許 雋，胡 浩，曾 艷，曾 奧，賀月林，唐少軍，楊 祎，雷 平

(湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009)

鎘(Cd)具有高毒害性和難降解性，是水稻生長發(fā)育的非必需元素，但可以在水稻植株內(nèi)富集，并通過食物鏈危害人畜健康[1-2]。隨著環(huán)境污染的加重，大米鎘超標(biāo)情況日益嚴峻，因此減少水稻對鎘的吸收與轉(zhuǎn)運，進而降低稻米中鎘的積累具有重要的現(xiàn)實意義[3-4]。

菌根是指土壤中某些真菌與植物根系形成的共生體，陸地上80%以上的植物根系可以與菌根真菌形成共生體[5]。叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)是一種主要的內(nèi)生菌根真菌，因AMF菌絲能與宿主植物根細胞形成叢枝-泡囊的特殊結(jié)構(gòu)而得名。AMF不但能提高宿主植物應(yīng)對干旱、高溫等非生物脅迫的能力[6-8]，還能夠提高宿主植物對土壤中鋅、銅、鐵等微量元素的吸收能力[9-12]。在重金屬脅迫下，AMF通過促進宿主對養(yǎng)分的吸收、增強根系對重金屬的固定能力、提高抗氧化酶活性等途徑減輕重金屬對宿主植物的毒害[13]。已有研究報道，在盆栽土壤中接種AMF能使水稻株高、總生物量、根系總表面積及產(chǎn)量分別提高20.6%，30.0%，36.6%和45.3%，減少47%的化肥施用量[14]；并且AMF接種和化肥共施能夠改善稻谷的外觀品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)，并保證稻米中鐵和鋅的質(zhì)量分數(shù)[15]；接種AMF能夠顯著減輕鎘脅迫對水稻生長的抑制作用，在不同鎘處理條件下添加AMF能夠顯著增加水稻生物量[16]。摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae,FM)原名摩西球囊霉(Glomusmosseae,GM)，根內(nèi)根孢囊霉(Rhizophagusirregularis,RI)原名根內(nèi)球囊霉(Glomusintraradice,GI)，這2種AMF廣泛分布在許多類型土壤中，對宿主植物具有廣譜性，容易侵染植物根系[17]，且都具有將鎘固定在水稻根系減少其向上運輸?shù)淖饔肹18]。在高濃度鎘脅迫下，添加FM和RI能夠使水稻葉片丙二醛含量顯著降低，超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量顯著提高[19]。FM和RI對水稻具有較強的侵染能力，RI對水稻品種廣銀占、旱稻502的侵染率分別為35.83%和52.08%[20]；FM、RI對水稻品種金優(yōu)64的侵染率分別為86.99%和74.13%[21]。FM、RI對8個粳稻品種、11個秈稻品種和1個野生稻品種侵染能力的研究表明，秈稻品種較粳稻品種更容易被侵染[22]。

目前關(guān)于AMF對水稻秧苗能否有效侵染以及是否具有抗逆促生作用的報道還比較少，而水稻秧苗期是營養(yǎng)器官形成的關(guān)鍵時期，秧苗質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響到大田水稻植株的返青、分蘗以及產(chǎn)量形成[23]。為此，本試驗分析了無鎘脅迫和有鎘脅迫下FM、RI對水稻秧苗生長發(fā)育、鎘吸收及轉(zhuǎn)運能力的影響，以期為運用AMF菌根技術(shù)提高鎘脅迫水稻植株的生長發(fā)育與產(chǎn)量提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

摩西斗管囊霉和根內(nèi)根孢囊霉由湖南省微生物研究院菌種保藏中心提供，以白三葉草作為宿主植物進行盆栽擴繁培養(yǎng)，獲得含三葉草根段、根外菌絲和AMF孢子的AMF菌劑，每克孢子含量30～40個。供試水稻品種為湘早秈45號。供試土壤基本理化性質(zhì)為：有機質(zhì)20.8 g/kg，有效氮48.3 mg/kg，有效磷25.1 mg/kg，有效鉀61.7 mg/kg，總Cd含量0.012 mg/kg，pH=6.2。由于供試土壤總Cd含量極低，本研究將其按無Cd(0 Cd)土壤對待。含鎘土壤的制備：在供試土樣中添加適量CdCl2·2.5H2O溶液，加水淹沒土壤，避光保存2個月，經(jīng)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測制備土壤的總鎘含量為0.986 mg/kg，符合本試驗1 mg/kg鎘脅迫要求。

1.2 試驗方法

供試無鎘土壤和1 mg/kg含鎘土壤經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌2 h后，各稱取5.0 kg，置于上口徑29 cm、下口徑20.5 cm、高17.5 cm的牛筋桶中，每桶均勻混入AMF菌劑100 g，設(shè)置0 Cd+CK、0 Cd+FM、0 Cd+RI、1 mg/kg Cd+CK、1 mg/kg Cd+FM和1 mg/kg Cd+RI共6個處理，每個處理3個生物學(xué)重復(fù)，其中CK為接種等量高溫高壓滅菌后的FM+RI菌劑。將水稻種子浸種催芽后選長勢良好的種子轉(zhuǎn)移至各處理的牛筋桶，每桶播種約100粒，在溫室內(nèi)培養(yǎng)，溫度控制在22～25 ℃，光照時間為14 h/d，培養(yǎng)30 d時進行各項指標(biāo)測定。

1.3 指標(biāo)的測定

1.3.1 生長指標(biāo) 株高：每個處理隨機取10株秧苗，測量莖基部至葉頂部的長度。

生物量：每個處理隨機取20株秧苗，用雙蒸水洗凈后于60 ℃烘干24 h;稱其總質(zhì)量(g)作為生物量。

1.3.2 AMF侵染率及葉綠素和Cd含量 隨機選取生長良好的秧苗洗凈后用剪刀分成地上部分和根，部分根用于菌根侵染率測定，部分地上部分用于總?cè)~綠素含量測定，剩余樣品烘干用于鎘含量測定。

AMF侵染率：取新鮮水稻根樣，用滅菌水沖洗干凈，剪成長約1 cm的根段放入10 mL試管中，加入15 g/L的KOH后90 ℃水浴1 h，雙蒸水漂洗干凈后加入2 g/mL的HCl酸化處理30 min，雙蒸水洗凈后加入0.5 g/L的臺盼藍染液處理過夜，用體積分數(shù)50%的甘油洗凈后在每個處理中隨機挑取40條根段，在光學(xué)顯微鏡下觀察AMF侵染狀況，采用根段侵染率加權(quán)法[24]計算侵染率。

葉綠素含量：選用植物葉綠素含量測定試劑盒(CPL-2-G，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)進行測定，葉綠素含量(mg/g)=0.01×(20.21×A645+8.02×A663)×D÷m，其中A645和A663分別表示葉綠素a和葉綠素b在645 nm和663 nm處的吸光度，D為樣品的稀釋倍數(shù)，m為樣品質(zhì)量。

Cd含量：準(zhǔn)確稱取0.1～0.2 g(精確至0.1 mg)經(jīng)風(fēng)干、研磨至粒徑小于0.149 mm的水稻組織樣品，置于消解罐中，加入1 mL濃鹽酸、4 mL濃硝酸、1 mL氫氟酸和1 mL雙氧水，將消解罐放入微波消解裝置，使樣品溫度在10 min內(nèi)升高到175 ℃，保持20 min。消解后冷卻至室溫，使用趕酸儀于150 ℃趕酸至內(nèi)容物近干，冷卻后用去離子水溶解內(nèi)容物，將溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用去離子水定容至50 mL。取上清液使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測定鎘含量，并計算鎘轉(zhuǎn)運系數(shù)(秧苗地上部分鎘含量與地下部分鎘含量的比值)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)進行統(tǒng)計與分析，采用Tukey多重比較方法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMF對水稻秧苗生長的影響

株高和生物量是評價水稻秧苗生長狀況的重要指標(biāo)。不同處理水稻秧苗的生長情況如圖1所示。

圖1 鎘脅迫土壤接種FM或RI水稻秧苗的生長情況Fig.1 Growth of rice seedlings inoculated with FM or RI under cadmium stress soil

由圖2可見，在無鎘脅迫的條件下，F(xiàn)M和RI處理組水稻秧苗株高分別為22.8和22.6 cm，較對照組分別增加8.6%和7.6%(P<0.05)；秧苗的生物量分別為1.79和1.73 g，與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。在1 mg/kg鎘脅迫土壤條件下，F(xiàn)M和RI處理組秧苗的株高分別為20.5和19.6 cm，較對照組分別增加26.5%和21.0%(P<0.05)；秧苗的生物量分別為1.57 和1.40 g，較對照組分別增加33.1%和18.6%(P<0.05)，并且FM處理組的生物量顯著高于RI處理組(P<0.05)。結(jié)果證明，F(xiàn)M和RI能夠減輕鎘脅迫對秧苗生長的抑制作用，且FM處理效果優(yōu)于RI。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，圖4和圖5相同Different lowercase letters indicate significant differences among treatments (P<0.05),The same for Fig.4 and Fig.5

2.2 AMF對水稻秧苗根系的侵染

根系侵染率是評價AMF與宿主之間是否存在共生關(guān)系的重要指標(biāo)，侵染率越高，說明AMF與宿主的共生關(guān)系越好。本試驗AMF對根段的侵染情況見圖3和4。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，接種FM(圖3)和RI(圖略)秧苗已經(jīng)形成AMF特有的叢枝-泡囊結(jié)構(gòu)。

AR.叢枝；IH.根內(nèi)菌絲；V.泡囊AR.Arbuscule;IH.Internal hyphae;V.Vesicle圖3 FM侵染水稻秧苗形成的叢枝-泡囊結(jié)構(gòu)Fig.3 Arbuscular-vesicle structure formed byFM infecting of rice seedlings

由圖4可見，在無鎘脅迫條件下，F(xiàn)M、RI對水稻秧苗根系侵染率分別為33.4%和24.9%，在1 mg/kg鎘脅迫條件下，侵染率分別降低至25.1%和20.3%。在這2種土壤條件下,FM處理組的侵染率均顯著高于RI處理組(P<0.05)，而CK組中AMF對水稻秧苗的侵染率均小于2%。

圖4 鎘脅迫條件下FM和RI對水稻秧苗的侵染率Fig.4 Infection rate of FM or RI on rice seedlings under cadmium stress conditions

2.3 AMF對水稻秧苗光合作用的影響

光合作用是植物體內(nèi)重要的代謝反應(yīng)，可作為植物抗逆性的判斷指標(biāo)。由圖5可知，在無鎘脅迫條件下，F(xiàn)M和RI處理組水稻秧苗葉片的葉綠素含量分別為3.07和3.12 mg/g，與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。在1 mg/kg鎘脅迫條件下，F(xiàn)M和RI處理組秧苗葉片的葉綠素含量分別為2.52和2.50 mg/g，較對照組分別增加16.1%和15.2%(P<0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)M和RI能夠減輕鎘脅迫對秧苗光合作用的抑制效果。

圖5 鎘脅迫條件下FM和RI對水稻秧苗葉綠素含量的影響Fig.5 Effect of FM or RI on chlorophyll content of seedlings under cadmium stress conditions

2.4 AMF對秧苗鎘吸收與轉(zhuǎn)運的影響

鎘脅迫條件下FM和RI對水稻秧苗鎘含量及其轉(zhuǎn)運的影響結(jié)果見表1。由表1可知，在1 mg/kg鎘脅迫條件下，F(xiàn)M和RI處理組秧苗地下部分的鎘含量分別為5.61和6.03 mg/kg，較對照組分別增加186.2%和207.7%(P<0.05)；秧苗地上部分的鎘含量分別為0.52和0.55 mg/kg，較對照組分別減少40.2%和36.8%(P<0.05)；秧苗的鎘轉(zhuǎn)運系數(shù)均為0.09，較對照組減少80.0%(P<0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)M和RI能夠增強秧苗根系的鎘固定能力，抑制鎘從根部向地上部分的轉(zhuǎn)運，從而降低地上部分的鎘含量。

表1 鎘脅迫條件下FM和RI對水稻秧苗鎘含量及其轉(zhuǎn)運的影響Table 1 Effect of FM or RI on cadmium content and transport in seedlings under cadmium stress conditions

3 討 論

本研究顯示，在無鎘脅迫條件下，F(xiàn)M和RI處理水稻秧苗的侵染率分別為33.4%和24.9%，而在1 mg/kg鎘脅迫條件下其侵染率分別為25.1%和20.3%。本試驗的AMF侵染率低于文獻[20-22]報道的結(jié)果，推測主要原因是本試驗中AMF對水稻秧苗侵染時間較短所致，本試驗接種30 d(模擬水稻實際生產(chǎn)中的育秧周期)即進行侵染率檢測，如果延長接種時間，應(yīng)該能夠提高AMF的侵染率。在無鎘脅迫條件下，F(xiàn)M和RI處理組與對照組秧苗的生物量和葉綠素含量無顯著性差異，可能是因為供試土壤自身養(yǎng)分豐富，導(dǎo)致AMF對秧苗的促生效果不明顯。本研究表明，在鎘脅迫條件下FM和RI均能夠促進水稻秧苗生長，對秧苗生物量的增效作用表現(xiàn)為FM>RI>CK，但是在株高、葉綠素含量以及鎘轉(zhuǎn)運系數(shù)等指標(biāo)上FM和RI并未表現(xiàn)出顯著差異。有報道顯示，F(xiàn)M比RI更加能夠緩解鎘脅迫對水稻生長的抑制作用[18]，也有文獻指出RI對水稻的促生效果優(yōu)于FM[25]，這些研究結(jié)論不完全一致，其原因可能是由于各試驗中的AMF接種量、土壤性質(zhì)、水稻品種等差異造成的。在鎘脅迫條件下，水稻秧苗的葉綠素含量顯著下降，主要是因為當(dāng)葉片中的鎘含量達到一定程度時，葉綠體膜系統(tǒng)、類囊體等受到破壞，同時鎘離子會使與光合作用相關(guān)的酶失活，進而降低光合作用效率，導(dǎo)致葉綠素含量下降[26]，而FM和RI能減輕鎘脅迫對秧苗光合作用的抑制作用。本研究表明，在鎘脅迫條件下FM和RI處理組秧苗根部的鎘含量較對照顯著增加，地上部分鎘含量顯著減少，鎘轉(zhuǎn)運系數(shù)均降低80.0%。這是因為AMF能夠在宿主根部形成龐大的根外菌絲網(wǎng)絡(luò)，菌絲體具有較大的外表面積，能夠增強AMF對土壤鎘的吸附能力；另外，菌絲體的細胞壁由幾丁質(zhì)、多糖等構(gòu)成，含有豐富的羧基、羥基等負電荷基團，具有吸附土壤中鎘離子的能力；菌絲體的細胞膜、細胞質(zhì)、泡囊等結(jié)構(gòu)能夠儲存鎘，球囊霉素、糖蛋白等菌絲分泌物能夠?qū)︽k產(chǎn)生螯合作用，減緩鎘的移動性，從而降低鎘從秧苗根部到地上部的轉(zhuǎn)運能力[27]。

適度的干旱有利于AMF侵染宿主根系，而水稻育秧不需要形成完全淹水環(huán)境，所以在秧苗期更加容易形成AMF菌根苗。已侵染AMF的菌根苗轉(zhuǎn)移至鎘污染大田，菌根苗在移栽后是否仍然具有對鎘脅迫的抗性，這將是下一步研究的內(nèi)容。AMF能夠調(diào)節(jié)植物對鎘、錳、鋅、砷、鉻等多種重金屬的吸收與積累，增強植物對重金屬污染環(huán)境的適應(yīng)性，因而在修復(fù)重金屬污染土壤方面具有廣闊前景[28]。目前由于AMF培養(yǎng)技術(shù)仍不成熟，尚未實現(xiàn)AMF菌劑大規(guī)模的商品化應(yīng)用，隨著菌劑生產(chǎn)技術(shù)、接種技術(shù)和配套管理技術(shù)的迅速發(fā)展，AMF菌根技術(shù)將會在土壤重金屬污染修復(fù)中發(fā)揮更大作用。