李曉明

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

肝臟缺血-再灌注損傷（hepatic ischemiareperfusion injury，HIRI）是各種肝損傷、肝臟手術(shù)和休克過程中常見的并發(fā)癥，以肝細(xì)胞變性壞死和肝功能下降為特征[1]，臨床上尚無特效治療方法。因此，揭示其發(fā)病機(jī)制，探尋有效的治療藥物刻不容緩。多烯磷脂酰膽堿是一種植物來源的保肝藥物，具有穩(wěn)定生物膜結(jié)構(gòu)、加速生物膜再生和抑制脂質(zhì)過氧化等作用，廣泛用于治療各種急、慢性肝損傷[2]，但在肝臟缺血-再灌注損傷的臨床治療方面應(yīng)用較少。本研究旨在觀察多烯磷脂酰膽堿對(duì)家兔HIRI的預(yù)防作用，并為其治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

中國(guó)白兔15只，雌雄不限，體重約2.0 kg，隨機(jī)分成3組，每組5只。假手術(shù)對(duì)照組（C組）、肝臟缺血-再灌注模型組（HIRI組）和多烯磷脂酰膽堿干預(yù)組（P組）。

1.2 儀器和藥品

全自動(dòng)生化儀，逆向灌注裝置，切片機(jī)，展片機(jī)，顯微鏡，小動(dòng)物手術(shù)器械，多烯磷脂酰膽堿注射液（5 ml∶232.5 mg），20%烏拉坦。

1.3 模型建立

建模前，P組家兔每日經(jīng)耳緣靜脈注射多烯磷脂酰膽堿注射液0.2 ml/kg體重，C組和HIRI組注射等量生理鹽水，連續(xù)10 d。建模當(dāng)天，家兔用20%烏拉坦全麻，腹部手術(shù)暴露肝臟。HIRI組和P組用無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷肝門部血管造成肝臟缺血，35 min后松開動(dòng)脈夾恢復(fù)肝臟血供，再灌注4 h后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)；C組只進(jìn)行開腹閉腹手術(shù)，不夾閉肝門血管。

1.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

頸外靜脈采血5 ml，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）含量。檢測(cè)數(shù)據(jù)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 肝臟微循環(huán)中滯留白細(xì)胞的檢測(cè)

完整取出肝臟，觀察大體變化。依次在肝動(dòng)脈、門靜脈和肝靜脈斷端插管，并將肝靜脈端的插管與逆流灌注裝置相連。灌注液為無菌生理鹽水（37℃），灌注壓力50 cmH2O。打開灌注控制閥，從肝動(dòng)脈和門靜脈端的插管收集灌注液。棄去最先流出的10 ml血液，繼續(xù)收集15 ml，離心（3 000 rpm，20 min）后保留2 ml下層液，搖勻，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用下層液涂片，染色，進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，計(jì)算中性粒細(xì)胞數(shù)量。

1.6 病理學(xué)檢查

從肝臟各葉取材，10%中性福爾馬林溶液固定，脫水、透明、浸蠟、包埋，切片（5 μm），HE染色，鏡檢并照相。

2 結(jié)果

試驗(yàn)期間，各組家兔均未出現(xiàn)意外死亡。手術(shù)過程中，當(dāng)夾閉肝門部血管后，HIRI組和P組肝臟的顏色很快由正常的紫紅色變成紫黑色；當(dāng)打開動(dòng)脈夾恢復(fù)肝臟血液再灌注后，肝臟顏色又迅速恢復(fù)正常。說明用動(dòng)脈夾人為控制肝臟血流量可以復(fù)制肝臟缺血再灌注模型。

2.1 多烯磷脂酰膽堿對(duì)肝臟微循環(huán)中滯留白細(xì)胞數(shù)量的影響

從表1可見，HIRI組家兔肝臟微循環(huán)中滯留的中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯高于C組（P<0.05）；P組家兔肝臟微循環(huán)中滯留的中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯低于HIRI組（P<0.05）。

表1 肝臟微循環(huán)中滯留的中性粒細(xì)胞及血清ALT、AST、LDH 含量變化

2.2 多烯磷脂酰膽堿對(duì)血清ALT、AST和LDH含量的影響

從表1可見，HIRI組家兔血清中ALT、AST和LDH含量均明顯高于C組（P<0.05）,說明肝細(xì)胞有明顯損傷；P組家兔血清中ALT、AST和LDH含量均明顯低于HIRI組（P<0.05），提示多烯磷脂酰膽堿對(duì)肝臟缺血-再灌注損傷有顯著的保護(hù)作用。

2.3 肝臟病理變化

眼觀，C組家兔肝臟未見明顯異常；HIRI組和P組肝臟略腫大，色淡，被膜緊張，切面多血。鏡檢，C組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索分布規(guī)整，中央靜脈和竇狀隙結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞大小適中，染色均勻（見圖1）。HIRI組肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞明顯腫脹，染色變淡，呈彌漫性水泡變性，并有散在壞死，竇狀隙變小，甚至閉鎖（見圖2），中央靜脈周圍部分肝細(xì)胞有輕度脂肪變性（見圖3）。P組肝小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，肝細(xì)胞略有腫脹，胞漿著色較均勻，未見明顯變性，竇狀隙結(jié)構(gòu)清晰（見圖4）。

圖1 C組（HE×200）

圖2 HIRI組（HE×400）

圖3 HIRI組（HE×200）

圖4 P組（HE×200）

3 討論與小結(jié)

本研究通過人為夾閉肝門部血管控制肝臟的血流量，制備了家兔肝臟缺血-再灌注損傷的病理模型。結(jié)果顯示：當(dāng)夾閉HIRI組和P組家兔肝門部血管后，肝臟迅速由紫紅色變成黑紫色；當(dāng)打開動(dòng)脈夾后，肝臟迅速由黑紫色變成紫紅色，提示動(dòng)脈血又恢復(fù)了灌注，說明通過人為控制肝血流量，完全可以模擬肝臟的缺血和再灌注過程，結(jié)合血清ALT、AST和LDH含量的變化和肝臟病理改變，證明該模型是成功的。

HIRI是肝損傷、休克和肝臟外科手術(shù)過程中常見的并發(fā)癥，直接影響手術(shù)效果和疾病的預(yù)后[3]。盡管其發(fā)生機(jī)制尚未完全明了，但目前認(rèn)為，血管內(nèi)白細(xì)胞粘附、聚集、激活引起的微血管壁和細(xì)胞損傷在HIRI發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[4,5]。研究證明，肝臟缺血-再灌注時(shí)，肝組織中產(chǎn)生的炎癥相關(guān)因子明顯增多[6]，其原因可能是再灌注時(shí)，中性粒細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子增強(qiáng)，促使中性粒細(xì)胞在血管內(nèi)皮上聚集；同時(shí)，由于缺血使細(xì)胞膜磷脂降解，形成大量趨化因子，如白三烯、血小板活化因子、激肽等，吸引大量中性粒細(xì)胞進(jìn)入肝臟[7]。聚集在肝內(nèi)的中性粒細(xì)胞可釋放大量促炎因子，如自由基、蛋白酶、溶酶體酶等，破壞生物膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，HIRI組家兔肝臟微循環(huán)中滯留的中性粒細(xì)胞數(shù)量、血清中ALT、AST和LDH含量均明顯高于C組（P<0.05），肝細(xì)胞也出現(xiàn)彌漫性的水泡變性和散在的壞死等病理損傷，說明大量中性粒細(xì)胞的聚集和激活在肝臟缺血-再灌注損傷中發(fā)揮著重要作用。P組家兔肝臟微循環(huán)中滯留的中性粒細(xì)胞數(shù)量、血清中ALT、AST和LDH含量均明顯低于HIRI組，肝臟的病理變化也很輕微，僅見肝細(xì)胞輕度腫脹和散在的脂肪變性，未見肝細(xì)胞壞死現(xiàn)象，提示多烯磷脂酰膽堿對(duì)肝臟缺血-再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用。