陳鐸之，郝小江

(中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所 植物化學(xué)與西部植物資源持續(xù)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起急性與慢性肝臟疾病的主要病因.目前全球約有2億人感染HCV，其中80%患者會(huì)最終發(fā)展成為慢性肝炎甚至肝硬化、肝癌[1-3].目前尚無疫苗預(yù)防HCV感染.長(zhǎng)效聚乙二醇I型干擾素(PEGIFN-α)和利巴韋林(RBV)聯(lián)合應(yīng)用是近10年來治療丙肝的最佳藥物，但仍有50%以上I型HCV(GT 1HCV)感染者對(duì)該聯(lián)合抗病毒治療無效，同時(shí)有較為明顯的毒副作用(如流感樣癥狀、貧血以及抑郁癥等)而且該療法療程較長(zhǎng)，通常長(zhǎng)達(dá)一年，因此限制了該療法在臨床上的應(yīng)用[4-6].由于目前臨床常用藥有此類問題，因此近些年來，越來越多的研究人員將注意力集中在一些新機(jī)制抗HCV藥物上，目前該類研究已取得了大量科研成果，甚至有一些治療丙肝的新藥已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段.為了更好地研發(fā)治療丙型肝炎藥物，對(duì)自1995年以來治療丙型肝炎藥物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并提出了一個(gè)比較有前景的研究方向.

1 干擾素

干擾素一直是治療病毒感染的首選藥物，慢性丙型肝炎臨床癥狀較乙型肝炎輕，但同樣可以進(jìn)展到肝硬化，且有比較高的致癌幾率，所以需要抗病毒治療.而目前HCV肝炎抗病毒治療最有效的藥物為干擾素(IFN)[7-8].

1.1 普通干擾素

干擾素是一組細(xì)胞因子，是機(jī)體細(xì)胞在病毒感染或其他外源性刺激下生成的，其主要功能為分泌糖蛋白，干擾素具有廣譜抗病毒活性，同時(shí)，在一些情況下，干擾素還同時(shí)可以調(diào)節(jié)免疫以及抗增生[9].干擾素不直接殺滅病毒，而是通過與細(xì)胞表面靶蛋白結(jié)合，經(jīng)過信號(hào)通路傳導(dǎo)后，抑制病毒蛋白的合成，從而抑制病毒的復(fù)制，在抑制病毒復(fù)制的同時(shí)，干擾素還可以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答從而協(xié)同抑制病毒復(fù)制.盡管IFN目前最常用的抗病毒藥物，但是其對(duì)HCV治療效果并不理想，主要表現(xiàn)在持續(xù)病毒應(yīng)答(SVR)率較低，僅為20%左右，但是也有學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)持續(xù)正常超過6～12個(gè)月，且HCV RNA陰性，以此標(biāo)準(zhǔn)來看，IFN還是一類比較理想的抗HCV藥物[10].但是IFN會(huì)造成比較嚴(yán)重的不良反應(yīng)如流感樣癥狀、貧血以及免疫系統(tǒng)疾病.

1.2 新型干擾素類藥物

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和單克隆技術(shù)，一些新型的治療效更好，安全性更高的干擾素得到了長(zhǎng)足發(fā)展，其中最具代表性的便是復(fù)合干擾素和聚乙二醇干擾素.

1.2.1 復(fù)合干擾素(CIFN)

復(fù)合干擾素是用基因工程技術(shù)合成的28肽干擾素，是近年用于臨床的一種新的干擾素制劑.它能更強(qiáng)地激活NK細(xì)胞的抗病毒和抗增殖活性，如干復(fù)津(infergen)主要用于治療慢性丙型肝炎.它有9和 15 μg 2種劑型，9 μg CIFN相當(dāng)于普通干擾素 3 MU.臨床結(jié)果表明，皮下注射CIFN 9和 15 μg，每周3次，共24周，與IFN α-2a標(biāo)準(zhǔn)治療比較， 9 μg 組與IFN α-2a組治療終末應(yīng)答(ETR)和持續(xù)病毒應(yīng)答(SVR)無差異；15 μg 組ETR和 SVR均顯著高于IFNα-2a組，提示復(fù)合干擾素可提高干擾素的療效[11].

1.2.2 長(zhǎng)效干擾素

1970年聚乙二醇(PEG)化技術(shù)的出現(xiàn)為優(yōu)化治療性蛋白質(zhì)的分子特性提供了新方法，用大分子多聚體(PEG)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾，通過酰胺鍵將聚乙二醇分子結(jié)合于干擾素分子上[11].聚乙二醇化的干擾素分子大幅度地延長(zhǎng)了它在體內(nèi)的半衰期，提高了生物利用度，增強(qiáng)了治療效果，降低了毒性，減少了給藥次數(shù).美國(guó)FDA現(xiàn)已批準(zhǔn)2種商品化的Pegylated IFNs.Lindsay[12]報(bào)道，HCV感染者接受IFN與聚乙二醇聯(lián)合治療，HCV清除率比提高4倍.由于其半衰期長(zhǎng)，不會(huì)因每天給藥引起抗藥性、耐受性.

2 與干擾素聯(lián)用的藥物——利巴韋林(RBV)及其類似物

RBV對(duì)HCV幾乎無直接抑制作用主要用作輔助藥物與IFN聯(lián)用以起到抗病毒的作用.當(dāng)二者聯(lián)用時(shí)，可顯著增加患者抗HCV治療的應(yīng)答.國(guó)際推薦治療方案為IFN-α 3-5 MU，每周3次，RBV 800～1 200 mg/d，為期6個(gè)月以上.RBV可能是通過作用于次黃嘌呤核苷單磷酸脫氫酶而抑制鳥嘌呤-5′-三磷酸(GTP)的合成，阻止病毒合成.同時(shí)還能增強(qiáng)T細(xì)胞輔助細(xì)胞-1(Th1)的作用，通過抑制T細(xì)胞輔助細(xì)胞-2(Th2)，從而調(diào)節(jié)免疫[13-15].

圖1 利巴韋林及其類似物結(jié)構(gòu)

RBV類似物viramidine是一種RBV的前藥，它主要在肝臟中被丙氨酸脫氨酶迅速轉(zhuǎn)化為RBV，所以它在肝臟中的需要濃度比RBV高3倍，其不良反應(yīng)比RBV低.Levovirin是一種第2代RBV左旋對(duì)映體，它保留了免疫調(diào)節(jié)作用，能在體外增強(qiáng)Thl的細(xì)胞因子反應(yīng)，在體內(nèi)可以刺激機(jī)體產(chǎn)生廣譜的抗病毒狀態(tài)，并具有比RBV低得多的不良反應(yīng)，在紅細(xì)胞中幾乎不見積累[16-19].

3 直接抗病毒藥物(direct-acting antivirals，DAAs)

對(duì)HCV復(fù)制周期的研究使得一類治療HCV新策略得到了發(fā)展，這就是直接作用于HCV組件的藥物，被稱之為“直接抗病毒藥物”(DAAs)，這些藥物已經(jīng)被用作治療新感染HCV或固有HCV感染的病人并且取得了令人鼓舞的結(jié)果.目前進(jìn)行臨床試驗(yàn)的治療HCV的DAAs其靶點(diǎn)只要是HCV NS3蛋白酶，HCV NS5B RNA聚合酶以及NS5A蛋白[20].NS3蛋白酶抑制劑主要作用于絲氨酸蛋白酶同時(shí)抑制經(jīng)過翻譯的HCV多聚蛋白的水解從而阻止該蛋白進(jìn)一步形成成熟的HCV.NS5B是由HCV編碼的RNA聚合酶，其作用是催化正鏈RNA基因的形成[21].對(duì)該聚合酶的抑制會(huì)阻礙HCV基因復(fù)制.NS5A的功能目前并未完全研究清楚，不過可以肯定的是其在病毒復(fù)制過程中起到很重要的作用如調(diào)解NS5B聚合酶、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及病毒微粒釋放等[22].

3.1 NS3蛋白酶抑制劑

3.1.1 BILN2061(Ciluprevir)

由加拿大Boehringer Ingelheim 公司研制的BILN 2061是世界上第一個(gè)進(jìn)入臨床研究的NS3蛋白酶抑制劑，該藥物在臨床前研究過程中發(fā)現(xiàn)，BILN 2061是一種非共價(jià)特異性GT1 HCV NS3/4A蛋白酶抑制劑，同時(shí)該藥物還可以很好的阻滯HCV多聚蛋白的形成，從而抑制HCV復(fù)制[23].當(dāng)慢性肝炎患者口服ciluprevir 2 d，其血液中HCV RNA降低了2～4 log10(IU/mL)[24].這些令人滿意的結(jié)果第一次在臨床角度驗(yàn)證了DAA的有效性.盡管ciluprevir最終由于細(xì)胞毒性止步于一期臨床研究，但是其臨床研究結(jié)果促進(jìn)了其他NS3/4A抑制劑的發(fā)展.特別要指出的是，科研人員通過對(duì)ciluprevir的基本骨架進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾已經(jīng)發(fā)展出一系列的大環(huán)類NS3蛋白酶抑制劑如TMC-435等(表1).

表1 NS3/4a蛋白酶抑制劑活性情況

3.1.2 VX950(Telaprevir)

VX950是由Vertex Pharmaceuticals和Tibotec BVBA兩家公司共同研制的另一類NS3/4A抑制劑，該藥物通過與蛋白酶形成可逆的共價(jià)復(fù)合體從而抑制酶作用的發(fā)揮，其抑制指數(shù)(Ki)達(dá)到 7 nmol/L.需要指出的是，該藥物對(duì)于GT2、GT3 HCV的抑制指數(shù)分別高出GT1型4～7倍與40倍，這就說明，VX-950是具有基因型選擇性的[25].

在二期臨床研究過程中，GT1感染病人單獨(dú)服用VX950(每8h 750 mg) 15 d 后體內(nèi)病毒減少1.3～5.3 log10IU/mL.在二期臨床PROVE 1、2階段中，在先進(jìn)行為期12周的pIFNα/利巴韋林/VX950三元療法后，再分別進(jìn)行36周(PROVE 1)和12周(PROVE 2)的pIFNα/利巴韋林二元療法，結(jié)果表明，在與VX950聯(lián)用時(shí)pIFNα/利巴韋林的治療時(shí)間可以顯著縮短，該療法帶來的毒副作用因此也會(huì)顯著降低[26].

PROVE 3階段中，SOC無效的患者利用相同的治療方法進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有38%～39%的患者產(chǎn)生了SVR，而單純進(jìn)行SOC療法的患者中，這一數(shù)字僅為9%[27].這一結(jié)果表明，有VX950存在的三元療法可以顯著提高病人SVR產(chǎn)生率.

由于HCV的高復(fù)制率總是伴隨著NS5B聚合酶的高變異性，因此在服用VX950 2周后便會(huì)出現(xiàn)抗藥性，但是在與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用時(shí)，機(jī)體對(duì)VX950的抗藥性會(huì)顯著減少.與SOC相比，VX950沒有明顯的毒副作用，僅有個(gè)別患者會(huì)出現(xiàn)胃腸不適、貧血以及皮疹等癥狀[28].

所有的研究結(jié)果都表明，VX950是一個(gè)很有前景的抗HCV新藥并且該藥物已于2011年上市.

3.1.3 SCH503034(Boceprevir)

SCH503034 由Merck公司研制的一類NS3/4A蛋白酶抑制劑，在為期 14 d 的治療過后，對(duì)SOC無效的患者體內(nèi)HCV RNA水平降低了約 1.6 log10(IU/mL)，在與pIFN聯(lián)用后病毒降低 2.9 log10(IU/mL).

基于這些結(jié)果，仙靈苞雅進(jìn)行了2期臨床試驗(yàn)，對(duì)GT1 HCV感染患者首先進(jìn)行為期4周pIFNα/利巴韋林聯(lián)合給藥，接著是44或24周的pIFNα/利巴韋林/ SCH503034聯(lián)合給藥[29].令人喜出望外的是，研究結(jié)果表明三元療法可以顯著提高SVR形成比例(75%，44周；56%，24周).試驗(yàn)數(shù)據(jù)還表明，在發(fā)生RVR的患者中，產(chǎn)生SVR的患者比例在82%，這就說明將治療周期從48周縮短到24周并不會(huì)顯著降低治療效果.

在臨床試驗(yàn)過程中，個(gè)別患者會(huì)出現(xiàn)疲勞、貧血、惡心和頭痛等不良反應(yīng).

3.1.4 TMC 435

TMC435是一種非共價(jià)大環(huán)NS3/4A蛋白酶抑制劑，是由比利時(shí)Tbotec公司和瑞典Medivir公司共同研制的，在二期臨床研究中，新感染和過往感染患者進(jìn)行了不同給藥劑量(75、150或 200 mg)TMC435與pIFNα/利巴韋林聯(lián)合給藥，為期4周.三元療法過后為44周的pIFNα/利巴韋林治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 28 d 過后89%的患者發(fā)生了SVR而且其病毒濃度降低4.7～5.4 log10，觀察到的副作用為惡心、腹瀉以及頭痛，但癥狀輕微[30].

3.1.5 RG7227(Danoprevir)

RG7227也是一種非共價(jià)大環(huán)NS3/4A蛋白酶抑制劑，一期臨床表明，在單獨(dú)服用RG7227 14 d 后，GT1 HCV感染患者體內(nèi)病毒水平降低 3.9 log10，在聯(lián)合服用pIFNα/利巴韋林后，病毒水平進(jìn)一步降低了4.7～5.7 log10，在為期2周三元治療過程中，13%～57%的患者體內(nèi)基本上監(jiān)測(cè)不到HCV RNA[31].在一期臨床研究階段，RG7227所造成的毒副作用都是溫和且暫時(shí)的.

有趣的是，將RG7227與另一種NS5B聚合酶RG7128聯(lián)用可以顯著增加體外抗HCV活性，實(shí)驗(yàn)表明在RG7227/RG7128聯(lián)用2周后便會(huì)出現(xiàn)明顯持續(xù)抗病毒作用.而且該療法副作用較小并無耐藥反應(yīng)[32].

3.1.6 其他NS3蛋白酶抑制劑

目前，有許多NS3蛋白酶抑制劑在研發(fā)過程中，其中有3個(gè)藥物已進(jìn)入2期臨床階段，這3個(gè)藥物分別是：MK-7009 (vaniprevir)、SCH 900518 (Narlaprevir)和BI 201335.在2期臨床研究中，MK-7009在與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用4周后患者體內(nèi)RVR水平為69%～82%，再繼續(xù)用藥8周，患者EVR水平將提高到77～89%[33].當(dāng)SCH 900518與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用 8 d 后，病人體內(nèi)HCV降低4～5.5 log10，當(dāng)病人連續(xù)服藥4周后，其RVR與EVR分別提高至58～87%與84%～87%[34].當(dāng)單獨(dú)服用BI201335 14 d 后，患者體內(nèi)HCV RNA降低3～4.2 log10，當(dāng)繼續(xù)聯(lián)合用藥 14 d 后該數(shù)字達(dá)到4.8～5.3 log10.

3.2 HCV NS5B RNA聚合酶(RdRp)抑制劑

HCV RNA聚合酶的三維晶體結(jié)構(gòu)是經(jīng)典的“拇指-手掌-食指”狀結(jié)構(gòu)[35]，在這個(gè)“手掌”中，“拇指”與“指尖”中間存在著大量相互作用力，形成了一個(gè)環(huán)狀活性位點(diǎn)，在接下來對(duì)該酶與核苷酸共結(jié)晶研究表明，在“拇指”與“食指”相連的地方存在一個(gè)rGTP口袋.這個(gè)“口袋”起變構(gòu)的作用[36].HCV RdRp對(duì)病毒的復(fù)制至關(guān)重要，而且無宿主等價(jià)酶，因此，該酶被作為抗病毒治療的主要位點(diǎn)，至今為止，大多數(shù)抗病毒藥物靶點(diǎn)均是病毒聚合酶[37].

目前HCV RdRp抑制劑從結(jié)構(gòu)上主要可以分為2類：核苷類衍生物和非核苷類衍生物.核苷類衍生物主要通過競(jìng)爭(zhēng)性與聚合酶活性位點(diǎn)結(jié)合起作用，該類化合物抗病毒譜往往較寬.而另一方面，非核苷類抑制劑起作用則更具特異性，通過與活性位點(diǎn)直接結(jié)合或阻止聚合酶引發(fā)而起效.

吉利德四代抗丙肝藥物

HCV NS5B RNA聚合酶(RdRp)抑制劑的代表藥物就是由吉利德公司研發(fā)的四代抗HCV藥物.吉一代 (Sofosbuvir,索非布韋)2013年12月獲批上市；吉二代(Harvoni，索非布韋與雷迪帕韋的復(fù)方藥)2014年10月獲批上市；吉三代(Epclusa，索非布韋與維帕他韋的復(fù)方藥)2016年6月獲批上市.吉四代(Vosevi，索非布韋、維帕他韋與伏西拉普瑞韋組成的復(fù)方藥物)，該藥物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)丙型肝炎患者的完全治愈.

索非布韋是首個(gè)無需聯(lián)合干擾素就能安全有效的治療丙肝的藥物，臨床證實(shí)主要針對(duì)1和4型的丙肝.針對(duì)2型丙肝，該藥物聯(lián)合利巴韋林的持續(xù)病毒應(yīng)答率(SVR)為89%～95%.針對(duì)3型丙肝，該藥物聯(lián)合利巴韋林的SVR為61%～63%.Harvoni主要用于1、4、6型丙型肝炎的治療,是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于治療基因1型丙型肝炎的全口服復(fù)方制劑，無需聯(lián)用注射干擾素，可單藥使用，12周對(duì)慢性丙肝患者的治療有效率達(dá)到95%～98%.Epclusa適用于全部6種基因型丙肝患者的治療，效果更佳，治愈率更高，副作用更小.第四代Vosevi是一種含3種固定劑量成分的組合藥片，也是首個(gè)獲批的每日一次單片治療的藥物,適用患者群體為先前用含有NS5A抑制劑方案治療失敗的基因型1、2、3、4、5或6成年病人，以及先前使用含有索非布韋但無NS5A抑制劑方案失敗的基因型1a或3成人，實(shí)現(xiàn)了對(duì)丙肝病人的全覆蓋.得益于上述四代藥物的開發(fā)，目前丙型肝炎可以說已被人類完全攻克.

3.2.1 核苷類抑制劑

核苷類抑制劑，不論是鏈阻滯劑還是非鏈阻滯劑，可以有效抑制病毒復(fù)制，當(dāng)進(jìn)入細(xì)胞后，核苷類似物首先轉(zhuǎn)化成核苷三磷酸(NTP).這種非自然的核苷類抑制劑一方面作為聚合酶的競(jìng)爭(zhēng)物質(zhì)另一方面還可以整合進(jìn)起始鏈中，這種整合使得RNA鏈的延長(zhǎng)過早終止[38].同時(shí)，整合的核苷抑制劑會(huì)造成堿基錯(cuò)配，進(jìn)而造成病毒的累積突變以至于所謂的“誤差災(zāi)變”.但是，其他研究表明，在治療HCV過程中，利巴韋林與干擾素聯(lián)用可以幫助患者恢復(fù)免疫響應(yīng)[39]，這就說明利巴韋林是一種多效性的藥物，但是由于利巴韋林的作用機(jī)制目前還不明確，因此其也是美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的唯一一個(gè)核苷類抗HCV藥物.

近些年，有關(guān)研究報(bào)道了幾個(gè)糖醛類和堿基類核苷衍生物可以抑制RdRp酶活性進(jìn)而阻滯HCV復(fù)制[40-41].在這些化合物中，最具應(yīng)用前景的就是C-2、3-位取代核糖核酸類衍生物.默克實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)2-C-甲基胞苷(1)和2-O-甲基胞苷(2)在體外具有很好的抑制NS5B聚合物活性[42].通過研究其作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)該化合物通過與RNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合并且在整合至RNA中后作為終止子終止了鏈的復(fù)制.C-2位上甲基通過阻礙了通過空間位阻使得序列無法與核苷酸進(jìn)行融合.2-C-甲基鳥苷(3)以及另外一些核苷類似物與2-C-甲基腺苷、2-甲基胞苷作用機(jī)理相似，此外，其他含有C-2甲基的腺苷類似物也具有很好的抗HCV活性.

2-去氧-2-氟-2-C-甲基胞苷(4)具有很好的抗HCV活性，其EC90=5.4 M，可以與2-去氧-2-氟胞嘧啶核苷相媲美.而且，該化合物細(xì)胞毒性很弱.有趣的是，該化合物對(duì)牛痢疾病毒(一種與HCV密切相關(guān)的病毒)無抑制作用[43].此外，有研究發(fā)現(xiàn)了一系列3-脫氧核苷衍生物，該類化合物可以作為終止子終止RNA鏈的延長(zhǎng).其中有一個(gè)典型化合物即3-脫氧胞苷(5)具有非常好的HCV抑制活性[44].

NM283(6)，是一類很有前途的口服高生物利用度藥物2-C-甲基胞苷(NM107)的前藥.NM283通過2條途徑對(duì)病毒編碼的RNA聚合酶起作用：直接作用于聚合酶以及整合進(jìn)入延長(zhǎng)中的病毒RNA從而終止其復(fù)制.NM283是第1個(gè)進(jìn)入2期臨床的抗HCV藥物.通過為期四周的口服藥物治療表明：NM283與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用表現(xiàn)出良好的治療效果同時(shí)期藥物耐受度也較理想[45].

圖2 核苷類抑制劑結(jié)構(gòu)圖

最近，Roche公開了一項(xiàng)研究成果，在一項(xiàng)多劑量遞增實(shí)驗(yàn)中，R1626(一個(gè)新結(jié)構(gòu)HCV聚合酶抑制劑)，表現(xiàn)出了優(yōu)異的抗HVC活性，該化合物是R1479的前藥，通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，R1626在體內(nèi)能夠高效轉(zhuǎn)化成R1479.在服用R1626 14 d，每天 1 500 mg 后，病人血液中HCV RNA降低了 1.2 log10[46].

3.2.2 非核苷類抑制劑

與活性位點(diǎn)不同，通過對(duì)NS5B與化合物共晶的X線衍射分析，發(fā)現(xiàn)了在與之前發(fā)現(xiàn)的活性位點(diǎn)相距較遠(yuǎn)的地方，有一個(gè)構(gòu)象調(diào)節(jié)位點(diǎn)，該位點(diǎn)也成為發(fā)展新型抗病毒藥物的靶點(diǎn)之一[47].因此，當(dāng)化合物與RdRp活性位點(diǎn)或者構(gòu)想調(diào)節(jié)位點(diǎn)相互作用可以影響底物與酶的結(jié)合或者其構(gòu)象的轉(zhuǎn)化，這些化合物因此也可以高效抑制HCV.目前，有結(jié)構(gòu)不同的幾類非核苷類抑制劑已經(jīng)被發(fā)現(xiàn).

近日，一類α，γ-二酮酸類化合物被證明可以作為HCV抑制劑[48].對(duì)該類化合物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究后發(fā)現(xiàn)，該類化合物中的二酮酸對(duì)于抗HCV活性至關(guān)重要，同時(shí)，將γ-位的芳基替換為噻吩基以后，化合物的療效和選擇性都有了顯著提高[49].對(duì)該化合物進(jìn)行更進(jìn)一步的優(yōu)化以后得到了一個(gè)活性優(yōu)良的HCV NS5b RNA 聚合酶抑制劑，其EC50為 45 nmol/L.

有研究認(rèn)為認(rèn)為二羥基嘧啶類衍生物可以像二酮酸類化合物一樣與酶活性位點(diǎn)內(nèi)兩分子催化性鎂離子結(jié)合[50].但是目前并沒有該類化合物的體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù).

苯并噻二嗪及其衍生物也是一類具有良好抗HCV活性的化合物，其中一個(gè)化合物其抑制NS5B聚合酶EC50為 80 nmol/L，對(duì)HCV其EC50為 500 nmol/L[51]，此外，該類衍生物還表現(xiàn)出對(duì)HCV RdRp的高選擇性，不會(huì)對(duì)其余病毒以及聚合酶起抑制作用.當(dāng)與干擾素聯(lián)用時(shí)，該類化合物可以表現(xiàn)出很強(qiáng)的協(xié)同作用[52].進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該類化合物并不是通過與NTP競(jìng)爭(zhēng)性整合到RNA從而阻止RNA復(fù)制而起作用，而是通過與HCV NS5B聚合酶活性位點(diǎn)結(jié)合起效.當(dāng)分子中的喹啉酮結(jié)構(gòu)被吡咯酮取代以后，會(huì)使得化合物抗HCV活性顯著提高[53].

苯并咪唑類衍生物是第1類非核苷HCV NS5B RNA聚合酶，其中一個(gè)化合物其對(duì)HCV NS5B RNA聚合酶EC50達(dá)到亞微摩爾級(jí)在對(duì)該化合物作用機(jī)理進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，該化合物并不與NTP競(jìng)爭(zhēng)整合至RNA，而是通過抑制異構(gòu)酶活性從而起到抑制RNA聚合酶的活性[54].對(duì)苯并咪唑與苯并噻二嗪的交互抗性和協(xié)同作用研究研究發(fā)現(xiàn)這兩類結(jié)構(gòu)迥異的化合物無交叉位點(diǎn)，因此說明以上兩類化合物其作用機(jī)理不同[55].Boehringer Ingelheim公司通過拓?fù)鋽U(kuò)大的方法合成了一系列含苯并二唑的雜環(huán)化合物[56].有趣的是，后來通過將苯并咪唑取代為吡唑-嘧啶結(jié)構(gòu)而得到的衍生物具有良好的抗HCV NS5B聚合酶活性[57].研究人員之后又發(fā)現(xiàn)了兩類HCV RNA聚合酶抑制劑.苯基丙氨酸和噻吩羧化物.經(jīng)過研究，其中的典型化合物是通過與一個(gè)異構(gòu)化位點(diǎn)結(jié)合從而抑制HCV NS5B RNA聚合酶的活性[58-59].

除此以外，還有一些前景光明的非核苷抑制劑正在進(jìn)行臨床研究.

R803是一個(gè)小分子 HCV RdRp抑制劑，其EC50=10 nmol/L，R803目前正在進(jìn)行多劑量1、2期臨床試驗(yàn)，但是由于發(fā)生了比較嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，該藥物的臨床試驗(yàn)?zāi)壳耙呀K止.HCV-086是另一個(gè)口服小分子HCV NS5B RNA聚合酶抑制劑，一期臨床研究表明，該藥物效果良好，安全系較高，但是，該藥物總體藥效難以保證，因此已停止研發(fā).HCV-796是一種新型非核苷類聚合酶抑制劑，目前正在進(jìn)行與干擾素聯(lián)用的臨床試驗(yàn)，通過雙盲、安慰劑對(duì)照以及遞增劑量試驗(yàn)表明，該藥物藥效良好且不會(huì)造成嚴(yán)重的毒副反應(yīng)[60].

4 作用于宿主細(xì)胞的藥物及候選先導(dǎo)化合物

除以上機(jī)制外，另一類比較有前景的治療丙肝的策略是將宿主細(xì)胞作為治療靶點(diǎn)，宿主細(xì)胞是HCV復(fù)制不可或缺的條件，因此對(duì)宿主細(xì)胞中某些因素進(jìn)行調(diào)控可以影響HCV的復(fù)制.目前主要從抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞、核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)抑制劑、抑制病毒RNA復(fù)制以及阻滯病毒裝配和釋放4個(gè)方面來進(jìn)行研究.

4.1 熱激同源蛋白70(Hsc70)抑制劑

有越來越多的證據(jù)表明：宿主蛋白是病毒粒子的組成部分之一，這些蛋白會(huì)幫助病毒躲避人體免疫系統(tǒng)的識(shí)別或者幫助病毒更好的進(jìn)入細(xì)胞釋放.蛋白組學(xué)研究結(jié)果表明Hsc70是高純度HCV J6/JFH病毒粒子的重要組成部分.將HCV病毒顆粒與Hsc70抗體聯(lián)合培養(yǎng)會(huì)降低病毒感染性.

2010年蔣建東課題組首先發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以下調(diào)宿主Hsc70表達(dá)的苦參堿類衍生物——IMB-DM122(圖3)，通過對(duì)其抗HCV活性進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，該化合物可以安全有效的抑制HCV的復(fù)制，在研究中發(fā)現(xiàn)，IMB-DM122通過作用于Hsc70 mRNA 3′非編碼區(qū)，從而阻礙mRNA復(fù)制，同時(shí)在藥物作用下HCV mRNA半衰期縮短達(dá)78%.在研究中他們還發(fā)現(xiàn)，抑制Hsc70表達(dá)可以阻止病毒衣殼組裝從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用[61].

圖3 苦參堿類衍生物結(jié)構(gòu)圖

最近，研究中發(fā)現(xiàn)，石蒜西定(lycoricidine)也是一類通過抑制Hsc70表達(dá)從而抑制HCV復(fù)制的生物堿，其EC50=0.52 nmol/L，在此基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了20個(gè)石蒜西定衍生物并對(duì)其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石蒜西定C-1與10b-位的雙鍵以及C-2、C-3、C-4、5-位的烷基化對(duì)化合物活性有顯著影響[62](見表2).

表2 石蒜西定衍生物構(gòu)效關(guān)系

綜上所述，對(duì)Hsc70抑制劑抗HCV活性的研究，在治療HCV的新療法以及廣譜抗病毒藥物研究方面有著廣闊的應(yīng)用前景.

4.2 親環(huán)蛋白抑制劑

4.2.1 進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的親環(huán)蛋白抑制劑

目前，有一類很有發(fā)展前景的親環(huán)蛋白抑制劑被開發(fā)出來，特別要指出的是有3個(gè)候選化合物：Alisporivir(Novartis), NIM-811 (Novartis)以及 SCY-635(Scynexis)已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，從1、2期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，這3個(gè)化合物有著理想的安全性以及治療效果(表3).

表3 親環(huán)蛋白抑制劑活性總結(jié)

續(xù)表3

1) Alisporivir Alisporivir是一類通過合成得到的cyclosporineA(CsA)衍生物，它也是第一個(gè)投入臨床試驗(yàn)的口服非免疫抑制型親環(huán)蛋白抑制劑在體外試驗(yàn)中，該藥物表現(xiàn)出了有優(yōu)異的抗HCV活性，這種活性的表達(dá)與抑制親環(huán)蛋白具有非常密切的關(guān)系.

(a) Ⅰ期臨床研究 該藥物Ⅰ期臨床試驗(yàn)歷時(shí) 15 d，采取雙盲、安慰劑對(duì)照的方式進(jìn)行.每日口服2次，每次口服劑量 1 200 mg.該藥物經(jīng)口服后可以被迅速吸收，2 h 后血藥濃度達(dá)到峰值，其半衰期長(zhǎng)達(dá) 100 h.在服用alisporivir的受試個(gè)體中，HCV-RNA降至3.6 log10水平，在16名服用藥物的個(gè)體中，有15人HCV病毒載量降了 2 log10以上.其中更有3名病人在治療開始8～15 d 后體內(nèi)病毒幾乎難以被檢測(cè)到.在該研究中，所有3種HCV基因型(GT1、GT2以及GT4)對(duì)歸一化藥量響應(yīng)良好同是沒有一例參試樣本出現(xiàn)病毒學(xué)反彈現(xiàn)象.通過這些實(shí)驗(yàn)可以表明，alisporivir具有泛基因型抗病毒能力及低耐藥性.但是，該藥物引起的暫時(shí)性高膽素血癥使得在一些病人身上進(jìn)行的試驗(yàn)不得不中止[63-65].

(b) Ⅱ期臨床研究 在該藥物Ⅱ期臨床階段，主要考察了該藥物與pIFNα連用對(duì)慢性丙型肝炎患者的治療效果[66-71].90例參試對(duì)象分別按以下4種給藥方案之一進(jìn)行了為期 29 d 的治療：(a)pIFNα + 安慰劑；(b)pIFNα + alisporivir(200 mg/d)；(c)pIFNα+alisporivir(600 mg/d)；(d)pIFNα+alisporivir(1 000 mg/d)以及(e). alisporivir(1 000 mg/d).在感染了GT1和GT4基因型HCV的乙肝患者中，在治療 29 d 后，其體內(nèi)HCV RNA降低值如表4所示.

表4 Alisporivir臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

在利用d給藥方案的12位患者中，有8位在經(jīng)過了 29 d 的治療后，在其體內(nèi)幾乎檢測(cè)不到HCV病毒，治愈率達(dá)到67%，而使用方案a和方案e的患者中，這一數(shù)字顯著降低到了僅25%.在對(duì)感染GT2和GT3型HCV的6位患者單獨(dú)使用alisporivir治療(方案e)時(shí)，有4位患者體內(nèi)幾乎檢測(cè)不到HCV病毒，治愈率達(dá)到67%，改組病人HCV RNA下降了4.22 log10.在較低劑量時(shí)，alisporivir的安全性與安慰劑相當(dāng).在口服 1 000 mg 藥物的24名患者中，僅有5人表現(xiàn)出可逆高膽素血癥癥狀.Alisporivir與pIFNα連用對(duì)感染GT1 HCV的患者的療效也經(jīng)過了考察：病人分別進(jìn)行alisporivir/pIFNα/利巴韋林或安慰劑/pIFNa/利巴韋林治療，時(shí)間為24周或48周，其SVR應(yīng)答水平分別為76%和55%.于此同時(shí)，病人對(duì)alisporivir有良好的耐受性與極低的病毒學(xué)反彈幾率[72-73].在服用alisporivir的患者中，70%的患者在停止給藥或降低藥量后出現(xiàn)了病毒學(xué)反彈現(xiàn)象.在口服alisporivir進(jìn)行為期24周的應(yīng)答指導(dǎo)治療的患者中，3%的患者表現(xiàn)出強(qiáng)烈的高膽素血癥.另有7%的接受48周治療的患者有相同的副作用癥狀.但是這些副作用均可逆且未伴隨轉(zhuǎn)氨酶升高.上述結(jié)果表明，alisporivir 與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用在治療GT1型HCV感染方面有顯著地優(yōu)越性.

在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，alisporivir還測(cè)試其對(duì)感染GT2、GT3 HCV患者的治療效果.數(shù)據(jù)顯示，每天1次聯(lián)合口服alisporivir 和利巴韋林對(duì)幾乎一半的GT2、GT3 HCV患者有治療作用.32%的患者在停藥6周后機(jī)體依舊有清楚病毒的能力.除此以外，97%的被治療患者在繼續(xù)服用alisporivir 和利巴韋林后，在停藥后的12周時(shí)間里，機(jī)體依舊具有清除病毒的能力[74].以上結(jié)果表明，alisporivir為今后治療HCV感染提供了1個(gè)頗具潛力的選項(xiàng).

2) NIM811 (Novartis) NIM811是第1個(gè)通過合成得到的Cyp抑制劑，它同樣也是一類CsA衍生物，對(duì)該藥物的研究發(fā)現(xiàn)，該藥物免疫抑制活性非常微弱.同時(shí)，和Alisporivir一樣，NIM811同樣表現(xiàn)出了很明確的體外抗HCV活性.

(a) Ⅰ期臨床研究 在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，NIM811利用遞增計(jì)量的隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照的方式對(duì)GT1型HCV感染者進(jìn)行 14 d 治療，病人每日或每2日單獨(dú)口服NIM811 10～600 mg.在所有劑量下，病人對(duì)NIM811均表現(xiàn)出良好適應(yīng)性，病人轉(zhuǎn)氨酶水平正常，未見病毒作用跡象[75].

(b)Ⅱ期臨床研究 在Ⅱ期臨床研究中，GT1感染者口服NIM811(600 mg)或者安慰劑 14 d，在治療期的第 1 d 或第 8 d 聯(lián)合服用pIFNα.結(jié)果表明，在聯(lián)合用藥的患者體內(nèi)，其HCV RNA降低了 2.85 log10，而單獨(dú)口服pIFNα的患者相同指標(biāo)僅為 0.56 log10，同時(shí)，該藥物未發(fā)現(xiàn)顯著地副作用.

3) SCY-635 (SCYNEXIS) SCY-635是最新的非免疫抑制型Cyp抑制劑之一，該藥物同樣是CsA衍生物之一，也同樣具有顯著地體外抗HCV活性.

(a) Ⅰ期臨床研究 在Ⅰ期臨床研究中，對(duì)GT1 HCV感染病人進(jìn)行了為期 15 d，隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照、多計(jì)量給藥.參試者被分為3組，分別遞增給藥至總量300、600、900 mg.在每組內(nèi)，病人以6∶1的比例隨機(jī)口服SCY-635或安慰劑，在治療期間進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估和病毒監(jiān)測(cè).服用安慰劑以及低劑量SCY-635(300或 600 mg/d)的患者其病毒復(fù)制并無明顯變化.而在口服 900 mg/d 的病人中，其體內(nèi)病毒有明顯的減少，其中最高降低了 2.2 log10，甚至有一名患者在口服藥物 15 d 后體內(nèi)幾乎監(jiān)測(cè)不到病毒.在1期臨床過程中，并未發(fā)現(xiàn)病人出現(xiàn)明顯的毒副作用[76].

4.2.2 研發(fā)中的Cyp抑制劑

1) Sangamides (BIOTICA) Sanglifehrin A，是一類與CsA結(jié)構(gòu)不同的天然聚酮類化合物，在自然界中，該化合物及其衍生物是土壤細(xì)菌Streptomycessp. A92-308110次級(jí)代謝產(chǎn)物，因此，該化合物的工業(yè)化制備也是通過生物發(fā)酵方法.Sanglifehrins A～D 具有比CsA更強(qiáng)的抑制CypA異構(gòu)化的能力[77].Sangamides是sanglifehrin A的氨基化衍生物，其具有優(yōu)異的體外跨基因型抗病毒能力，該化合物可以有效清除肝癌細(xì)胞中的HCV病毒，并且在和一些直接作用藥物聯(lián)用的時(shí)候有明顯的協(xié)同作用.初步的藥代動(dòng)力學(xué)研究表明Sangamides適合日常口服給藥.與CsA所不同的是，Sangamides不會(huì)顯著抑制MDR1——一類可以加強(qiáng)藥物配伍作用的蛋白.同時(shí)，Sangamides還被證明對(duì)MRP2沒有明顯的抑制作用[78].

2) EP-CyP546 (ENANTA) EP-CyP546是一類非免疫抑制Cyp抑制劑，體外實(shí)驗(yàn)表明，該化合物抗HCV活性為EC50=100 nmol/L(GT1b)及 121 nmol/L(GT1a).同時(shí)，有趣的是，EP-CyP546在40%人血清存在條件下依然持續(xù)保持有效，這與其他Cyp抑制劑有明顯不同.此外，該化合物與pIFNα以及DAAs聯(lián)用是有明顯的協(xié)同作用，且相互間無不良反應(yīng).EP-CyP546與一類NS5A抑制劑聯(lián)用時(shí)，可以顯著降低常見的藥物耐受作用[79].目前并無對(duì)該類化合物成功合成的報(bào)道.

3) F680 與F684 這2種化合物是通過基于片段藥物分子設(shè)計(jì)方法(FBDD)設(shè)計(jì)的小分子(100～150Da)，這2個(gè)化合物有明顯的抑制CypA、CypB和CypD的活性.更為重要的是，兩者在顯示出良好活性(F680∶IC50=3.12 μmol/L；F684∶IC50=0.87 μmol/L)的同時(shí)并未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性[80].

4.2.3 親環(huán)蛋白

2003年Watashi等首先發(fā)現(xiàn)親環(huán)蛋白抑制劑——CsA和NM811可以在體外抑制HCV復(fù)制，該發(fā)現(xiàn)首次揭示了Cyp與HCV之間的關(guān)系[81].這項(xiàng)里程碑式的發(fā)現(xiàn)又陸續(xù)被其他幾個(gè)研究小組所證實(shí)[82-87].通過暫時(shí)下調(diào)CypA、CypB、CypC、CypH、Cyp40以及CypE可以抑制HCV復(fù)制，從而表明Cyps在HCV復(fù)制方面起著重要作用.而最新的研究表明，3個(gè)獨(dú)立研究組的研究結(jié)果表明，在Cyp家族中，相比CypB與CypC，CypA對(duì)于HCV的復(fù)制至關(guān)重要[88-90].CypA 最初是從牛胸腺細(xì)胞中提取出來的廣泛存在于真核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中[91].Fischer以及他的同事們發(fā)現(xiàn)，作為肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶(PPIase)的一部分，CpyA的作用是催化脯氨酸殘基的反轉(zhuǎn)[92-94].CsA可以與CpyA疏水空腔結(jié)合從而抑制其異構(gòu)酶活性[95-96]，從而說明CpyA是Cpys抑制劑的主要體內(nèi)靶點(diǎn).

4.2.4 親環(huán)蛋白抑制劑的作用機(jī)制

有研究表明，HCV NS5A蛋白是CypA的直接配體[97-104].該發(fā)現(xiàn)也恰好與在Cyp抑制劑飼喂下HCV基因突變位點(diǎn)往往是NS5A基因的現(xiàn)象吻合.而最為關(guān)鍵的是，Cyp抑制劑阻止和破壞CypA-NS5A聚合體的形成[105]，在不同基因型HCV病毒中，CypA和病毒NS5A蛋白間的相互關(guān)系式保守存在的[106].這就可以完美解釋為什么Cyp抑制劑不論在體內(nèi)還是體外均可以抑制不同基因型HCV的現(xiàn)象.這也就是說，阻止CypA與NS5A的結(jié)合可以有效抑制HCV復(fù)制.通過晶體學(xué)研究手段可以表明：CypA可以直接與NS5A蛋白中的domains Ⅱ、Ⅲ區(qū)域結(jié)合[107]，由于該區(qū)域分布大量脯氨酸殘基，正好與CpyA是作為PPIase一部分的事實(shí)相吻合.有趣的是，已經(jīng)有研究表明NS5A蛋白domain Ⅱ區(qū)中含有一個(gè)NS5B RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)[108]，如果CypA和NS5B都可與與這個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，那就引出了一種可能性即：CypA可以作用于NS5A、NS5B或者同時(shí)作用于兩者.假如以上假設(shè)成立，則會(huì)發(fā)生以下2種情況：一方面，NS5A作為一種內(nèi)源性NS5B負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)其與NS5B結(jié)合后，會(huì)阻礙NS5B聚合酶活性的發(fā)揮，換言之，當(dāng)Cyp與NS5A結(jié)合從而抑制其與NS5B結(jié)合時(shí)，NS5B可以自由的發(fā)揮其病毒RNA聚合作用使得HCV病毒得以復(fù)制(圖4，Model Ⅰ)，當(dāng)Cpys抑制劑與CpyA結(jié)合而使得其無法與NS5A結(jié)合進(jìn)而令NS5A與NS5B結(jié)合從而阻止了HCV RNA的復(fù)制；另一方面，NS5A作為NS5B的正調(diào)節(jié)蛋白(圖4，Model Ⅱ)，CypA通過與NS5A結(jié)合以促進(jìn)其對(duì)NS5B的正調(diào)節(jié)作用.而Cyps抑制劑的加入使CypA-NS5A復(fù)合物被破壞從而破壞了NS5A對(duì)NS5B的激活作用，進(jìn)而破壞了HCV的復(fù)制.

值得注意的是，最新的研究成果表明，Cyp抑制劑SCY-635在體內(nèi)具有調(diào)節(jié)干擾素響應(yīng)的活性，當(dāng)每天口服SCY-635時(shí)，患者體內(nèi)IFNα血藥濃度會(huì)迅速提高(2 h 之內(nèi))，反觀服用安慰劑和服用SCY-635的非HCV感染者體內(nèi)干擾素水平并未顯著變化.這些數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)，對(duì)于CpyA的抑制可以既阻礙病毒復(fù)制又增加機(jī)體自身符合干擾素的表達(dá).之前有研究表明NS5A可以抑制干擾素的表達(dá).因此可以推測(cè)Cyp抑制劑通過破壞CypA-NS5A復(fù)合物的形成從而起到2方面作用：①干擾HCV復(fù)制；②激活自身干擾素表達(dá).

圖4 Cyps抑制劑作用機(jī)理

5 總結(jié)與展望

隨著人們對(duì)于丙型肝炎的逐漸重視，對(duì)于治療丙型肝炎藥物的研發(fā)也吸引著越來越多科研工作者的目光，并且取得了一定進(jìn)展，隨著越來越多的抗HCV藥物的上市，醫(yī)療人員在治療該類疾病是也有了越來越多治療手段和治療策略.但是，不可否認(rèn)的是，由于HCV本身所具有的的高變異性特點(diǎn)以及藥物本身的安全性問題，因此，要開發(fā)出來一類在各方面都令人滿意的抗丙肝新藥，還有很多問題亟待科研工作者去解決.鑒于通過傳統(tǒng)機(jī)制起效的藥物由于機(jī)制本身?xiàng)l件限制都會(huì)有不同程度的問題，因此，對(duì)一些新機(jī)制，尤其是針對(duì)宿主方面機(jī)制的新型藥物的研發(fā)或許是一個(gè)比較有前景的研究方向.