榮光 葉丹 彭維祺 孫衛(wèi)平 李學(xué)征

摘要為了解儋州市雞高致病禽流感 H5和 H7亞型二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果，于2020年12月在全市16個鄉(xiāng)鎮(zhèn)養(yǎng)雞場（戶）采集302份血清，采用血凝和血凝抑制試驗（ HA-HI）對禽流感 H5、H7亞型免疫抗體進行檢測。結(jié)果顯示，302份雞血清樣品中，雞禽流感 H5以及 H7陽性個體數(shù)分別為247、215份，合格率分別為82%、71%，均符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求免疫抗體水平達到70%的標準。說明 H5和 H7亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗的免疫效果較好，有較強的保護力。

關(guān)鍵詞高致病性禽流感;免疫效果;評估

中圖分類號 S858.31 文獻標識碼 A? DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.12.013

Evaluation of Immunity of Chickens to Highly Pathogenic Avian Influenza in Danzhou City

RONG? Guang1） YE? Dan1） PENG? Weiqi1） SUN? Weiping1） LI Xuezheng1 ，2）

（1 Tropical Crops Genetic Resources Institute， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China;

2 Danzhou Center for Animal Disease Control and Prevention， Danzhou， Hainan 571700， China）

Abstract? In? order? to? understand? the? immune? effect? of chicken? inoculated? with? a? bivalent? inactivated vaccine for avian influenza H5 and H7 subtypes in Danzhou City， 302 serum? samples of chicken were collected? from? chicken? farms （households） in 16 townships? of Danzhou? City? in? December， 2020. The hemagglutination? and? hemagglutination? inhibition? tests （HA-HI） were? used? to? detect? the? immune antibodies? of avian? influenza? H5 and? H7 subtypes. The? results? showed? that? there? were 247 and 215 individuals? found? positive? to? avian? influenza? H5 and? H7 subtypes，? respectively? in 302 chicken? serum samples， with the compliance rates being 82% and 71%， respectively， which met the requirements of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs for the level of immune antibodies being upto 70%. The results showed that? avian? influenza? H5 and? H7 subtypes bivalent? inactivated vaccine has? good? immune? effect and strong protection.

Keywords? highly pathogenic avian influenza ; immune effect ; assessment

禽流感（ Avian Influenza， AI），又稱為禽流行性感冒，是由 A 型流感病毒（ Avian Influ‐enza Virus， AIV）引發(fā)多種禽類感染的疾病綜合征[1]，被世界動物衛(wèi)生組織（ OIE）列為 A類傳染病，在我國被列為一類傳染病[2-5]。根據(jù)對禽類致病性不同，可分為高、低和非致病性3種類型[6]。其中，高致病性禽流感 （ Highly Pathogenic Avian Influenza， HPAI） H5亞型和 H7亞型，傳染性最強，發(fā)病率和死亡率最高，造成的疫情，對家禽和人類危害最嚴重[7]。因此，接種疫苗以及對家禽進行禽流感的檢測是預(yù)防和控制禽流感發(fā)生的有效措施[8-9]。在高致病禽流感 H5和 H7免疫防治過程中，由于場地、母源抗體干擾及操作方法不當(dāng)?shù)龋斐擅庖弑Ｗo不夠[9-11]。本研究對儋州市16個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的雞場采集血清，采用血凝（ HA）和血凝抑制（ HI）試驗方法對禽流感 H5、H7亞型免疫抗體進行檢測，并對抗體水平進行分析?？陀^評價儋州市雞 H5、H7免疫效果，以期對儋州市雞禽流感抗體水平有一個正確的認識，對海南省無規(guī)定動物疫病示范區(qū)和自由貿(mào)易港建設(shè)均具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑

阿氏（Alsevers）液 （自配）;1%雞紅細胞懸液（ 自配）; pH 7.2、0.01 mol/L PBS;禽流感病毒 H5亞型（ Re-11株）血凝血抑實驗抗原（國生生物，試劑批號：20191106）;禽流感病毒 H7亞型（ Re-2株）血凝血抑實驗抗原（國生生物，試劑批號：20191014）。

1.1.2儀器設(shè)備

微量移液器;槍頭;96孔 V型微量反應(yīng)板;微型振蕩器;高速離心機;恒溫箱。

1.2方法

1.2.1樣品采集

1.2.1.1取血

于2020年12月在儋州市16個鎮(zhèn)的養(yǎng)雞場（戶）采集血樣302份。采用雞翼內(nèi)靜脈采血法，把家禽側(cè)臥保定，展開雞翅，拔除采血部位的部分羽毛，取酒精棉球?qū)Σ裳课贿M行消毒，然后將采血器針尖斜口向上，以 30°傾斜插入翅靜脈，緩緩抽取血液，達到所需血量后，用酒精棉球按壓以止血[12-13]。

1.2.1.2血清制備

取適量血樣以2000 r/min 離心5～8 min，取上清液于1.5 mL 滅菌離心管中， -20℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.2.2血凝實驗（HA）

（1）分別吸取0.025 mL PBS液加到酶標板微孔的1～12孔中，換滴頭。

（2）吸取病毒懸液0.025 mL 加入至第1孔混勻，再從第1孔吸取0.025 mL 加入至第2孔混勻，如此反復(fù)，依次稀釋至第11孔，再從第11孔吸取0.025 mL，棄之，換滴頭。

（3）每孔各加入 PBS 0.025 mL，體積分數(shù)為1%雞紅細胞懸液0.025 mL，振蕩混勻，室溫（20～25℃）靜置40 min觀察結(jié)果。

結(jié)果判定∶傾斜反應(yīng)板，紅細胞無呈淚滴狀流淌（完全血凝）的抗原的最高稀釋倍數(shù)表示一個血凝單位（ HAU）。本實驗的一個血凝單位為256。

1.2.3血凝抑制實驗（HI ）

（1）根據(jù)血凝（ HA）試驗結(jié)果配制4HAU 的病毒抗原。

（2）在微量反應(yīng)板的1～11孔加入0.025 mL PBS，第12孔加人0.05 mL PBS。

（3）吸取0.025 mL血清加入第1孔內(nèi)，充分混勻后吸0.025 mL 于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.25 mL棄去。

（4）1～11孔分別加入含4HAU 的病毒抗原液0.025 mL，室溫（20℃）靜置至少30 min。

（5）每孔加入0.025 mL 體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液混勻，靜置約40 min （室溫約20℃，若環(huán)境溫度太高可置4℃條件下進行），對照紅細胞將呈現(xiàn)紐扣狀的物質(zhì)沉于孔底。

結(jié)果判定：以完全抑制4個 HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為 HI 滴度。HI 價小于或等于3log2判定 HI 試驗為陰性; HI 價≥4log2為陽性;或按照高致病性禽流感診斷技術(shù)（GB/T 18936—2003）進行陽性率的判定。

2結(jié)果與分析

2.1 H5血凝血抑檢測結(jié)果

抗體檢測結(jié)果見表1。從表1可以得出，2020年秋季儋州市16個鎮(zhèn)的雞禽流感 H5免疫合格率分別為80%、60%、 100%、85%、 100%、 100%、75%、100%、 65%、 85%、 90%、 80%、 100%、 80%、 60%、55%，有12個鎮(zhèn)的抗體合格率均達到國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的標準（群體抗體水平≥70%）。其中，雞禽流感 H5亞型抗體合格率達到100%的鎮(zhèn)有 C、E、F、H 和 M鎮(zhèn)，達到90%≤抗體合格率<100%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 K 鎮(zhèn)，這些地區(qū)的抗體水平高，免疫效果顯著，表明這些地區(qū)雞禽流感 H5亞型的防疫工作受到充分重視，工作落實到位，筑牢了免疫屏障。在80%≤抗體合格率<90%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)有 A、D、J、L 和 N鎮(zhèn)，表明這些鎮(zhèn)的抗體水平較高，免疫效果較好，雞禽流感 H5亞型防疫工作落實較好。在70%≤抗體合格率<80%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 G鎮(zhèn)，表明 G鎮(zhèn)的抗體水平良好，免疫效果一般，防疫工作要進一步加強，努力做得更好。除此之外，B鎮(zhèn)、I鎮(zhèn)、 O 鎮(zhèn)和 P 鎮(zhèn)的抗體水平不達標（群體抗體水平<70%），表明這些地區(qū)的防疫工作做得不到位，雞禽流感 H5亞型的防疫工作還應(yīng)進一步扎實。

2.2 H7血凝血抑檢測結(jié)果

從表2可以得出，2020年秋季儋州市16個鎮(zhèn)的雞禽流感 H7免疫合格率分別為90%、75%、100%、0、 100%、 100%、 0、 100%、 65%、 100%、 100%、25%、100%、90%、87%、30%， 11個鎮(zhèn)的抗體合格率均達到國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的標準（群體抗體水平≥70%）。其中，雞禽流感 H7亞型抗體合格率達到100%的鎮(zhèn)有 C、E、F、H、J、K 和 M鎮(zhèn)，達到90%≤抗體合格率<100%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)有 A鎮(zhèn)和 N鎮(zhèn)，這些地區(qū)的抗體水平高，免疫效果顯著，表明大多數(shù)地區(qū)雞禽流感 H7亞型的防疫工作受到充分重視，工作落實到位，筑牢了免疫屏障。在80%≤抗體合格率<90%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 O鎮(zhèn)，表明 O鎮(zhèn)抗體水平較高，免疫效果較好，雞禽流感 H7亞型防疫工作落實較好。在70%≤抗體合格率<80%區(qū)間的鄉(xiāng)鎮(zhèn)只有 B鎮(zhèn)，表明 B鎮(zhèn)的抗體水平良好，免疫效果一般，防疫工作要進一步加強，努力做得更好。除此之外，D、G、I、L 和 P 鎮(zhèn)的抗體水平不達標（群體抗體水平<70%），表明這些地區(qū)的防疫工作做得不到位，雞禽流感 H7亞型的防疫工作還應(yīng)進一步扎實。

結(jié)合表1與表2的結(jié)果分析可得，秋季檢測302份雞血清中，雞禽流感 H5、H7亞型免疫抗體陽性數(shù)分別是247、215份，合格率分別是82%、71%， H5、H7亞型免疫抗體合格率均達到國家標準。

3討論與結(jié)論

3.1討論

從檢測結(jié)果上看，儋州市雞禽流感 H5和 H7亞型整體免疫效果良好，免疫抗體合格率均達到了國家標準，表明2020年秋季儋州市雞總體上已建立起了較好的免疫機能屏障，禽流感流行風(fēng)險較低，但也存在少數(shù)鄉(xiāng)鎮(zhèn)禽流感抗體水平較低的現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的原因可能與雞群產(chǎn)生抗體時間、疫苗的質(zhì)量、免疫操作的規(guī)范程度、雞群的飼養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān)[15-16]。

從不同類型雞禽流感免疫抗體水平上看，H5亞型抗體合格率整體略高于 H7亞型，這可能與養(yǎng)殖人員對防疫工作的重視程度、冬春季節(jié)的防疫工作落實情況有關(guān)，也可能與不同疫苗毒株有不同的免疫原性有關(guān)[17-18]。

3.2結(jié)論

從檢測結(jié)果可知，2020年秋季儋州市雞禽流感 H5以及 H7免疫抗體合格率分別是82%、71%，均符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的標準。說明 H5和 H7亞型禽流感二聯(lián)苗的免疫效果較好，有較強的保護力。同時，針對抗體水平不達標的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，建議全面排查原因，及時補免，進一步提高免疫抗體合格率，強化免疫屏障。

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（編輯排版：林海妹）