范土貴，陳建平, ，高加龍，鐘賽意，秦小明

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省亞熱帶果蔬加工科技創(chuàng)新中心，廣東湛江 524088；2.大連工業(yè)大學(xué)，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116034）

眾所周知，肝臟是人體重要代謝器官，能將不利于體內(nèi)代謝的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒物質(zhì)排出體外[1]。長(zhǎng)期飲酒及過(guò)量飲酒會(huì)對(duì)人體肝臟造成傷害，導(dǎo)致酒精性肝損傷繼而在嚴(yán)重情況下引發(fā)肝癌[2]。因此，如何有效地保護(hù)肝臟免受酒精的損傷從而預(yù)防肝癌的發(fā)生成為目前醫(yī)藥和食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，具有低毒副作用、多途徑、多靶點(diǎn)作用的天然產(chǎn)物如黃酮類和多酚類等備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，這類天然產(chǎn)物能夠通過(guò)提高肝臟組織的抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡的能力以及調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、乙醇代謝和腸道微生物等途徑改善肝損傷，從而保護(hù)肝臟組織[3]。

姜黃素是一種從姜科植物根莖中提取得到的脂溶性多酚類物質(zhì)[4]。作為一種食品添加劑，姜黃素廣泛應(yīng)用于糕點(diǎn)、罐頭、飲料等食品中[5]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有很好的護(hù)肝效應(yīng)，可降低酒精、四氯化碳、硫代乙酰胺等各種化學(xué)藥物引起的肝損傷[6?9]。進(jìn)一步的機(jī)理研究表明，姜黃素通過(guò)能夠上調(diào)Nrf2-ARE信號(hào)通路中Nrf2蛋白的表達(dá)量來(lái)保護(hù)肝臟[10?11]。因此，姜黃素具有較好的應(yīng)用前景。然而，姜黃素的水溶性差及生物利用度低限制了它在酒精性肝損傷防治方面的應(yīng)用。為此本課題組在前期研究中，利用β-環(huán)糊精聚合物作為藥物載體，通過(guò)超分子化學(xué)作用制備得到了水溶性和抗氧化活性良好的CUR/CDP[12]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，主要考察CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為其在保護(hù)酒精性肝損傷中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素超分子包合物 實(shí)驗(yàn)室自制；姜黃素（Curcumin, CUR）標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞裂解液RAPI、BCA蛋白測(cè)試盒和活性氧檢測(cè)試劑盒

碧云天生物技術(shù)有限公司；總超氧化物歧化酶測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶測(cè)試盒、丙二醛測(cè)試盒、乳酸脫氫酶測(cè)試盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)試盒和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)試盒 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清、PBS、DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液和雙抗溶液 美國(guó)Gibco公司；異丙醇、二甲基亞砜（DMSO）溶液 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；MTT試劑 分析純，上海源葉生物科技有限公司；LO2細(xì)胞 購(gòu)于美國(guó)ATCC公司;β-環(huán)糊精 化學(xué)純，山東新大精細(xì)化工有限公司；其他化學(xué)試劑 均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

AUW120電子天平 日本島津公司；XRDKQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀、移液槍 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科學(xué)有限公司；HL-6數(shù)顯恒溫水浴鍋

常州奧華儀器有限公司；Eppendorf 5810R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；FD8508真空冷凍干燥機(jī)

韓國(guó)ilshin公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本EYELA公司；CKX41倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CUR/CDP的制備 CUR/CDP的具體制備方法參考陳建平等[13?14]方法進(jìn)行。稱取15.76 g NaOH和20 gβ-環(huán)糊精，加32 mL H2O攪拌溶解，在30 ℃下緩慢加入環(huán)氧氯丙烷（EPC）9.64 mL，攪拌24 h后，冷卻至室溫。經(jīng)超聲功率為80 W超聲5 min后，將溶液倒入透析袋屮透析至中性，抽濾去除不溶物，經(jīng)0.45 μm纖維素膜過(guò)濾后旋蒸至粘稠狀，加入無(wú)水乙醇析出白色固體，經(jīng)過(guò)濾、真空干燥即得β-環(huán)糊精聚合物。將姜黃素和β-環(huán)糊精聚合物按質(zhì)量比1:4研磨混勻，加50 mL蒸餾水，在120 W下超聲5 min后，經(jīng)磁力攪拌2 d，將溶液抽濾、旋蒸和真空干燥，即得水溶性姜黃素超分子包合物。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) LO2細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移至DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗溶液）中，并將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%左右時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷模型的建立 在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組加入8×104個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液于96孔板中，而空白組中用DMEM高糖培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后去除培養(yǎng)基，然后，實(shí)驗(yàn)組中加入200 μL不同濃度（100~800 mmol/L）的乙醇溶液，而空白組和對(duì)照組中均分別加入200 μL DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT孵育4 h。然后，用注射器抽掉上清液，加入150 μL DMSO反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀測(cè)量各個(gè)孔在570 nm處的吸光值。根據(jù)公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：A0表示空白組的OD值；A1表示對(duì)照組的OD值；A2表示實(shí)驗(yàn)組的OD值。

1.2.4 CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷的影響

在實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組加入8×104個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液于96孔板中，而空白組中用DMEM高糖培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)組中加入100 μL 不同濃度（0~80 μg/mL）的CUR/CDP，而空白組和陰性對(duì)照組中均分別加入100 μL DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)12 h后，采用移液器抽掉培養(yǎng)基。然后，實(shí)驗(yàn)組中加入200 μL 600 mmol/L乙醇，而空白組和陰性對(duì)照組中均分別加入200 μL DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)6 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液孵育4 h。然后，采用注射器抽掉上清液，加入150 μL DMSO溶液反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀測(cè)量各個(gè)孔在570 nm處的吸光值。根據(jù)式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.5 CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷后ALT、AST、LDH、SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影響 將LO2細(xì)胞懸液以2×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿添加5 mL的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的CUR/CDP培養(yǎng)12 h后去除培養(yǎng)液，加入5 mL 600 mmol/L乙醇培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)液收集于離心管中。根據(jù)ALT、AST和LDH試劑盒的操作方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST和LDH活力。并根據(jù)SOD、GSHPX和MDA試劑盒的操作方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的SOD、GSH-PX活力和MDA含量。

1.2.6 CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷后ROS含量的影響 將LO2細(xì)胞以8×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，分別加入100 μL不同濃度的CUR/CDP培養(yǎng)12 h后用移液器去除培養(yǎng)液，加入200 μL 600 mmol/L乙醇培養(yǎng)6 h后，加入300 μL DCFH-DA孵育30 min。用PBS洗滌3次，采用酶標(biāo)儀測(cè)量各個(gè)孔在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm條件下的熒光強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x ˉ±s）表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用T檢驗(yàn)對(duì)兩組之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，P<0.05為差異具有顯著意義，P<0.01為差異具有極限顯著意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LO2細(xì)胞損傷模型的建立

由圖1可知，細(xì)胞經(jīng)不同濃度的乙醇處理6 h后，細(xì)胞存活率隨著乙醇濃度的升高呈下降趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為600 mmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率從對(duì)照組的100%±6.57%下降至54.79%±4.41%（P<0.05），為中度損傷。故選擇此濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 1 不同濃度的乙醇對(duì)LO2細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of different ethanol concentrations on the cell viability of LO2 cells

2.2 CUR/CDP對(duì)乙醇損傷LO2細(xì)胞存活率的影響

由圖2可知，當(dāng)80 μg/mL CUR/CDP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)處理后，細(xì)胞存活率從陰性對(duì)照組的100%下降到89.61%±1.87%，表現(xiàn)出輕微的細(xì)胞毒性。然而，相比600 mmol/L乙醇單獨(dú)處理的模型對(duì)照組，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP處理后，可以顯著提高細(xì)胞經(jīng)乙醇處理后的細(xì)胞存活率（P<0.05），且呈現(xiàn)出對(duì)包合物濃度的依賴性。當(dāng)CUR/CDP濃度達(dá)到80 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率從54.75%±8.97%（模型對(duì)照組）提高到85.27%±2.64%，表明CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，這可能是由于CUR/CDP的抗氧化活性降低了乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而起到保護(hù)肝細(xì)胞損傷的作用。

圖 2 CUR/CDP對(duì)乙醇損傷LO2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of CUR/CDP on the cell viability of LO2 cells injured by ethanol

2.3 CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷后ALT、AST和LDH活力的影響

由表1可知，與陰性對(duì)照組相比，模型對(duì)照組中的ALT、AST和LDH活力極顯著上升（P<0.01）；相比模型對(duì)照組，細(xì)胞經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP處理后，能降低ALT、AST和LDH活力，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。當(dāng)CUR/CDP的濃度達(dá)到80 μg/mL時(shí)，ALT、AST和LDH活力從模型組的（26.47±0.90）、（41.02±4.41）和（63.77±4.95）U/L降至（16.17±0.42）、（22.62±0.79）和（32.25±1.69）U/L。這可能是由于CUR/CDP的抗氧化活性避免了細(xì)胞因ROS含量的升高導(dǎo)致其細(xì)胞膜破損引發(fā)細(xì)胞內(nèi)ALT、AST和LDH的釋放，使得細(xì)胞外ALT、AST和LDH活力相應(yīng)降低。

2.4 CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷后SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影響

由表2可知，與陰性對(duì)照組相比，模型對(duì)照組中的SOD和GSH-PX活力極顯著降低，而MDA的含量極顯著上升（P<0.01）；相比模型對(duì)照組，細(xì)胞經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP處理后，能升高SOD、GSH-PX活力和降低MDA的含量，并且表現(xiàn)出濃度依賴性。當(dāng)CUR/CDP濃度達(dá)到80 μg/mL時(shí)，SOD、GSH-PX活力從模型組的（8.45±1.11）、（21.82±1.34）U/mg prot增至（16.47±1.27）、（36.70±0.56）U/mg prot，而MDA含量從模型組的（1.19±0.15）nmol/mg prot降低到（0.72±0.05）nmol/mg prot。這可能是由于CUR/CDP處理細(xì)胞后，其抗氧化作用提高了細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD、GSH-PX的活力，從而清除了細(xì)胞內(nèi)乙醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，進(jìn)而降低了MDA的含量。

2.5 CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷后活性氧（ROS）含量的影響

由圖3可知，與陰性對(duì)照組相比，模型對(duì)照組中ROS含量極顯著上升（P<0.01）；而經(jīng)CUR/CDP處理后，能明顯降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量，當(dāng)CUR/CDP濃度達(dá)到80 μg/mL時(shí)，ROS含量從模型對(duì)照組198.02%±11.76%降低到110.87%±10.22%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CUR/CDP是通過(guò)降低ROS含量來(lái)減輕乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞的損傷。這可能是由于細(xì)胞經(jīng)CUR/CDP預(yù)處理后，其抗氧化作用能夠有效清除細(xì)胞內(nèi)的自由基使得細(xì)胞內(nèi)ROS的含量降低，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。

表 1 CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷后ALT、AST和LDH活力的影響Table 1 Effects of CUR/CDP on the activities of ALT, AST and LDH in the culture medium of LO2 cells damaged by ethanol

表 2 CUR/CDP對(duì)乙醇損傷LO2細(xì)胞中SOD活力、GSH-PX活力和MDA含量的影響Table 2 Effects of CUR/CDP on SOD activity, GSH-PX activity and MDA contents in LO2 cells damaged by ethanol

圖 3 CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷后ROS含量的影響Fig.3 Effects of CUR/CDP on ROS content in LO2 cells damaged by ethanol

3 討論

盡管目前有文獻(xiàn)報(bào)道酒精性肝損傷的相關(guān)發(fā)病機(jī)制，但其具體的發(fā)病機(jī)理尚無(wú)定論。有研究認(rèn)為，酒精代謝產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)等與酒精性肝損傷有關(guān)。長(zhǎng)期或過(guò)量攝入酒精會(huì)使酒精在肝臟的代謝過(guò)程中抑制線粒體中乙醛的氧化反應(yīng)，造成酒精代謝產(chǎn)物乙醛在肝臟中不斷地積累[15]。肝臟中積累的乙醛會(huì)破壞肝細(xì)胞的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、損傷線粒體、影響肝臟的微管系統(tǒng)、引起肝纖維化等，從而導(dǎo)致肝損傷[16]。而且，機(jī)體內(nèi)過(guò)量的酒精會(huì)在肝臟中發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧，同時(shí)也會(huì)造成谷胱甘肽等抗氧化物質(zhì)含量顯著降低，從而導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)遭到破壞，最終引起肝臟損傷[17]。

在正常情況下，ALT、AST和LDH主要存在于肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，ALT、AST和LDH會(huì)被釋放到培養(yǎng)液中，使得細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALT、AST和LDH含量顯著升高，故通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)液中ALT、AST和LDH的含量可反映出肝細(xì)胞的受損程度[3,18?19]。在本研究中，經(jīng)過(guò)乙醇損傷后LO2細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST和LDH活力極顯著升高（P<0.01），這說(shuō)明乙醇破壞了LO2細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)LO2細(xì)胞造成了一定程度的損傷。經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP預(yù)處理后，LO2細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT、AST和LDH活力隨著CUR/CDP濃度的升高逐漸降低，這說(shuō)明CUR/CDP對(duì)LO2細(xì)胞具有保護(hù)其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的能力。

MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)后的主要產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)MDA的含量反映了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[20]。GSH-PX是細(xì)胞內(nèi)的一種過(guò)氧化物酶，能夠清除細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了氧化反應(yīng)的脂質(zhì)[21]。SOD是機(jī)體防御細(xì)胞發(fā)生氧化反應(yīng)的首要防線，能夠快速地清除氧自由基，防止機(jī)體受到損傷[22?23]。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的GSH-PX和SOD可以通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)被氧化的脂質(zhì)以及氧自由基來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。在本研究中，經(jīng)乙醇損傷后，細(xì)胞內(nèi)GSH-PX活力和SOD的活力出現(xiàn)極顯著降低（P<0.01），MDA的含量極顯著上升（P<0.01），這說(shuō)明乙醇破壞了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，使得細(xì)胞受到損傷。當(dāng)LO2細(xì)胞經(jīng)CUR/CDP預(yù)處理后，細(xì)胞內(nèi)GSH-PX活力和SOD活力明顯恢復(fù)，MDA含量明顯降低，表明CUR/CDP能夠改善乙醇對(duì)細(xì)胞造成的損傷。

乙醇在肝臟中會(huì)被細(xì)胞色素P450（CYP2E1）氧化，此過(guò)程會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（ROS），而ROS是細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)發(fā)生的重要因素之一[24]。當(dāng)肝臟受到過(guò)量乙醇刺激時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)ROS的含量會(huì)顯著增加，從而導(dǎo)致肝損傷[25?27]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)10~80 μg/mL CUR/CDP處理乙醇誘導(dǎo)的細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨著CUR/CDP濃度的增加呈降低趨勢(shì)，表明，CUR/CDP能夠抑制乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。

4 結(jié)論

本文通過(guò)建立乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型和采用ALT、AST、LDH、SOD、GSH-PX、MDA和ROS試劑盒檢測(cè)CUR/CDP對(duì)乙醇誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后其相關(guān)酶活性和MDA、ROS含量的影響。研究發(fā)現(xiàn)，CUR/CDP能夠降低ALT、AST、LDH、MDA和ROS的含量，同時(shí)也能恢復(fù)SOD和GSH-PX的活力，這表明CUR/CDP通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活力以及降低MDA和ROS含量來(lái)達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。綜上所述，姜黃素超分子包合物具有改善乙醇誘導(dǎo)LO2細(xì)胞損傷的能力，為其今后在肝損傷領(lǐng)域和預(yù)防肝癌等臨床的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。