵觀音茶葉提取物特征香氣關鍵貢獻成分的重組實驗，然后向茶葉提取物中添加1%的該重組物，參照1.2.6的方法，通過對比重組物與茶葉提取物的感官評價結果驗證茶葉重組物的香氣特征和加香效果，通過對比茶葉提取物修飾前后的加香效果驗證重組物對茶葉提取物香氣特征強化效果。

2 結果與討論

2.1 茶葉提取物的感官導向分離

凝膠色譜是感官導向分析中常用的分離手段，基于分子體積的差異性進行分離，由于香氣分子的空間結構和香氣特征關系密切，采用凝膠色譜有可能完成對相似香氣特征分子的有效分離和富集。由感官評價小組對凝膠色譜分離所收集的117個流份逐一進行嗅香評價，去除無明顯香氣特征的流份后，將香氣特征相似的流份合并后得到11個香氣組分，各香氣組分的嗅香評價結果如表2所示，其中組分5～7等28份香氣流份與鐵觀音茶葉提取物的香氣特征最為接近，因此選擇將組分5～7合并后作為鐵觀音茶葉提取物關鍵貢獻組分，進行綜合分析。鐵觀音茶葉提取物經(jīng)感官導向凝膠色譜分離后，排除了非特征香味成分的干擾，特征香味成分得到了有效的分離和富集，為后續(xù)的精確分析和香氣重構奠定物質基礎。需要指出的是，由于水蒸氣蒸餾所得茶葉提取物經(jīng)反滲透膜濃縮后濃度仍舊較低，無法直接進行凝膠色譜分離及后續(xù)色譜分析。綜合考慮濃縮效率和感官品質的影響，分離分析時項目組選取冷凍干燥技術對茶葉提取物再次進行了濃縮處理，感官評價結果顯示處理后的樣品基本保留了原樣品的感官特征。

表2 凝膠色譜分離組分香氣特征評價Tab. 2 The evaluation of aroma characteristics in each gel chromatography separation group

2.2 茶葉提取物及其特征香味物質組分的定性、定量分析

通過凝膠色譜分離獲取茶葉提取物關鍵貢獻組分后，采用頂空固相微萃取技術結合氣質聯(lián)用進行定性分析。由于不同材料性質的萃取頭在成分吸附上存在差異，為較為全面獲取茶葉提取物的香氣成分信息，本研究選取了10種市售的萃取頭（表1）分別對樣品進行定性分析并對結果進行匯總，共鑒定出揮發(fā)性成分100種。結合文獻與化合物商品化性、安全性等特征[23-27]，感官評價小組對這100種化合物進行了標準品保留時間比對篩選及嗅香特征評價驗證[23]，最終確定了鐵觀音茶葉提取物中41種特征香氣化合物，分別測定了它們在茶葉提取物溶液中的含量，結果如表3所示。

表1 SPME萃取頭及活化條件Tab. 1 SPME extraction head and activation conditions

從定量結果可以看出，鐵觀音茶葉提取物中苯乙醇、氧化芳樟醇（吡喃型）、吲哚、橙花叔醇、氧化芳樟醇（呋喃型）、芳樟醇、茉莉酸甲酯、苯甲醇、香葉醇等的含量明顯高于其它香味成分，其中苯乙醇、氧化芳樟醇（吡喃型）、吲哚、橙花叔醇和氧化芳樟醇（呋喃型）的含量尤其高，結果與現(xiàn)有報道基本一致[28-31]。需要指出的是，香味成分的含量僅反映其對于產(chǎn)品感官品質貢獻的一個側面，全面考察香氣物質對產(chǎn)品整體香氣的影響還需結合關鍵成分的閾值，綜合評估各關鍵成分對鐵觀音茶葉提取物感官特征的貢獻[15, 32-33]。

2.3 鐵觀音茶葉提取物特征香味成分的香氣貢獻分析

香氣成分的嗅覺閾值與其所處介質的性質密切相關，鑒于閾值測定時對介質自身感官特征和安全性的要求，在本實驗中選用乙醇作為介質，以獲得鐵觀音茶葉提取物主要香氣成分嗅覺閾值的變化[34]。香氣活性值是表征關鍵香氣成分的一種有效技術手段，在食品關鍵香氣成分表征中得到了廣泛應用[35-36]。在香氣體系中，各香氣成分OAV存在明顯差異，通常認為OAV大于1的成分對體系具有香氣貢獻，OAV越高，貢獻度越大，而OAV小于1的成分對體系香味的貢獻則可以忽略[37]，通過比較不同成分OAV的大小判斷其在香氣體系中的貢獻度，從而判定哪些成分對香氣體系起到關鍵作用[38]?；诖耍瑴y定了鐵觀音茶葉提取物中41種香味成分的嗅覺閾值[39]，結合各香味成分的含量，計算了相應的OAV，結果見表3。根據(jù)OAV大小判定41種香味成分對鐵觀音茶葉提取物香氣體系的貢獻度。

表3 鐵觀音茶葉提取物特征香氣成分評價及分析結果Tab. 3 Evaluation and analysis results of characteristic aroma components in Tie Guanyin tea extracts

續(xù)表3

從閾值測定結果可知：檸檬醛、香葉醇和芳樟醇的閾值遠低于其他成分，這意味著這些成分即使在含量不高的情況下，對香氣也可能具有較大的貢獻。此外，苯乙醇、茉莉酸甲酯和吲哚的閾值也較低，鑒于這些成分在茶葉提取物中含量都較高，因此對其香氣貢獻應該較大。苯甲醇和二氫獼猴桃內(nèi)酯的閾值較高，對茶葉提取物香氣貢獻則相對較小。通過比較OAV結果可知：41種成分中，芳樟醇、香葉醇、檸檬醛和茉莉酸甲酯閾值遠低于其它成分，但具有較高的OAV；苯乙醇、氧化芳樟醇（吡喃型）和吲哚具有較高的含量和較低的閾值，其OAV也高于其它成分；因此，這些OAV大于1的成分對整體香氣均有貢獻，整體來看，己酸乙酯、芳樟醇、苯乙醇、氧化芳樟醇（吡喃型）、香葉醇、檸檬醛、吲哚、橙花叔醇、茉莉酸甲酯對鐵觀音茶葉提取物香氣貢獻最大，是茶葉提取物中最重要的香氣成分。

2.4 基于感官貢獻度的鐵觀音茶葉關鍵香氣成分重組及應用

2.4.1 關鍵香氣成分的重組及評價

在鐵觀音茶葉提取物特征香味成分組群中，22種成分的OAV大于1，它們構成了茶葉提取物的關鍵香氣成分組群，這些成分涵蓋了多種香韻特征。為聚焦茶葉提取物主體香氣特征，以關鍵香氣成分為原料，依據(jù)其定量分析結果準確稱量關鍵香氣成分，溶解于2518 mL 75%乙醇中組成關鍵香氣成分重組物（表4），與茶葉提取物進行香氣對比評價。

表4 鐵觀音茶葉關鍵香氣成分重組物Tab. 4 The recombinant of key aroma compounds in Tie Guanyin tea extracts

對鐵觀音茶葉提取物和關鍵香氣成分重組物進行嗅辨評價，得到如圖1的香氣特征輪廓雷達圖。結果顯示關鍵香氣成分重組物具有與鐵觀音茶葉提取物相似的香氣特征，花香、奶香特征有所增強，表明以關鍵香氣成分在鐵觀音茶葉提取物濃度下的重組物，可成功模擬出茶葉提取物的部分香氣特征；但香氣柔和度和豐富性稍顯不足，且?guī)в幸欢ǖ幕瘜W氣息，這可能是由于重組物所含的香氣成分數(shù)量遠少于茶葉提取物，且多為合成單體，化學氣息較天然香料單體明顯，造成了重組物香氣柔和度和豐富性不足。由此可知，基于OAV結果的重組物與茶葉提取物在嗅香特征表現(xiàn)上具有相似性，能夠體現(xiàn)鐵觀音茶葉的茶香特征香韻。

圖1 鐵觀音茶葉提取物和關鍵香氣成分重組物香氣特征輪廓雷達圖Fig.1 Characteristic aroma contour radar chart of Tie Guanyin tea extracts and the recombinant of key aroma compounds

2.4.2 鐵觀音茶葉關鍵香氣成分重組物的加香評價

對鐵觀音茶葉提取物和關鍵香氣成分重組物進行加香評價，其香氣、煙氣特征對比結果如圖2、3所示，與茶葉提取物相比，在香氣表現(xiàn)上，添加關鍵香氣成分重組物的卷煙茶香特征香韻有所增強，且清甜香與花香較為突出，豐富性稍欠，稍壓煙香，具有一定的化學氣息，缺乏自然、清新、優(yōu)雅感；在煙氣特性方面，其香氣量有所增加，但煙氣柔和細膩度、圓潤性變差，雜氣稍有增加。故添加重組物后的香韻特征雖有所增強，但由于該重組物是由22種關鍵香氣貢獻成分重組來代表茶葉提取物的100種香氣組分，香氣豐富性和天然感缺乏是必然的，因此考慮將重組物與茶葉提取物復配使用，在強化茶香特征香韻的同時避免重組物化學氣息較重等問題。

圖2 添加茶葉提取物和關鍵香氣成分重組物卷煙的香氣特征對比圖Fig.2 Comparison of aroma characteristics of cigarettes added with Tie Guanyin tea extracts and those added with the recombinant of key aroma compounds

2.4.3 鐵觀音茶葉香氣成分重組物對茶葉提取物香氣特征的強化作用

圖3 添加茶葉提取物和關鍵香氣成分重組物卷煙的煙氣特性對比圖Fig.3 Comparison of smoke characteristics of cigarettes added with Tie Guanyin tea extracts and those added with the recombinant of key aroma compounds

對添加關鍵香氣成分重組物修飾前、后茶葉提取物卷煙進行評價，香氣、煙氣特征對比結果如圖4、5。與茶葉提取物相比，在香氣特性方面，修飾后的茶葉提取物能夠使卷煙的花香、清香、果香和甜香明顯增強，香氣豐富性和茶香感知度有所提升，香氣強度有所提高；在煙氣特性方面，可使卷煙的香氣質和量得到提高，煙香協(xié)調性和感官舒適性得以提升。

圖4 添加茶葉提取物和添加修飾后茶葉提取物卷煙的香氣特征對比圖Fig.4 Comparison of aroma characteristics of cigarettes added with Tie Guanyin tea extracts and those added with tea extracts modified with the recombinant of key aroma compounds

此外，天然香料在卷煙加香過程中，由于卷煙抽吸過程中需經(jīng)過燃燒和香味成分轉移，煙氣最終以氣溶膠的形式引起人的感官作用，在這一復雜過程中，無法避免天然香料中的成分發(fā)生裂解、合成、聚合等眾多原位反應[40]，從而帶來無法預料的感官負面效應。而基于天然香料關鍵貢獻成分的重組香精則可以在天然香料感官作用和化學分析數(shù)據(jù)的基礎上，針對性地進行調配或修飾，在實現(xiàn)凸顯天然香料風格特征的同時，最大限度地減少天然香料的不可控因素和無效成分。

圖5 添加茶葉提取物和添加修飾后茶葉提取物卷煙煙氣特性對比圖Fig.5 Comparison of smoke characteristics of cigarettes added with Tie Guanyin tea extracts and those added with tea extracts modified with the recombinant of key aroma compounds

綜上所述，對天然香料關鍵貢獻成分分析結果進行香氣重組，并應用于強化天然香料的香氣特征是可行的、有效的。這對降低天然香料成本，強化香氣特征，增加香氣強度，擴大天然香料的使用范圍具有重要作用。

3 結論

通過感官導向凝膠色譜分離、HS-SPME與GC/MS分析、特征香味成分香氣活性值分析、鐵觀音茶葉提取物香氣重構及其風格特征強化和在卷煙加香中的應用研究，構建了一種成分種類復雜、有效物質含量較低的天然香料關鍵香氣成分分析、重構及其風格強化的方法。結果表明：（1）感官導向凝膠色譜分離較好地分離定位出鐵觀音茶葉提取物的特征香味組分，去除了干擾組分，實現(xiàn)了特征香味成分的分離與富集；（2）定性、定量和香氣活性值分析出鐵觀音茶葉提取物中芳樟醇、橙花叔醇、苯乙醇、香葉醇等22種香氣成分對感官作用貢獻最大；（3）以香氣關鍵貢獻成分在鐵觀音茶葉提取物中的濃度進行香氣重構，能夠較好地實現(xiàn)茶葉香氣特征的模擬。茶葉香氣重組物與茶葉提取復配后用于卷煙加香能夠較好地強化卷煙的茶香風格特征，提升卷煙的吸食品質；（4）建立的天然香料關鍵香氣成分分析、重構及其風格強化方法，為天然香料香氣重構、香氣風格特征強化、香精調配及卷煙加香應用提供新思路。