駱 佳，徐金瑞，李 武，王玉炯*

(1.西部特色資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021；2.寧夏大學生命科學學院，銀川 750021)

結(jié)核病(tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)感染引起的慢性呼吸道傳染病，所造成的死亡是全球十大致死原因之一。巨噬細胞作為Mtb的主要宿主細胞和免疫細胞，通過調(diào)節(jié)自身死亡方式(凋亡、壞死、焦亡和自噬)決定Mtb感染的最終轉(zhuǎn)歸[1]。細胞凋亡促進胞內(nèi)菌的清除，細胞壞死則加速胞內(nèi)滯留菌的擴散，而自噬決定著胞內(nèi)菌的命運(清除或滯留)[2]。

Mtb感染導致巨噬細胞代謝進程變化，致使脂滴和細胞器脂質(zhì)聚集在胞質(zhì)中而形成泡沫巨噬細胞(foamy macrophage)[3]。三酰甘油、膽固醇和脂肪酸是泡沫巨噬細胞中的主要脂質(zhì)成分，Mtb通過利用這些脂質(zhì)為其自身提供能源物質(zhì)從而維持在巨噬細胞中的復制和存活[4-5]。Mtb感染促進肺泡巨噬細胞脂肪酸氧化(fatty acid oxidation, FAO)，干預巨噬細胞脂肪酸氧化，抑制Mtb在巨噬細胞中繁殖[6]。此外，炎性介質(zhì)的產(chǎn)生也與脂肪酸代謝有著密切的聯(lián)系[7]。然而，Mtb感染過程中，F(xiàn)AO對巨噬細胞自噬以及促炎因子表達的調(diào)控作用還尚不明確。本研究采用牛分枝桿菌疫苗株卡介苗(bacillus Calmette-guérin, BCG)感染小鼠巨噬細胞RAW264.7，用乙莫克舍[8](etomoxir, Eto)抑制FAO，通過檢測自噬相關(guān)蛋白表達、自噬小體聚集、自噬流以及促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達情況，揭示BCG感染巨噬細胞過程中，F(xiàn)AO途徑對巨噬細胞自噬和炎性反應(yīng)的調(diào)控作用，為基于代謝途徑的結(jié)核病免疫機制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院細胞庫；胎牛血清、DMEM-High Glucose購自Gibco公司；細胞總RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；TransSciptAll-in One SuperMix for qPCR、PerfectStartGreen q-PCR SuperMix試劑盒購自全式金公司；兔抗LC3、Beclin1、CPT-1A和GAPDH抗體購自Cell Signal Technology(CST)；兔抗Rab7抗體和游離脂肪酸定量試劑盒(free fatty acid quantification assay kit)購自Abcam公司；熒光素偶聯(lián)山羊抗兔IgG和BODIPY-488購自Invitrogen 公司；乙莫克舍(Etomoxir, Eto)購自MedChemExpress公司；mRFP-GFP-LC3熒光雙標腺病毒購自漢恒生物科技有限公司；小鼠IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA試劑盒購自博士德生物工程有限公司；相關(guān)引物由生工生物工程有限公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7細胞。培養(yǎng)細胞至對數(shù)生長期，用于后繼試驗。

1.3 BCG培養(yǎng)

牛結(jié)核分枝桿菌疫苗株BCG培養(yǎng)于添加Tween-80(0.5%)和增菌劑(OADC)的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)至菌液OD600 nm=1.5后進行傳代培養(yǎng)。

1.4 試驗分組設(shè)計

試驗共分3組，分別為對照組(Ctrl)、BCG感染組和Eto與BCG共處理組(Eto+BCG)。Ctrl組為不經(jīng)任何處理正常狀態(tài)下的RAW264.7細胞；BCG組用感染復數(shù)為(multiplicity of infection, MOI)10的BCG培養(yǎng)物感染細胞6 h；Eto+BCG組用Eto預處理RAW264.7細胞2 h后，用MOI=10的BCG培養(yǎng)物感染細胞6 h。

1.5 Western blot檢測

Eto預處理RAW264.7細胞2 h后，用MOI=10的BCG培養(yǎng)物感染細胞6 h，提取細胞總蛋白，BCA定量后進行SDS-PAGE凝膠電泳。PVDF膜轉(zhuǎn)印后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，過夜孵育 CPT-1A(1∶1 000)、Beclin1(1∶1 000)、LC3-II(1∶1 000)以及Rab7(1∶1 000)抗體，次日TBST(Tween-20含量0.3%)洗膜6次(5 min·次-1)，二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜6次后，化學發(fā)光檢測蛋白表達水平。

1.6 游離脂肪酸定量試驗

用MOI=10的BCG懸液感染RAW264.7細胞6 h后收集細胞，用含1% Triton X-100的氯仿充分裂解細胞，13 000×g離心10 min，去除不可溶物質(zhì)并收集有機相。將收集的有機相置于50 ℃烘箱中至氯仿去除后，真空干燥30 min，從而提取細胞中游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)。所提取的FFA根據(jù)說明書進行定量并與細胞蛋白含量進行歸一化處理。

1.7 BODIPY檢測脂滴

以3×105cell·mL-1細胞量接種于放有蓋玻片的12孔板中，MOI=10的BCG懸液感染RAW264.7細胞6 h后，PBS漂洗細胞3次(5 min·次-1)，4%多聚甲醛固定20 min，BODIPY 染色15 min, PBS漂洗3次(5 min·次-1)，用含DAPI封片劑封片。

1.8 免疫熒光檢測自噬小體

以3×105cell·mL-1的細胞量接種于放有蓋玻片的12孔板中，Eto預處理RAW264.7細胞2 h后，用MOI=10的BCG培養(yǎng)物感染細胞6 h，PBS漂洗感染后的細胞3次(5 min·次-1)，4%多聚甲醛固定20 min，Triton X-100室溫通透20 min，5% 山羊血清室溫封閉30 min，LC3抗體(1∶200)37 ℃孵育2 h，熒光二抗(1∶1 000)37 ℃孵育30 min。用含DAPI的封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞中自噬小體聚集情況。

1.9 自噬流檢測

將對數(shù)生長期的RAW264.7細胞以2×105cell·mL-1細胞量接種于放置有蓋玻片的12孔板中，過夜培養(yǎng)。mRFP-GFP-LC3熒光雙標腺病毒以感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)50感染6 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。Eto預處理2 h，BCG(MOI=10)感染6 h，PBS漂洗3次(5 min·次-1)，4%多聚甲醛固定20 min，抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞中mRFP-LC3和mRFP-GFP-LC3點狀聚集。

1.10 qRT-PCR檢測IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達

Eto預處理RAW264.7細胞2 h后，用MOI=10的BCG培養(yǎng)物感染細胞6 h，用細胞總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，并根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取到的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA作為模板進行qRT-PCR操作。qRT-PCR試驗數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法分析各試驗組中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的相對表達水平。鼠IL-1β、IL-6、TNF-α及GAPDH上下游引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.11 ELISA檢測IL-1β、IL-6和TNF-α含量

Eto預處理RAW264.7細胞2 h后，用MOI=10的BCG培養(yǎng)物感染細胞6 h，收集細胞培養(yǎng)上清，1 000 r·min-1離心20 min，用小鼠IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒檢測上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.12 胞內(nèi)菌存留試驗

Eto預處理RAW264.7細胞2 h后，用MOI=10的BCG培養(yǎng)物感染細胞2 h，PBS漂洗細胞3次清除胞外菌，繼續(xù)培養(yǎng)細胞6 h，0.5% Triton X-100 裂解細胞；待巨噬細胞全部裂解后，將裂解產(chǎn)物10倍稀釋并均勻涂布在含有OADC的Middlebrook7H10 瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3周后，進行菌落計數(shù)。

1.13 統(tǒng)計學分析

所有試驗數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次獨立試驗的驗證，試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0中T-test或One Way ANOVA進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤(x±sx)表示。

2 結(jié) 果

2.1 BCG感染促進RAW264.7細胞脂肪酸氧化

BODIPY標記脂質(zhì)檢測BCG感染前后細胞中脂滴含量，結(jié)果顯示：BCG感染引起RAW264.7細胞中脂滴積累(圖1A、B)，而游離脂肪酸含量顯著下調(diào)(P<0.05)(圖1C)；且BCG感染促進了肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A, CPT-1A)表達(圖1D)，并在BCG感染4 h 時其表達量達到最高。

A、B.BODIPY標記脂質(zhì)，激光共聚焦觀察BCG感染前后RAW264.7細胞脂滴聚集情況，BODIPY為綠色，DAPI為藍色；C.吸光光度法檢測BCG感染前后，RAW264.7細胞細胞中游離脂肪酸含量; D.Western blot檢測BCG感染不同時間點CPT-1A表達水平。*.P<0.05，**.P<0.01

2.2 抑制BCG誘導RAW264.7細胞FAO抑制RAW264.7細胞中BCG存留量

CFU試驗檢測Eto預處理后，BCG感染的RAW264.7細胞中BCG存活量。結(jié)果顯示：Eto預處理后的細胞中BCG存留量較BCG組顯著減少(圖2)(P<0.01)。說明抑制BCG誘導RAW264.7細胞FAO抑制RAW264.7細胞中BCG存活。

**.P<0.01

2.3 BCG誘導RAW264.7細胞FAO參與調(diào)控細胞自噬

Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ以及溶酶體蛋白Rab7表達變化。結(jié)果顯示，BCG感染促進了Beclin1、LC3-Ⅱ和 Rab7的表達；Eto預處理進一步上調(diào)Beclin1、LC3-Ⅱ和Rab7的表達，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖3A～D)。激光共聚焦結(jié)果也顯示，與BCG組相比，Eto預處理后的細胞中聚集大量自噬小體(圖4A、B)。

Eto預處理2 h，BCG感染RAW264.7細胞6 h后，Western blot檢測Beclin1、LC3-Ⅱ和Rab7表達水平。*.P<0.05，**.P<0.01

A.激光共聚焦觀察細胞中自噬小體的聚集情況，LC3-Ⅱ為綠色，DAPI為藍色; B.每個細胞中自噬小體含量定量結(jié)果。**.P<0.01

2.4 抑制BCG誘導RAW264.7細胞FAO促進自噬流

激光共聚焦檢測Eto預處理后，BCG感染的RAW264.7細胞中自噬體(mRFP-GFP-LC3)和自噬溶酶體(mRFP-LC3)聚集情況。結(jié)果顯示：BCG感染的RAW264.7細胞中出現(xiàn)自噬體mRFP-GFP-LC3和自噬溶酶體mRFP-LC3點狀聚集，且經(jīng)Eto處理后，RAW264.7細胞中自噬體和自噬溶酶體含量均出現(xiàn)顯著上調(diào)(P<0.05，圖5)。說明抑制BCG誘導RAW264.7細胞FAO途徑促進了自噬流發(fā)生。

*.P<0.05，**.P<0.01

2.5 抑制BCG誘導RAW264.7細胞FAO下調(diào)IL-1β、IL-6和TNF-α表達

qRT-PCR檢測促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達情況。結(jié)果顯示，Eto預處理抑制BCG感染引起的IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表達(圖6A～C)，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。為了進一步探究BCG誘導RAW264.7細胞FAO對促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達的影響，收集細胞培養(yǎng)上清，用ELISA方法檢測上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量，試驗結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，即Eto預處理后，上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量較BCG感染組顯著下調(diào)(P<0.05,圖6D～F)。

A、B、C.Eto預處理2 h，BCG感染RAW264.7細胞6 h后，qRT-PCR檢測促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表達水平；D、E、F.Eto預處理2 h，BCG感染RAW264.7細胞6 h后，收集細胞培養(yǎng)上清，ELISA 檢測細胞培養(yǎng)上清中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量。*.P<0.05，**.P<0.01

3 討 論

早期研究顯示，Mtb利用宿主細胞脂肪酸作為碳源維持其在胞內(nèi)生長繁殖[9-12]。Podinovskaia等[13]應(yīng)用熒光脂肪酸轉(zhuǎn)運試驗觀察到細胞中Mtb內(nèi)存在宿主細胞來源的脂肪酸，說明Mtb攝取并利用了宿主脂肪酸[14]。在巨噬細胞、小鼠以及人肺組織Mtb感染模型中，參與脂肪酸利用相關(guān)基因表達上調(diào)[15-17]。本研究用BODIPY染色標記脂滴，發(fā)現(xiàn)BCG感染的RAW264.7細胞中出現(xiàn)大量脂滴聚集，而細胞中游離脂肪酸含量減少，且參與FAO的關(guān)鍵酶——CPT-1A表達上調(diào)。此結(jié)果說明：BCG感染促進了巨噬細胞FAO。

Mtb感染導致的巨噬細胞代謝變化將影響吞噬體與溶酶體的融合[18-19]，從而為Mtb在宿主細胞中長期滯留提供了良好的條件。由此可見，改變Mtb與巨噬細胞代謝間的平衡機制可抑制胞內(nèi)病原菌存活[20]。肉芽腫是結(jié)核病的主要病理特征，感染了Mtb的巨噬細胞在其胞漿區(qū)域積聚脂質(zhì)，并分化形成泡沫巨噬細胞[21-22]，構(gòu)成了肉芽腫主要成分之一。泡沫巨噬細胞在Mtb感染擴散中發(fā)揮著重要作用。因此，調(diào)控巨噬細胞脂代謝進程可以控制結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展。目前，基于宿主細胞代謝的宿主導向治療(host-directed therapy, HDT)方法在人結(jié)核病的治療中，尤其在感染多重耐藥結(jié)核分枝桿菌患者的治療中取得了顯著效果[23-24]。自噬作為一種溶酶體清除機制，在調(diào)控巨噬細胞對Mtb的清除中發(fā)揮著重要的作用[25]。多種因素調(diào)控細胞自噬，代謝途徑改變所導致的能量變化則是其中因素之一[26-28]。FAO作為細胞供能方式之一，其變化也將影響巨噬細胞自噬清除作用。CPT-1A通過介導長鏈脂肪酸進入線粒體，進而進行FAO。Eto通過與CPT-1A結(jié)合，進而抑制FAO的進行[29]。為探究BCG誘導的RAW264.7細胞FAO對細胞自噬和促炎因子的表達調(diào)控作用，本研究用Eto抑制FAO并檢測BCG感染后自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-II以及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達情況，結(jié)果顯示,Beclin1和LC3-II的表達均顯著上調(diào)，且細胞中出現(xiàn)大量自噬小體；而IL-1β、IL-6和TNF-α的表達卻受到抑制。Rab7是自噬體與溶酶體融合進程中重要調(diào)節(jié)分子之一[30]，參與調(diào)控自噬溶酶體的成熟過程，敲除Rab7將導致自噬小體聚集[31]。結(jié)果顯示，Eto預處理不僅上調(diào)了自噬相關(guān)蛋白的表達，同時促進了Rab7的表達，說明抑制FAO可以促進自噬小體和溶酶體融合，并且自噬流檢測結(jié)果也進一步顯示干預FAO后，細胞中自噬溶酶體數(shù)量增多，胞內(nèi)存留BCG也顯著下調(diào)。由此可見，BCG誘導FAO參與調(diào)控巨噬細胞自噬，抑制FAO可以激活RAW264.7自噬途徑清除細胞中滯留的病原菌，并且可以防止因為過度炎性反應(yīng)所致的炎性損傷。然而，F(xiàn)AO調(diào)控巨噬細胞自噬的具體機制將是本課題接下來要探究的問題。

4 結(jié) 論

BCG感染促進RAW264.7細胞FAO，且此代謝途徑參與調(diào)控RAW264.7細胞自噬：抑制BCG誘導的RAW264.7細胞FAO促進了細胞自噬從而抑制胞內(nèi)菌的存活，且抑制了促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達和分泌。說明FAO途徑在巨噬細胞抗結(jié)核分枝桿菌感染中發(fā)揮著雙重調(diào)控作用。