胡海林，劉子毓，何清湖，3*，周興

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410036；2. 湘潭縣中醫(yī)醫(yī)院，湖南 湘潭 411228；3. 湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南 懷化 418002；4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

隨著工業(yè)化及城鎮(zhèn)化的進(jìn)展以及現(xiàn)代男性生活習(xí)慣的改變，男性不育癥的發(fā)病率逐年提高，約占不孕不育原因的50%［1］。在諸多男性不育的病因中，精子濃度低（少精子癥）、精子運動性差（弱精子癥）是主要原因［2-3］。少精子癥是指男性精液中每毫升所含精子數(shù)量＜15×106；弱精子癥，又稱精子活力低下，是指男性精液中所含的前向運動精子所占百分比＜32%。在男性不育患者中，少精子癥與弱精子癥常常一起發(fā)生，故二者合并稱之為少弱精子癥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對此采用手術(shù)加以抗氧化劑、激素類等治療以及輔助生殖技術(shù)［4-6］，但是醫(yī)療費用昂貴。少弱精子癥作為不育問題最常見的疑難病，不僅對男性患者身心造成極大痛苦，而且嚴(yán)重影響家庭和諧及社會的穩(wěn)定。

中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中無該病名的記載，根據(jù)其表現(xiàn)癥狀，大多歸屬于“無子”“精少”“精薄”“精清”“艱嗣”等范疇。病機多以腎虛為本，與心、肝、脾密切相關(guān)［7-8］。龜鹿二仙膏由鹿角膠、龜甲膠、人參、枸杞子組成。本方源自明代《醫(yī)便》，稱：“此方試極效，專治男婦真元虛損、久不孕育……服此膠百日，即有孕生男，應(yīng)驗神效?！爆F(xiàn)多用以治療腎元虛損、精血陰陽不足、筋骨形體失養(yǎng)五臟失充所致的腰膝酸軟、形體瘦削、發(fā)脫齒搖、陽痿遺精、男子精少不育、未老先衰等諸虛百損之癥［9］。中醫(yī)藥能通過調(diào)節(jié)氣血陰陽平衡，取得較好的治療效果［10-11］，而且擁有簡便、價格低廉的巨大優(yōu)勢。

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（Cystic fibrosis transmembrane conduction regulator，CFTR）是一種通過cAMP 依賴的磷酸化負(fù)離子通道調(diào)節(jié)因子，廣泛表達(dá)在包括生殖道上皮細(xì)胞的各種各樣的組織，影響著相應(yīng)組織細(xì)胞的代謝與分泌功能。有研究發(fā)現(xiàn)［12-13］，CFTR基因的任何突變均會導(dǎo)致精子功能的改變，其表達(dá)量與精子的生成過程、精子活力、獲能及頂體反應(yīng)等呈正相關(guān)。目前，國內(nèi)對CFTR 表達(dá)異常的研究重點較多的集中在呼吸道疾病、心血管疾?。?4-15］。這些組織中含有大量的陰離子通道：呼吸部的陰離子通道能使呼吸道黏膜保持濕潤，將黏液及其附著的灰塵顆粒向外移動，使呼吸道避免受刺激；心肌細(xì)胞上的離子通道可以傳導(dǎo)生物電活動，引起心肌收縮等。許多研究顯示CFTR 蛋白的表達(dá)異常與男性不育密切，但是也有研究顯示CFTR 蛋白的表達(dá)與男性不育，特別是非梗阻性少精子癥的發(fā)生并無關(guān)系［16］。

本研究通過復(fù)制少弱精癥大鼠模型，觀察龜鹿二仙膏對其改善作用，探究其對CFTR蛋白表達(dá)的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級正常雄性SD 大鼠50 只，5～6 周齡，體質(zhì)量200～220 g，采購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房，動物質(zhì)量合格證號：43004700058874，自由飲水?dāng)z食，飼養(yǎng)實驗室溫度維持在18～26 ℃，濕度在55%左右，每日常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物

龜鹿二仙膏組成藥物有龜甲膠、鹿角膠、人參、枸杞子，采用單味中藥顆粒（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：180930）；左卡尼汀口服液（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號：181251）；右歸丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號：17013609）；腺嘌呤（上海麥克林生化科技有限公司，貨號：A6279-100 g）。

1.3 主要設(shè)備

電泳儀（中國北京六一生物科技有限公司，貨號：DYY-6C）；臺式冷凍離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司，貨號：H1650R）；生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司，貨號：BioPrep-24）；自動精子分析儀（南寧松景天倫生物科技有限公司，ML-800Ⅲ型）；恒溫箱（南京實驗儀器廠，HG303-3K）。

1.4 主要試劑

RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0013B）；蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達(dá)生物科技有限公司，貨號：583794）；脫脂奶粉（北京普利萊公司，貨號：P1622）；Tris（美國Sigma 公司，貨號：V900483）；CFTR 抗體（英國Abcam 公司，貨號：ab2784）；β-actin（美國Proteintech 公司，貨號：6009-1-Ig）；HRP goat anti-mouse IgG（美國Proteintech 公司，貨號：SA00001-1）。

2 實驗方法

2.1 分組

將SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機數(shù)字表分為正常組、龜鹿二仙膏組、右歸丸組、左卡尼汀組和模型組。每組10只。

2.2 造模方法

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，除正常組外，其余各組每天灌胃300 mg/kg 腺嘌呤，生理鹽水配置成的混懸液2 mL/d，連續(xù)4周，復(fù)制陽虛采用型少弱精子癥模型［17-18］。

2.3 給藥

造模成功后，按照人與大鼠的體表面積換算相應(yīng)劑量灌胃。正常組與模型組大鼠給予生理鹽水，龜鹿二仙膏組每天給予2.7 g/kg龜鹿二仙膏，右歸丸組每天給予右歸丸2.6 g/kg，左卡尼汀組每天給予左卡尼汀100 mg/kg。各組大鼠每天灌胃2 mL相應(yīng)溶液，連續(xù)30 d。

2.4 標(biāo)本采集與處理

2.4.1 精子分析

末次給藥24 h 后，以10%水合氯醛3.5 mL/100 g腹腔注射，麻醉后摘取睪丸與附睪，附睪尾部放入4 mL 37 ℃臺氏液（需要提前預(yù)熱）中，用眼科剪充分剪碎，然后用移液槍稍吹打，于37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育5 min，然后吸取上層清液稀釋6倍（多次試驗后的合適濃度）后，取10 μL 懸液滴于精子計數(shù)板上，在自動精子分析儀中分析各組精子密度及活力。

2.4.2 HE染色

取睪丸組織多聚甲醛固定，24 h 后脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察睪丸生精小管形態(tài)、睪丸組織形態(tài)。

2.4.3 Western Blot檢測CFTR在細(xì)胞中的表達(dá)

稱取0.02 g睪丸組織，用冰預(yù)冷PBS 洗組織，加入200 μL RIPA裂解液，于生物樣品均質(zhì)儀中反復(fù)研磨組織，裂解10 min；4 ℃，12 000 rpm 離心15 min。移取120 μL 蛋白上清，加入體積比例為4∶1 的5 × loading buffer（蛋白上清：5×loading buffer），混勻后電泳；轉(zhuǎn)模后封閉；用1 × PBST 將一抗按照CFTR 1∶500、βactin 1∶5 000 稀釋孵育90 min，4 ℃過夜，將HRP goat anti-mouse IgG 作為二抗按1∶5 000 比例稀釋與膜孵育90 min；ECL 顯色曝光：使用ECL 化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X 膠片曝光20 min；顯影沖洗。將曝光后的底片掃描，并用quantity one 專業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析，計算CFTR/actin比值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，先檢測各組數(shù)值符合正態(tài)分布，然后進(jìn)行單因素方差齊性檢驗，再進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況

正常組大鼠精神狀態(tài)佳，飲食正常，毛發(fā)白而有光澤，活潑好動，四肢溫感正常。造模后與正常組相比，造模各組精神萎靡、蜷縮成團，飲食減少，體質(zhì)量增加減少，甚者后期體質(zhì)量減輕，毛發(fā)粗糙發(fā)黃，四肢溫感降低，大便稀溏，小便多，呈現(xiàn)一系列陽虛表現(xiàn)。給藥后，與模型組相比，體質(zhì)量增加速度上升，毛發(fā)恢復(fù)光澤，活動度增加，四肢溫感增強，陽虛表現(xiàn)均有所改善。

3.2 龜鹿二仙膏對大鼠精子密度及活力的影響

與正常組相比，模型組的精子密度明顯減低（P＜0.01）；與模型組相比，龜鹿二仙膏組、右歸丸組、左卡尼汀組大鼠的精子密度明顯升高（P＜0.01）；并且龜鹿二仙膏組精子密度稍高于右歸丸及左卡尼汀組，但龜鹿二仙膏組與右歸丸組及左卡尼汀組大鼠精子密度之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

與正常組相比，模型組的精子活力明顯更低（P＜0.01）；與模型組相比，龜鹿二仙膏組、右歸丸組、左卡尼汀組大鼠的精子活力明顯升高（P＜0.01）；龜鹿二仙膏組與右歸丸組及左卡尼汀組大鼠精子活力之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠精子密度及活力的比較（±s）

表1 各組大鼠精子密度及活力的比較（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，**P ＜0.01，△P ＜0.05。

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3.3 各組大鼠睪丸HE染色

正常組大鼠生精小管飽滿，結(jié)構(gòu)完整，小管內(nèi)生精上皮層數(shù)完整，各級生精細(xì)胞排列整齊有序，管腔內(nèi)可見大量成形的精子細(xì)胞。模型組大鼠生精小管內(nèi)生精上皮明顯萎縮，排列紊亂，且可見到大量生精細(xì)胞的缺失，管腔內(nèi)幾乎無成熟的精子細(xì)胞；龜鹿二仙膏組、右歸丸組、左卡尼汀組大鼠的睪丸組織得到了一定的修復(fù)，生精小管相對飽滿，結(jié)構(gòu)趨于完整，各級生精細(xì)胞有序，管腔內(nèi)可見較多的精子細(xì)胞。具體見圖1。

圖1 各組實驗大鼠睪丸組織形態(tài)（HE染色，×400）

3.4 各組大鼠CFTR蛋白表達(dá)情況

與正常組相比，CFTR蛋白在模型組表達(dá)明顯減低（P＜0.01）；與模型組相比較，龜鹿二仙膏組、左卡尼汀組大鼠的CFTR 蛋白表達(dá)明顯升高（P ＜0.05），龜鹿二仙膏組與右歸丸比較，CFTR 蛋白表達(dá)稍弱，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2、圖2。

表2 各組大鼠CFTR蛋白表達(dá)情況的比較（±s）

表2 各組大鼠CFTR蛋白表達(dá)情況的比較（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.01，▲P ＞0.05；與模型組比較，**P ＜0.01。

組別正常組n 5 CFTR蛋白表達(dá)量0.33±0.02 0.13±0.03*0.24±0.02**0.32±0.08**▲0.24±0.08**模型組龜鹿二仙膏組右歸丸組左卡尼汀組5 5 5 5

圖2 各組大鼠CFTR蛋白表達(dá)情況的比較

4 討論

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）包括兩個跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD1 和TMD2），兩個核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD1）以及（NBD2）和一個獨特的調(diào)節(jié)（R）區(qū)域的ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白［19］。

CFTR 與人類的生育功能密切關(guān)聯(lián)，該基因的突變常引起先天性雙側(cè)輸精管、附睪以及精囊等缺失，精子輸出、成熟和精液的完整性均受到該基因的影響，該基因表達(dá)的任何一個方面出現(xiàn)錯誤，均會引起男性不育癥。CFTR 在表達(dá)和功能上的缺陷可能會導(dǎo)致流體環(huán)境的擾動，從而導(dǎo)致精子質(zhì)量的降低，引起不育。CFTR 能通過調(diào)節(jié)負(fù)離子的跨膜運輸調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境，從而影響相應(yīng)的組織與細(xì)胞的功能。

由于附睪與睪丸周圍存在許多交感神經(jīng)，其中腎上腺素能纖維釋放去甲腎上腺素（NA）作用于其上皮的α 和β 兩類能受體，當(dāng)作用于α-腎上腺素能受體時，能夠激活Ca2+驅(qū)動的Cl-離子通道分泌電解質(zhì)。而當(dāng)β-腎上腺素能受體被激活時，cAMP 途徑就會被激活，使其驅(qū)動的Cl-離子通道分泌出所需的Cl-。正常情況下，這兩種離子通道同時存在，并且相互作用。而當(dāng)Cl-通道分泌受到阻礙時，Cl-分泌減少，從而導(dǎo)致精子濃度，黏度以及管道內(nèi)蛋白質(zhì)組分改變［20］。CFTR是人類精子受精能力的重要組成部分［21］。

龜鹿二仙膏中鹿角膠味甘、咸，性溫，入肝、腎兩經(jīng)，具有補腎陽、益精血的作用，《神農(nóng)本草經(jīng)》言鹿角膠“主傷中勞絕，腰痛羸瘦，補中益氣”。龜甲在《神農(nóng)本草經(jīng)》曰：“味甘，微寒，主補五臟，安精神、定魂魄、止驚悸；除邪氣；開心益智，久服輕身延年?！本拥男纬呻x不開Zn等微量元素和一系列氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，并且Zn等能夠起到保護(hù)精子、維持精子形態(tài)和功能的重要作用［22-23］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)［24-25］，鹿角膠和龜甲膠中富含精氨酸、谷氨酸、Zn 等多種人體必需的一系列的氨基酸和微量元素。而枸杞子，味甘，性平，歸肝、腎經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰：“味苦，寒……久服堅筋骨，輕身不老。”枸杞子的相關(guān)組成成分能夠很好的抗氧化活性，以及修復(fù)生精障礙的作用，從而改善生精功能和精子質(zhì)量［26-27］。

本次實驗中，連續(xù)給藥28 d 后模型組大鼠可見體質(zhì)量增加、飲食、活動量減少，毛質(zhì)粗糙發(fā)黃、弓背、豎發(fā)、尿量增加等腎陽虛證候，模型組的大鼠精子密度、活力較其他組均明顯降低；相應(yīng)模型組大鼠睪丸CFTR 的表達(dá)也降低了；表明腺嘌呤誘導(dǎo)大鼠的精子質(zhì)量低下，并且影響了CFTR 的表達(dá)，從而影響大鼠的生育能力。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠生精小管內(nèi)生精上皮明顯萎縮，排列紊亂，且可見到大量生精細(xì)胞的缺失，管腔內(nèi)幾乎無成熟的精子細(xì)胞；龜鹿二仙膏組大鼠的睪丸組織得到了一定的修復(fù)，生精小管相對飽滿，結(jié)構(gòu)趨于完整，各級生精細(xì)胞有序，管腔內(nèi)可見較多的精子細(xì)胞。并且龜鹿二仙膏、右歸丸對實驗大鼠的精子密度以及活力均提升（均P＜0.01）。說明龜鹿二仙膏可增殖生精上皮細(xì)胞，增加精子數(shù)量。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，少弱精子癥的病機當(dāng)以腎精虧虛為主，多見腎陽虛證候，精子的生成障礙，與腎精不足或虧損有關(guān)系，并且溫陽補腎類的中藥組方能夠顯著干預(yù)腺嘌呤所致的生殖功能的損傷［28］。腎為先天之本，藏精主生殖，腎精是生殖之精的基礎(chǔ)，生殖繁衍離不開腎精的充盈，先天不足或后天攝生不當(dāng)，導(dǎo)致腎精匱乏則生殖之精乏源，求嗣多艱［29］。張志聰《黃帝內(nèi)經(jīng)素問集注·卷二上》言：“天主生物，地主成物。故陽化萬物之氣，而吾人之氣由陽化之；陰成萬物之形，而吾人之形由陰成之。”“陰成形”形成人的形質(zhì)，“陽化氣”推動人體的功能［30］。龜鹿二仙膏由血肉有情之品組成。陰陽并補，補陽而改善外在陽虛表現(xiàn)，滋陰而促進(jìn)組織修復(fù)，促進(jìn)睪丸上皮細(xì)胞和生精細(xì)胞的生成，從而改善生精的微環(huán)境。灌胃龜鹿二仙膏、左卡尼汀、右歸丸后，實驗大鼠的睪丸的CFTR 表達(dá)得以增加，表達(dá)量遠(yuǎn)高于模型組（P＜0.01）。龜鹿二仙膏可以促進(jìn)腺嘌呤導(dǎo)致的少弱精子癥大鼠睪丸的CFTR 的表達(dá)，這與組織形態(tài)等宏觀表現(xiàn)的改善也一致。由此可見，龜鹿二仙膏可通過促進(jìn)生精細(xì)胞的生成與成長，促進(jìn)CFTR 蛋白的表達(dá)，改善睪丸組織的分泌以及代謝功能，影響精子生成的學(xué)流體環(huán)境，從而治療少弱精子癥。這也符合中醫(yī)學(xué)中腎為先天之本，主生殖，藏精的藏象理論，腎中精氣足則外腎充養(yǎng)，精子產(chǎn)生及活力強。本實驗的不足之處是僅設(shè)置了一個劑量的龜鹿二仙膏組，沒有說明不同劑量的龜鹿二仙膏之間的差異，后期實驗有待進(jìn)一步改善設(shè)計方案，以期獲得進(jìn)一步結(jié)論。