禹小波，鐘勝男，胡 燁，農(nóng) 向※

(1.竹類病蟲防控與資源開(kāi)發(fā)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(樂(lè)山師范學(xué)院)，四川 樂(lè)山 614000；2.樂(lè)山師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂(lè)山 614000)

0 引言

竹燕窩，學(xué)名海綿膠煤炱菌(Scoriasspongiosa)，因其味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是一種高檔的可食用真菌[1]。竹燕窩除了營(yíng)養(yǎng)豐富，還具有抗氧化性[2]、抑菌和抗癌等效果[3-5]，因而具有較大的市場(chǎng)潛力。但由于其生長(zhǎng)環(huán)境較為苛刻，目前市場(chǎng)上供應(yīng)的竹燕窩僅靠野生采集,尚無(wú)人工培育成功的報(bào)道。之前的研究表明，海綿膠煤炱菌在PDA培養(yǎng)基(PotatoDextroseAgarMediam)可以生長(zhǎng)且易產(chǎn)生分生孢子，但并不能形成大型的子實(shí)體[6]。因此，利用PDA培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)雖不具有實(shí)用價(jià)值，但卻為研究竹燕窩的生長(zhǎng)發(fā)育提供了一個(gè)很好的契機(jī)。

海綿膠煤炱菌在分類地位上屬于子囊菌門，盤菌亞門，座囊菌亞門，座囊菌綱，煤炱菌目，煤炱菌科，膠煤炱菌屬。第一份海綿膠煤炱菌標(biāo)本于1832年被收集并鑒定，編號(hào)為Carolina 1311[7]。但之后，國(guó)內(nèi)外有關(guān)該菌的研究較少。 研究真菌的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，特別是各種細(xì)胞類型的分化和細(xì)胞命運(yùn)特化的過(guò)程，對(duì)于發(fā)育生物學(xué)而言具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值，同時(shí)也對(duì)于認(rèn)識(shí)其野生條件下的生長(zhǎng)規(guī)律及人工培育系統(tǒng)的建立有著重要的借鑒意義。本研究通過(guò)對(duì)樂(lè)山地區(qū)的竹燕窩進(jìn)行采集和菌種分離后，利用PDA培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行純培養(yǎng)。通過(guò)對(duì)竹燕窩各個(gè)發(fā)育階段的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了詳細(xì)的細(xì)胞學(xué)觀察，為后續(xù)竹燕窩的生長(zhǎng)機(jī)制研究和人工培育系統(tǒng)的建立提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

菌種分離的竹燕窩樣品來(lái)源采樣地點(diǎn)：樂(lè)山師范學(xué)院校內(nèi)竹林和樂(lè)山市萊茵水岸小區(qū)竹林。采樣時(shí)間。2019年11月。

1.1.2 主要試劑

PDA固體培養(yǎng)基，PDA液體培養(yǎng)基，無(wú)菌蒸餾水，50%甘油。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

Leica DM500光學(xué)顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，高溫高壓滅菌鍋，-80 ℃超低溫冰箱，超凈臺(tái)，研缽，鑷子，載玻片，錐形瓶，牙簽，EP管等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 竹燕窩菌種分離與保存

將野外采集的竹燕窩在超凈臺(tái)上使用無(wú)菌水沖洗3次，然后再放入無(wú)菌的研缽中研磨粉碎，無(wú)菌水重懸，梯度稀釋于PDA培養(yǎng)基上，置于24 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(圖1B-D)。將遠(yuǎn)離細(xì)菌污染的竹燕窩單菌落轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)至產(chǎn)生分生孢子。使用無(wú)菌牙簽挑取分生孢子，保存至50%甘油中，-80℃保存。

1.2.2 竹燕窩不同發(fā)育時(shí)期的光學(xué)顯微鏡觀察

對(duì)分離的分生孢子使用固體/液體PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔12 h取樣進(jìn)行鏡檢觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹燕窩的生活環(huán)境：竹—蚜—菌三者的共生關(guān)系

竹燕窩僅出現(xiàn)在被居竹偽角蚜感染的竹林中，竹燕窩、竹林和蚜蟲三者形成了獨(dú)特的植物-昆蟲-真菌的共生關(guān)系。其中，居竹偽角蚜(PseudoregmaBambusicola)是一種傾向于感染新生竹的蚜蟲。與很多其他昆蟲一樣，居竹偽角蚜在吸取竹子營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，也會(huì)分泌富含糖分的蜜露并導(dǎo)致竹子感染煤污病。這種煤污病的病原菌即是海綿膠煤炱菌。在條件適宜的情況下，煤污病會(huì)形成大型的真菌子實(shí)體即竹燕窩。雖然很多煤炱科的真菌都會(huì)導(dǎo)致煤污病，但在煤炱科中只有海綿膠炱菌能夠形成大型的真菌子實(shí)體，也是目前報(bào)道的該科中唯一可食用的真菌，因而備受關(guān)注。

2.2 竹燕窩的菌種分離和形態(tài)觀察

野生的生長(zhǎng)狀態(tài)良好的竹燕窩呈金黃色珊瑚狀分支，富有彈性；衰老黑化的部分則呈黑煤塊狀，不具彈性(圖1A)。使用研磨粉碎的竹燕窩子實(shí)體在PDA培養(yǎng)基上24℃培養(yǎng)則會(huì)長(zhǎng)出晶瑩剔透的竹燕窩組織團(tuán)(圖1D)，與野外新生的竹燕窩顏色相同。竹燕窩生長(zhǎng)過(guò)程的顏色變化規(guī)律為：無(wú)色透明—淺黃色—金黃色—暗黑色—黑色。

A.竹燕窩取樣；B.竹燕窩新生部分子實(shí)體； C.研磨粉碎的竹燕窩子實(shí)體；D.PDA培養(yǎng)基 生長(zhǎng)出的竹燕窩組織團(tuán)圖1 竹燕窩菌種分離過(guò)程Fig.1 Isolation of Scorias spongiosa strain

A.竹燕窩組織塊，顯示菌絲體；B.竹燕窩組織塊 開(kāi)始形成珊瑚狀子實(shí)體；C.竹燕窩形成大量的珊 瑚狀子實(shí)體；D.竹燕窩子實(shí)體形成分生孢子球， 標(biāo)尺=100 μm。圖2 竹燕窩組織塊形態(tài)觀察Fig.2 Morphological Observation of Scorias Spongiosa Tissues

在顯微鏡下觀察PDA培養(yǎng)基上的竹燕窩，發(fā)現(xiàn)其向四周輻射生長(zhǎng)出菌絲體，而中間的組織團(tuán)則類似植物的愈傷組織(圖2A)。在PDA培養(yǎng)基上，竹燕窩的菌絲體并不發(fā)達(dá)，只能局限在組織塊周圍，形成少量的菌絲(圖2A)。組織塊可以快速生長(zhǎng)并在其表面產(chǎn)生突起，最終發(fā)育成為珊瑚狀子實(shí)體(圖2B和圖2C)。在PDA培養(yǎng)基上，這些珊瑚狀突起最終會(huì)分化形成分生孢子器，成熟的分生孢子器會(huì)在其頂端形成透明的分生孢子球(圖3D)。

A.竹燕窩分生孢子，標(biāo)尺=20 μm; B.萌發(fā)的分生孢子，標(biāo)尺=20 μm；C.由單個(gè)分生孢子發(fā)育而來(lái)的菌絲體，標(biāo)尺=100 μm；D.竹燕窩菌絲體在中央開(kāi)始形成細(xì)胞團(tuán)，標(biāo)尺=20 μm；E.竹燕窩細(xì)胞團(tuán)變大，并開(kāi)始分泌膠質(zhì)物質(zhì)，標(biāo)尺=20 μm；F.竹燕窩菌絲體形成管狀細(xì)胞，標(biāo)尺=20 μm；G-I.菌絲體形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺=20 μm；J-L.竹燕窩菌絲體分化出束狀細(xì)胞，標(biāo)尺=20 μm。

2.3竹燕窩營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞學(xué)特性

由于固體PDA培養(yǎng)基上的竹燕窩會(huì)產(chǎn)生大量的膠質(zhì)，不易于觀察其生長(zhǎng)發(fā)育的規(guī)律，我們將其接種到PDA液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)觀察，以減少竹燕窩膠質(zhì)帶來(lái)的干擾。在分生孢子球上的分生孢子呈卵形或橢圓形，無(wú)色透明，單細(xì)胞(圖3A)。接種到液體PDA培養(yǎng)基中12 h后，分生孢子的體積迅速膨大并萌發(fā)產(chǎn)生菌絲，菌絲呈頂端生長(zhǎng)，含中央大液泡(圖3B)。分裂數(shù)次后的分生孢子最終會(huì)形成具有分支的竹燕窩菌絲體，分支的位置一般位于菌絲體的中央部位，而新分裂的細(xì)胞則一般不會(huì)形成分支(圖3C)。繼續(xù)培養(yǎng)觀察后發(fā)現(xiàn)，菌絲體傾向于圍繞中央，以盤繞螺旋的方式生長(zhǎng)并形成致密的細(xì)胞團(tuán)，即子實(shí)體原基(圖3D)。細(xì)胞團(tuán)原基會(huì)迅速擴(kuò)大并開(kāi)始積累膠質(zhì)物質(zhì)，使組織團(tuán)呈現(xiàn)淡黃色(圖3E)。與此同時(shí)，原基周圍的菌絲體會(huì)隨機(jī)形成致密的細(xì)胞突起(圖3F)并最終和其他菌絲體細(xì)胞融合交聯(lián)，形成環(huán)形的菌絲體(圖3G和圖3H)。菌絲體環(huán)的交聯(lián)節(jié)點(diǎn)可以為一個(gè)或者數(shù)個(gè)(圖3I)。之后，竹燕窩子實(shí)體的部分細(xì)胞開(kāi)始分化形成菌絲盤繞的束狀細(xì)胞，并最終發(fā)育成為珊瑚狀子實(shí)體。束狀細(xì)胞的下部為疏松細(xì)胞，體積較大(圖3J)，中部為網(wǎng)狀菌絲體(圖3K)，上部則為菌絲體盤繞的束狀細(xì)胞群(圖3L)。

2.4 竹燕窩生殖生長(zhǎng)的細(xì)胞學(xué)特性

竹燕窩營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的子實(shí)體呈典型的珊瑚狀(圖4A)。在PDA培養(yǎng)基上，子實(shí)體會(huì)逐漸分化形成分生孢子器，并產(chǎn)生分生孢子球(圖4B)。分生孢子球呈白色，具黏性，易從分生孢子梗上脫落(圖4C和圖4D)。竹燕窩的分生孢子器具長(zhǎng)梗，底部呈燒瓶狀，向頂端逐漸縮小(圖4E)。分生孢子由分生孢子器底部的菌絲產(chǎn)生(圖4F)。中間的分生孢子梗由螺旋卷曲的菌絲組成，平行排列，顏色深褐色或黑色，其功能為運(yùn)輸分生孢子(圖4G)。分生孢子器頂端由無(wú)色透明的菌絲體組成，具開(kāi)孔，分生孢子器未成熟時(shí)關(guān)閉，成熟時(shí)張開(kāi)，釋放分生孢子(圖4H)。

A.竹燕窩的珊瑚狀子實(shí)體，標(biāo)尺=500 μm;B.成熟的分生孢子球，標(biāo)尺=200 μm；C.分生孢子球脫落到培養(yǎng)基表面，標(biāo)尺=100 μm；D.脫落了分生孢子球的分生孢子器，標(biāo)尺=200 μm；E.未成熟的分生孢子器整體結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺=100 μm；F.分生孢子器底部菌絲體，標(biāo)尺=20 μm；G.分生孢子梗菌絲體，標(biāo)尺=20 μm；H.分生孢子器頂端無(wú)色菌絲體，標(biāo)尺=20 μm

3 結(jié)論與討論

本文通過(guò)對(duì)樂(lè)山地區(qū)的竹燕窩進(jìn)行菌種分離并利用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純培養(yǎng)，對(duì)其不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞進(jìn)行觀察分析表明，竹燕窩的生活史為分生孢子—菌絲體—膠質(zhì)菌絲體—分生孢子器—分生孢子，整個(gè)生活史周期中只有無(wú)性的生殖過(guò)程，未見(jiàn)有性生殖過(guò)程。

竹燕窩的分生孢子萌發(fā)過(guò)程類似頂端生長(zhǎng)過(guò)程，這一規(guī)律與其他絲狀真菌的生長(zhǎng)規(guī)律一致[8]。竹燕窩的菌絲體傾向于在細(xì)胞中部位置螺旋盤繞生長(zhǎng)形成子實(shí)體原基。在這個(gè)過(guò)程中，菌絲體之間通過(guò)相互融合，形成復(fù)雜的菌絲體網(wǎng)絡(luò)，這一過(guò)程可能是竹燕窩可以形成大型的膠質(zhì)子實(shí)體是根本原因。值得注意的是，這個(gè)過(guò)程中菌絲體中部盤繞形成以及交聯(lián)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞學(xué)過(guò)程是研究細(xì)胞融合的良好材料。

在竹燕窩的子實(shí)體生長(zhǎng)過(guò)程中，菌絲體會(huì)分泌產(chǎn)生大量的膠質(zhì)物質(zhì)，這些物質(zhì)可能有助于菌絲體原基的聚集或生長(zhǎng)，但具體功能還有待進(jìn)一步探究。由于竹燕窩的主要營(yíng)養(yǎng)成分、抗氧化物質(zhì)和抗癌物質(zhì)都來(lái)源于膠質(zhì)[3-4，9-10]，竹燕窩的膠質(zhì)分泌的影響因子研究和分泌機(jī)制對(duì)于提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值十分重要。有研究表明，使用Tween80和氯仿刺激可以增加其胞外多糖含量的分泌[11]，但由于這些物質(zhì)為有毒物質(zhì)，因此無(wú)法應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。

在竹燕窩的生殖生長(zhǎng)過(guò)程中，束狀菌絲的形成對(duì)于產(chǎn)生分生孢子器是必須的。束狀菌絲生長(zhǎng)快速，這為細(xì)胞學(xué)過(guò)程為竹燕窩可以形成大量的珊瑚狀分枝提供了細(xì)胞學(xué)依據(jù)。有趣的是，并不是所有的束狀菌絲都會(huì)直接分化產(chǎn)生分生孢子器，部分的束狀菌絲產(chǎn)生的珊瑚狀分支可以形成二級(jí)或三級(jí)分支，在野外條件下，這種分支結(jié)構(gòu)使得竹燕窩可以形成獨(dú)特的大型珊瑚狀子實(shí)體。在實(shí)驗(yàn)條件下不能產(chǎn)生大型子實(shí)體可能是由于在PDA培養(yǎng)基上不具備野外的調(diào)控因子。

綜上表明，本研究對(duì)樂(lè)山地區(qū)的竹燕窩生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞學(xué)進(jìn)行了較為詳細(xì)的觀察，對(duì)于竹燕窩生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制研究及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用野生竹燕窩資源和人工培育系統(tǒng)的建立提供了一定的理論依據(jù)。