王凈 周興雅 張金飛 曹悅 吳博晗 李霞

摘要：為獲得高光效的轉(zhuǎn)C4型PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC.1.1.31）基因水稻（簡(jiǎn)稱PC）高代的穩(wěn)定株系，選取2019—2020年種植的同一株系的PC材料，分析PC材料的形態(tài)、光合參數(shù)、酶活性以及產(chǎn)量構(gòu)成因子等的變化特點(diǎn)，并將各參數(shù)進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，PC高代材料的PEPC酶活性、凈光合速率以及產(chǎn)量構(gòu)成因子等指標(biāo)的確存在年度間和株系間的變化，其中變異系數(shù)表現(xiàn)為產(chǎn)量構(gòu)成因子<凈光合速率

關(guān)鍵詞：水稻;PEPC酶;凈光合速率;產(chǎn)量因子;聚類分析

中圖分類號(hào)： S511.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）17-0091-05

收稿日期：2020-12-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31571585）;江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：BE2019377）;國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2016YFD0300501-03）。

作者簡(jiǎn)介：王 凈（1994—），女，河南周口人，碩士研究生，主要從事水稻作物生理研究。E-mail：1790438668@qq.com。

通信作者：李 霞，博士，研究員，主要從事水稻逆境生理研究。E-mail：jspplx@jaas.ac.cn。

水稻（Oryza sativa L.）是全球一半以上人口的主食，其超高產(chǎn)量品種和栽培技術(shù)的發(fā)展都建立在株型改良的基礎(chǔ)上[1]。利用數(shù)量性狀（quantitative trait locus，QTL）分析發(fā)現(xiàn)，株高主要受頂部1節(jié)間和頂部4節(jié)間長(zhǎng)度的影響[2]。在保證抗倒性和保持收獲指數(shù)不變的前提下，株高的增加可提高生物量和最終產(chǎn)量[3]。水稻高光效機(jī)制是水稻超高產(chǎn)育種的重要理論基礎(chǔ)，其中單個(gè)C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC，EC.1.1.31）轉(zhuǎn)基因水稻（簡(jiǎn)稱PC）具高光效特性，受到作物科學(xué)工作者的廣泛關(guān)注[4]。

高表達(dá)轉(zhuǎn)C4型PEPC水稻在高光強(qiáng)和高溫條件下，外源導(dǎo)入的C4-pepc表達(dá)和PEPC酶活性均顯著增加，而且功能葉片的光合效率也顯著提高[5]，單株產(chǎn)量比未轉(zhuǎn)基因的野生型原種Kitaake（簡(jiǎn)稱WT）也顯著提高[6]，并將水稻開花后5～10 d劍葉的PEPC酶活性作為水稻高光效育種篩選的可靠生理指標(biāo)[4]。分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，PEPC酶活性增強(qiáng)和C4-pepc表達(dá)上調(diào)與NO和Ca2+參與蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)密切相關(guān)[7]。在干旱脅迫下，PC水稻中C4-pepc的調(diào)節(jié)與其糖信號(hào)-蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶（sucrose nonfermenting-1-related protein kinase，SnRKs）家族的調(diào)節(jié)有關(guān)，如亞家族 1-SnRK1 相關(guān)基因OsK1a、OsK24、OsK35的表達(dá)和SnRK2均高于WT[8]。而外源葡萄糖施入試驗(yàn)表明，SnRK3s家族基因可與鈣調(diào)B類磷酸酶（calcineurin-B-like，CBL）作用誘導(dǎo)NO 參與PC葉片氣孔調(diào)節(jié)，從而有利于PC 耐旱[9]。因此，PC作為水稻干旱耐性機(jī)制研究材料而被關(guān)注。但隨著這10余年的研究以及多代繁殖，觀察到高代轉(zhuǎn)C4-pepc水稻株系的酶活性表達(dá)不穩(wěn)定，且呈下降趨勢(shì)，導(dǎo)致相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因材料耐旱優(yōu)勢(shì)也受限。因此，如何使外源導(dǎo)入的有益基因在水稻內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，是有益基因能否為水稻育種工作者利用的前提。前期的研究已觀察到不同的測(cè)定條件和不同的生育期是影響高代轉(zhuǎn)C4-pepc水稻株系酶活性發(fā)揮的重要因子[4-5]，但是高代PC 株系在相同條件下仍然存在酶活性的差異，這在一定程度上影響了該材料耐性生理機(jī)制的深入研究和材料在育種中的應(yīng)用。因此，本研究選取不同年份同一株系的高代PC材料，研究年度間高代PC材料形態(tài)、光合參數(shù)、酶活性以及產(chǎn)量構(gòu)成因子的變化特點(diǎn)，并將各參數(shù)進(jìn)行聚類分析，以確定穩(wěn)定的篩選指標(biāo)，用于高代高光效水稻材料的利用。期望該研究可為篩選高效穩(wěn)定的高光效水稻材料提供參考，也可為今后解析其高光效差異的內(nèi)在機(jī)制提供新視角。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選取的PC高代材料最初由美國(guó)華盛頓州立大學(xué)古森本教授贈(zèng)送，該材料是通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米C4-pepc全基因的第3代水稻株系，獲得的水稻種子每年都在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因作物基地種植。在本研究中，選取2018—2019年種植的高代材料31個(gè)株系，每個(gè)株系都是上一年收集的單穗種子于次年種植獲得的植株。水稻種子分別于2019年、2020年的5月1日播種，在水泥池種植，每穴播1苗，每個(gè)單穗種植的材料作為1個(gè)株系，并編號(hào)、掛牌，常規(guī)水肥和病蟲草害管理，于7月底在植株開花后7～14 d，測(cè)定劍葉的光合參數(shù)，同步取樣，液氮保存，用于測(cè)定葉片的酶活性，成熟后單株收獲。

1.2 光合參數(shù)測(cè)定

參照王超等的方法[5]，使用美國(guó)LI-COR公司生產(chǎn)的LI-6400便攜式光合測(cè)定儀，開放式系統(tǒng)紅藍(lán)光源測(cè)定。晴天的08：30—11：30，室外溫度25～30 ℃，相對(duì)濕度70%～80%，測(cè)定水稻株系劍葉的凈光合速率（net photosynthetic rate，Pn），室外進(jìn)行，每個(gè)處理5～6次重復(fù)。

1.3 形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定

在開花后50 d收獲植株，每個(gè)株系在收獲時(shí)選取5株測(cè)定其形態(tài)指標(biāo)，包括株高、有效分蘗數(shù)和穗長(zhǎng)等。

1.4 葉片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性的測(cè)定

參照 Giglioli等的方法[10]測(cè)定PEPC的活性。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)將0.1 g水稻劍葉置于提前冷凍的研缽中研磨，加入1 mL粗酶提取緩沖液，在4 ℃下? 13 000 g 離心10 min，收集上清液（即粗酶液）。在酶活性測(cè)定的反應(yīng)體系（1 mL）中依次加入725 μL混合液，25 μL 5 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruate，PEP），150 μL粗酶液搖勻后，用紫外分光光度計(jì)（UV-1200型，上海美譜達(dá)儀器有限公司），記錄340 nm處吸光度的變化，計(jì)算酶活性。

1.5 產(chǎn)量構(gòu)成因子測(cè)定

在開花后40 d，每個(gè)株系選3株長(zhǎng)勢(shì)一致的供試材料單株收獲，自然晾曬至籽粒含水量小于14%時(shí)，在室內(nèi)進(jìn)行考種，并測(cè)定其產(chǎn)量構(gòu)成因子。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以及聚類分析，采用Microsoft excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高代PC株系劍葉PEPC酶活性的變化及其聚類分析

水稻生育后期劍葉的PEPC酶活性為水稻高光效特性的重要篩選指標(biāo)[4]。因此，本研究選取了高代PC 株系共31株，連續(xù)2年選取水稻株系的劍葉測(cè)定其PEPC酶活性，所有株系PEPC 酶活性為（1 723.72±1 139.14） nmol/（min·g），變異系數(shù)為0.66。并使用WARD 法對(duì)PEPC酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析 （度量標(biāo)準(zhǔn)為Euclidean 距離），以閾值 20 作為聚類標(biāo)準(zhǔn)，可將供試材料的類型量化細(xì)分為3類（表1）。其中類型Ⅰ為高PEPC酶活性類型，PEPC酶活性為4 982.70 nmol/（min·g），包括第2、22株系，占供試材料的 6.45%;類型Ⅱ?yàn)榈蚉EPC酶活性類型，PEPC酶活性為 841.98 nmol/（min·g），包括第13、14、16、17、19、20、24、26、27、28、31株系，占供試材料的35.48%;類型Ⅲ 為PEPC酶活性位于中間的材料類型，PEPC酶活性為1 900.44 nmol/（min·g），包括第1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、21、23、25、29、30株系，占供試材料的58.06%?？梢?，高代PC的PEPC酶活性的確存在一定的變異。

2.2 高代PC株系劍葉凈光合速率的變化及其聚類分析

連續(xù)2年同步測(cè)定對(duì)應(yīng)株系抽穗期，開花后 14 d 劍葉的凈光合速率（photosyntheticrate，Pn），2年所有株系的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差為（17.11±4.14） μmol/（m2·s），變異系數(shù)為0.24，將該參數(shù)經(jīng)過(guò)WARD法聚類分析（度量標(biāo)準(zhǔn)為Euclidean距離），以閾值8作為聚類標(biāo)準(zhǔn)，也可將供試材料的類型量化細(xì)分為3類。其中類型Ⅰ為高凈光合速率類型，包括第1、2、3、7、22、23株系，占供試材料的19.35%，凈光合速率平均值為 21.53 μmol/（m2·s）;類型Ⅱ?yàn)榈蛢艄夂纤俾暑愋?，包括?5、20、21、29、30株系，占供試材料的16.13%，凈光合速率的平均值為 14.65 μmol/（m2·s）;類型Ⅲ為凈光合速率位于中間的材料類型，包括第4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、24、25、26、27、28、31株系，占供試材料的64.52%，凈光合速率為 16.40 μmol/（m2·s），和酶活性的表現(xiàn)一樣也呈現(xiàn)正態(tài)分布（表2）。

2.3 高代PC株系產(chǎn)量構(gòu)成因子的變化及其聚類分析

連續(xù)2年在同期同步記錄了不同株系產(chǎn)量構(gòu)成因子的變化，其中2年的平均值分別為株高為（75.38±3.64） cm，變異系數(shù)為0.05;總分蘗數(shù)為（9.85±1.84）個(gè)，變異系數(shù)為0.19;有效分蘗數(shù)為（7.64±1.56）個(gè)，變異系數(shù)為0.20;千粒質(zhì)量為（21.88±0.58）g，變異系數(shù)為0.03;穗長(zhǎng)為（10.49±0.65） cm，變異系數(shù)為0.06;穗粒數(shù)為（28.32±4.05）個(gè)，變異系數(shù)為0.14;結(jié)實(shí)率為（72.21±6.85）%，變異系數(shù)為0.09;單株產(chǎn)量為（3.56±1.19） g，變異系數(shù)為0.33?？梢姡┰嚥牧细餍螒B(tài)指標(biāo)變異小于其單株產(chǎn)量，單株產(chǎn)量的變化主要與有效穗數(shù)和每穗粒數(shù)的變化密切相關(guān)。進(jìn)一步將這些數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)WARD法聚類分析（度量標(biāo)準(zhǔn)為Euclidean距離），以閾值12作為聚類標(biāo)準(zhǔn)，也可將供試材料的類型量化細(xì)分為3類。其中類型Ⅰ為高產(chǎn)類型，包括第4、5、7、13、16、17、21、22、30株系，占供試材料的29.03%;類型Ⅱ?yàn)榈彤a(chǎn)類型，包括第2、6、12、20、23、25、26、27、28、31株系，占供試材料的32.26%;類型Ⅲ為產(chǎn)量位于中間的材料類型，包括第1、3、8、9、10、11、14、15、18、19、24、29株系，占供試材料的38.71%（表3）。

2.4 PEPC酶活性、凈光合速率和產(chǎn)量指標(biāo)的聚類分析

進(jìn)一步將本研究中PC高代材料測(cè)定的3類指標(biāo)數(shù)據(jù)也經(jīng)過(guò)WARD法聚類分析（度量標(biāo)準(zhǔn)為Euclidean距離），以閾值15作為聚類標(biāo)準(zhǔn)，可將供試材料的類型量化細(xì)分為3類（表4）。其中類型Ⅰ為高PEPC酶活性，高凈光合速率和中產(chǎn)的材料類型，包括第1、2、3、7、22、23株系，占供試材料的19.35%;類型Ⅱ?yàn)榈蚉EPC酶活性，低凈光合速率和高產(chǎn)的材料類型，包括第13、14、16、17、19、20、24、26、27、28、31株系，占供試材料的35.48%;類型Ⅲ為中等光合能力的材料類型，包括第4、5、6、8、9、10、11、12、15、18、21、25、29、30株系，占供試材料的45.16%。從圖1可以看出，類型Ⅰ實(shí)際上還可以細(xì)分為2個(gè)小的亞型，Ⅰ-1包括1、3、7、23共4個(gè)株系，占供試材料的12.90%，這類型的PEPC活性[平均值2 747.19 nmol/（min· g）]和凈光合速率[平均值為21.49 μmol/（m2·s）]仍高于其他2個(gè)大類型（Ⅱ和Ⅲ），而且單株產(chǎn)量最高（平均值為4.18 g/株）;而Ⅰ-2，只包括2個(gè)株系（2和22），占比6.45%，這類型的PEPC酶活性最高[平均值 4 982.70 nmol/（min· g）]，凈光合速率與Ⅰ-2的類似，也較高[平均值為 21.60 μmol/（m2·s）]，但是產(chǎn)量則最低（平均值為2.87 g/株）。進(jìn)一步從各類參數(shù)的相關(guān)性分析可知，PC株系的Pn與PEPC酶活性的相關(guān)系數(shù)為0.808，呈極顯著相關(guān)（P<0.01），PEPC酶活性的發(fā)揮與光合能力密切相關(guān)，但是與單株產(chǎn)量相關(guān)性不顯著。

3 討論與結(jié)論

C4植物與C3植物的一個(gè)重要區(qū)別是C4植物的CO2補(bǔ)償點(diǎn)很低，所以C4植物在CO2含量低的情況下存活率更高，而且C4植物在高光強(qiáng)、高溫和干旱等條件下，比C3植物具有較高的CO2固定效率、水分利用率和籽粒產(chǎn)量[11]，其中C4植物光合作用的關(guān)鍵酶PEPC起關(guān)鍵作用。科學(xué)家已經(jīng)通過(guò)基因工程，將該基因引入C3植物如水稻中，該基因不僅在水稻中獲得高表達(dá)，而且表現(xiàn)高光效，并最終表現(xiàn)出籽粒產(chǎn)量提高[12-13]。與原種Kitaake相比，高表達(dá)轉(zhuǎn)玉米pepc基因水稻（PC）不僅表現(xiàn)出較強(qiáng)的光合能力和較高的籽粒產(chǎn)量，而且還在強(qiáng)光、高溫、干旱和低氮下均具有較高的凈光合速率和籽粒產(chǎn)量，并與高PEPC酶活性的誘導(dǎo)密切相關(guān)[8，14-18]，可以作為研究植物耐逆機(jī)制的有益資源。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶在 C4植物中起濃縮 CO2以提高光合效率的作用。王強(qiáng)等研究表明，兩優(yōu)培九超高產(chǎn)的重要原因，與其較高的光能和CO2利用效率、較強(qiáng)的抗光抑制能力以及較高的 C4途徑酶PEPC的表達(dá)水平相關(guān)[19]。研究表明，PEPC酶在不同生育期、不同部位以及不同光強(qiáng)條件下的表達(dá)特征曲線與光合速率具有密切關(guān)系，特別在產(chǎn)量形成的關(guān)鍵時(shí)期，外源PEPC基因高水平表達(dá)與凈光合速率的高值出現(xiàn)期表現(xiàn)一致，而且相對(duì)穩(wěn)定，此時(shí)測(cè)定的劍葉PEPC活性可作為水稻高光合速率的可靠分子育種指標(biāo)，這為水稻高光效特性鑒定和篩選提供了依據(jù)，并能為作物高光效機(jī)制的研究提供有用的材料[4]。本研究利用相關(guān)的篩選指標(biāo)，檢測(cè)了年度間高代的31株系PC水稻的高光效特性和產(chǎn)量表現(xiàn)。結(jié)果表明，PC的高代材料在PEPC酶活性的發(fā)揮、凈光合速率以及產(chǎn)量構(gòu)成因子等指標(biāo)上的確存在年度間和株系間的變化，其中變異系數(shù)產(chǎn)量構(gòu)成因子<凈光合速率

磷酸烯醇丙酮酸羧化酶包括植物型PEPC（plant-type phosphoenolpyruvate carboxylase，PTPC）和細(xì)菌型PEPC（bacterial-type phosphoenolpyruvate carboxylase，BTPC）等多基因家族。BTPC和PTPC相互作用，形成2類異性寡聚多肽復(fù)合物[20]，在蓖麻（Ricinus communis）種子發(fā)育中發(fā)揮重要作用。因此，它的功能很多樣，而且PEPC酶和基因的調(diào)節(jié)也很復(fù)雜。前期研究表明，與WT相比，PC材料在高光強(qiáng)[14]、高溫[15]、干旱[7]以及低氮條件[17]下均表現(xiàn)出較好的耐性，而且這些優(yōu)異的特性與PEPC酶活性的發(fā)揮以及C4-pepc基因的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。信號(hào)分子H2O2[6]、NO[21]、Ca2+[7]、磷脂酸[22]、 ATP[23] 以及糖分子[24-25]均參與其基因的表達(dá)。本研究還觀察到PC水稻在響應(yīng)干旱逆境時(shí)C4-pepc有去甲基化現(xiàn)象發(fā)生，有利于C4-pepc的高表達(dá)，也伴隨著PEPC的磷酸化以及相關(guān)基因的表達(dá)，顯示了表觀遺傳機(jī)制可能也參與該材料干旱的響應(yīng)機(jī)制[8]。因此，深入研究PC不同株系PEPC酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制，是獲得穩(wěn)定高光效材料的重要理論基礎(chǔ)，將有助于揭示其基因表達(dá)差異的內(nèi)在原因。

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