欒曉寧，郭龍宗，馬廣斌，李玉燕，王一新，鞏新民

（1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山東泰安 271018；2.山東益生種畜禽股份有限公司，山東煙臺 265509；3.山東信得科技股份有限公司，山東青島 266071）

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥（reticuloendotheliosis，RE）是由逆轉錄病毒科禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）引起雞、鴨、火雞和其他禽類的一種以淋巴-網(wǎng)狀細胞增生為特征的腫瘤性病理綜合征。REV 不但可以引起禽發(fā)生腫瘤，更重要的是，還會引起禽的免疫抑制，干擾其他禽病疫苗免疫效果，導致免疫失敗，從而繼發(fā)其他病毒混合感染，造成嚴重經(jīng)濟損失[1-2]。盡管不同毒株致病性存在差異，但目前所有REV 分離株都具有相似的抗原特性。REV 既可以水平傳播，也可以通過胚胎垂直傳播。此外，使用攜帶REV 的SPF 雞胚生產(chǎn)禽用弱毒疫苗，會造成疫苗污染，這是REV 獨特的傳播途徑之一。在我國，使用被REV 污染的弱毒疫苗被認為是造成REV 流行的一個重要原因[3-5]。

REV 呈世界性分布。流行病學調查[6-8]發(fā)現(xiàn)REV 感染在我國雞群特別是地方品系雞群中相當普遍。目前沒有商品化疫苗和藥物可用于RE 防治，主要依靠淘汰陽性種群實現(xiàn)禽群凈化。因此，對該病進行早期檢測非常重要。目前已有很多方法應用于REV 檢測，如間接免疫熒光（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）等[9-11]。其中，IFA 需要分離、培養(yǎng)病毒，操作過程繁瑣；進口ELISA 試劑盒價格昂貴，成本較高。因此，開發(fā)一種簡單快速、成本低廉的診斷方法對于監(jiān)測REV 感染十分必要。

REV gp90 蛋白是一種重要的免疫原性蛋白，在免疫應答、誘導中和抗體中起著重要作用[12]。由gag基因編碼的p30 蛋白是REV 主要的群特異性抗原，在病毒粒子的裝配中發(fā)揮著重要作用，其氨基酸組成相對保守[13]。本試驗將編碼REV 群特異性抗原的p30基因和編碼囊膜糖蛋白的gp90基因通過3×GGGS linker 串聯(lián)，在大腸桿菌中成功實現(xiàn)了串聯(lián)基因的表達。隨后，本試驗以p30-gp90 融合蛋白為包被抗原，建立了檢測REV 抗體的間接ELISA 方法，從而為RE 的診斷和檢測提供了一種良好的技術手段。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞、BL21（DE3）感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物技術有限公司；原核表達載體pET-32a（+），由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

T4 DNA 連接酶、EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），購自Solarbio公司；病毒DNA 提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒和DNA 片段純化回收試劑盒，購自北京諾貝萊生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒和Ni 瓊脂糖凝膠，購自北京碧云天生物技術公司；SDSPAGE 凝膠制備試劑盒、預染蛋白質分子質量標準，購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗雞IgY 抗體，購自Sigma 公司；雞抗REV 單因子血清，由本實驗室制備，即將REV SNV 株接種2 周齡SPF 雞，感染2 周后采血分離血清，經(jīng)ELISA 試劑盒（IDEXX公司生產(chǎn)）檢測陽性者保存?zhèn)溆?。A 亞群禽白血病病毒（ALV-A）、B 亞群禽白血病病毒（ALV-B）、J 亞群禽白血病病毒（ALV-J）、雞馬立克氏病病毒（MDV）、雞傳染性貧血病毒（CAV）和雞呼腸孤病毒（REO）陽性血清，由本實驗室將相應毒株接種SPF 雞制備；雞新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）和雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）陽性血清，由本實驗室將相應商業(yè)化疫苗接種SPF 雞制備。

1.3 p30-gp90 融合基因擴增

使用Primer Premier 5.0 軟件設計引物（表1）。其中在p30-F 引物序列中添加EcoRⅠ酶切位點，在gp90-R 引物序列中添加SalⅠ酶切位點，在p30-R 和gp90-F 引物序列中添加3×GGGS linker序列。引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。以REV SNV 株（GenBank 登錄號：DQ003591）基因組RNA 為模板，通過RT-PCR 分別擴增p30和gp90基因序列。隨后，以p30-F 和gp90-R 為引物，以p30和gp90基因擴增產(chǎn)物為模板，通過融合PCR 將兩者串聯(lián)，并連接到pMD-18T 載體，所構建質粒命名為pMD-p30-gp90。

表1 試驗所用引物序列

1.4 p30-gp90 原核表達質粒構建與鑒定

同時使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ，酶切pMD-p30-gp90 質粒和pET-32a（+）載體，再將p30-gp90 膠回收片段和pET-32a（+）載體16 ℃連接4 h；連接產(chǎn)物轉化至DH5α 感受態(tài)細胞，挑取單菌落進行菌液PCR 鑒定，提取質粒并送北京睿博興科生物技術有限公司進行測序。將所構建的原核表達質粒命名為pET-p30-gp90。

1.5 p30-gp90 融合蛋白誘導表達及可溶性分析

將pET-p30-gp90 原核表達質粒轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素的瓊脂板，篩選陽性重組菌；取0.5 mL 重組菌液加入到50 mL LB 培養(yǎng)基中，置于200 r/min，37 ℃搖床中培養(yǎng)至菌液OD600值達到0.5 左右，再加入IPTG 至終濃度1 mmol/L，28 ℃誘導6 h；將菌液4 000 r/min 離心10 min，棄上清，利用5 mL PBS 重懸菌體，超聲破碎菌體（300 W，破碎3 s，間歇3 s，100 次）；對超聲破碎后的菌體12 000 r/min，4 ℃離心10 min，分別收集上清和沉淀（包涵體），并使用8 mol/L 尿素溶解包涵體；將上清和包涵體進行SDS-PAGE 電泳，并通過考馬斯亮藍染色分析。

1.6 p30-gp90 融合蛋白純化及鑒定

取5 mL 重組菌液加至500 mL LB 培養(yǎng)基中進行誘導表達。收集包涵體沉淀，以Ni-瓊脂糖凝膠為基質進行蛋白純化，操作步驟參照碧云天生物技術有限公司的His 標簽蛋白純化試劑盒說明書進行。通過Western blot 對純化后的蛋白進行鑒定，將純化后的p30-gp90 蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳后，轉至PVDF 膜上，并以5%的脫脂奶粉-PBST溶液室溫下封閉1 h，以PBST 洗滌3 次，每次10 min；加入雞抗REV 單因子血清，4 ℃孵育過夜，再以相同方法洗滌3 次，加入HRP 標記的山羊抗雞IgY 抗體，37 ℃孵育1 h，以同樣方法洗滌后加入ECL 發(fā)光液顯色。

1.7 間接ELISA 檢測方法建立

采用棋盤法，以0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液（pH9.6）為稀釋液，將純化后的p30-gp90 蛋白分別稀釋至0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL，各取100 μL 加入反應板，4 ℃包被過夜；用0.5%PBST 洗滌3 次，每次5 min，每孔加入300 μL 5%脫脂乳溶液于37 ℃封閉2 h；隨后，每孔按1:200稀釋度加入100 μL 陰性、陽性血清，37 ℃孵育1 h；洗滌3 次，每孔加入100 μL HRP 標記的山羊抗雞IgY 抗體，37 ℃孵育1 h；洗滌3 次，每孔加入100 μL TMB 顯色液反應10 min；最后，每孔加入50 μL 2 mol/L 的H2SO4終止顯色，使用酶標儀檢測OD450值。根據(jù)OD450結果計算P/N值，選擇P/N最大時的條件作為抗原最佳包被濃度。

1.8 最佳反應條件摸索

以1.7 確定的最適抗原包被濃度包被p30-gp90蛋白，洗板后加入5%脫脂乳封閉液封閉2 h；隨后，分別將陰性和陽性血清進行1:200、1:400、1:600 和1:800 稀釋，37 ℃孵育一抗1 h，其余操作同步驟1.7；使用酶標儀檢測OD450值后，選擇P/N最大時的條件作為檢測血清的最佳稀釋倍數(shù)。同理，摸索最佳二抗稀釋度、最適血清和二抗孵育時間、最佳顯色時間和最佳封閉條件。其中，二抗分別進行1:3 000、1:5 000 和1:8 000 稀釋，血清和二抗孵育時間設為30、45、60 min，顯色時間分別設為5、10、15 和20 min，封閉條件使用5%脫脂奶粉分別封閉1、2、3 和4 h。最后，經(jīng)酶標儀測定OD450后，當P/N值最大時，作為最佳反應條件。

1.9 臨界值確定

采集150 份SPF 雞血清，根據(jù)已確定的最佳反應條件進行p30-gp90 間接ELISA 方法檢測，經(jīng)酶標儀測定吸光值后，計算150 份樣品OD450平均值（χ）及標準差（s），根據(jù)統(tǒng)計學原理，以χ＋3s作為臨界值。當樣品OD450≥χ＋3s時判定為REV 抗體陽性，OD450＜χ+3s時判定樣品為陰性。

1.10 特異性測定

分別選擇ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV、CAV、REO、NDV、AIV、IBV、IBDV 和ILTV 陽性血清，應用建立的p30-gp90 間接ELISA 檢測方法進行測定，每份血清重復檢測3 孔，檢測所建立方法的特異性。

1.11 靈敏度測定

將REV 抗體陽性血清進行1:100～1:102 400的兩倍倍比稀釋，分別使用本試驗建立的間接ELISA、IFA 和IDEXX REV 抗體檢測試劑盒進行檢測，每份血清重復檢測3 孔，檢測所建立方法的靈敏度。

1.12 重復性測定

分別從同批次及不同批次酶標板中各選擇3 組，通過本試驗建立的ELISA 檢測方法隨機抽5 份陽性樣品和5 份陰性樣品進行檢測，每份樣品3 個重復。經(jīng)酶標儀測定吸光值后，計算每份樣品及s，算出每份樣品的變異系數(shù)（CV），

1.13 臨床樣本檢測

將在山東省5 個不同商品代蛋雞場采集的690份臨床血清樣品，通過本試驗建立的方法和IFA 方法進行檢測，計算兩種方法的陽性率和符合率。

2 結果

2.1 目的基因擴增

利用融合PCR 技術，將REVp30和gp90基因片段通過3×GGGS 標簽串聯(lián)到一起。結果（圖1）顯示，融合基因PCR 擴增產(chǎn)物長度為1 968 bp，與預期片段大小相符。

圖1 p30-gp90 融合基因PCR 擴增結果

2.2 p30-gp90 融合基因重組質粒構建與鑒定

將構建的重組質粒進行EcoRⅠ/SalⅠ雙酶切，結果出現(xiàn)兩條帶，大小約為5 900和2 000 bp（圖2）。將陽性質粒送至北京睿博興科生物技術有限公司進行測序，然后與REV SNV 株基因序列進行比對，未發(fā)現(xiàn)有突變。將所構建的融合基因重組質粒命名為pET-p30-gp90。

圖2 pET-p30-gp90 原核表達質粒雙酶切驗證結果

2.3 p30-gp90 融合蛋白誘導表達及可溶性分析

將pET-p30-gp90 質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，取陽性重組菌進行誘導表達，分別分離包涵體和上清進行SDS-PAGE 鑒定。結果（圖3）顯示，p30-gp90 融合蛋白成功表達，相對分子質量大小為90.2 kDa，且p30-gp90 融合蛋白主要以包涵體形式表達。

圖3 p30-gp90 融合蛋白誘導表達結果

2.4 p30-gp90 融合蛋白純化鑒定

對p30-gp90 包涵體蛋白通過Ni 瓊脂糖凝膠純化，取純化后的融合蛋白，以雞抗REV 單因子血清為一抗進行Western blot 鑒定。結果顯示，在90.2 kDa 處出現(xiàn)特異性條帶（圖4），表明重組蛋白獲得了正確表達且能夠被雞源抗體所識別。

圖4 p30-gp90 融合蛋白Western blot 檢測結果

2.5 間接ELISA 最佳反應條件確定

通過方陣試驗對間接ELISA 反應條件進行優(yōu)化。結果（表2）顯示：當重組蛋白抗原量為100 ng/孔（抗原質量濃度為1 μg/mL）時，陽性血清OD450與陰性血清OD450的P/N值最高。因此確定抗原最佳包被濃度為100 ng/孔。按上述條件繼續(xù)進行后續(xù)條件篩選，根據(jù)P/N值進一步明確最佳一抗稀釋倍數(shù)為1:600，一抗孵育時間為30 min，酶標二抗稀釋倍數(shù)為1:5 000，酶標二抗孵育時間為30 min，底物顯色為室溫放置15 min，封閉條件為5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h。

表2 棋盤法確定最佳包被抗原濃度及血清一抗稀釋度

2.6 間接ELISA 臨界值確定

在已確定的最佳反應條件下，對150 份陰性血清進行測定。經(jīng)計算，其χ=0.099 1，s=0.021 9。故間接ELISA 臨界值確定為0.099 1 ＋3×0.021 9=0.165，當OD450≥0.165 時判定為陽性，OD450＜0.165 時即判定為陰性。

2.7 特異性檢驗

應用本試驗建立的間接ELISA 檢測方法對常見禽病原抗體進行檢測。結果顯示，該方法對ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV、CIAV、ARV、NDV、AIV、IBDV、IBV 和ILTV 的OD450平 均值 分 別 為0.086、0.081、0.094、0.117、0.064、0.113、0.058、0.074、0.104、0.054 和0.074，表明該方法無交叉特異性反應。

2.8 靈敏度檢驗

將REV 抗體陽性血清從1:100～1:102 400 進行倍比稀釋，同時使用本試驗建立的ELISA 方法、商品化REV 抗體檢測試劑盒和IFA 進行測定。結果顯示，本試驗所建立的ELISA 方法最低檢測限為1:51 200（圖5），商品化REV 抗體檢測試劑盒的最低檢測限為1:25 600（圖6），而IFA 的最低檢測限為1:6 400（未附圖片）。因此，本試驗所建立ELISA 方法的靈敏度是商品化REV 抗體ELISA 檢測試劑盒的2 倍，IFA 方法的8 倍。

圖5 本試驗所建立的間接ELISA對不同稀釋倍數(shù)陽性血清的檢測結果

圖6 商品化ELISA 試劑盒對不同稀釋倍數(shù)陽性血清的檢測結果

2.9 重復性檢驗

選取200 份雞血清樣品，利用本試驗所建立的間接ELISA 方法進行批內(nèi)和批間重復性檢測。結果顯示：批內(nèi)變異系數(shù)為2.6%～5.4%，平均值為3.4%；批間變異系數(shù)為1.7%～3.8%，平均值為2.4%。這表明建立的間接ELISA 方法變異程度低，重復性好。

2.10 臨床樣品檢測

采用本試驗建立的間接ELISA 方法和IFA 對采自山東省商品代雞場的690 份血清樣品進行檢測。結果（表3）顯示，在690 份檢測樣品中，本試驗建立的間接ELISA 方法檢出144 份陽性樣品（陽性率20.87%），其中123 份為IFA 陽性，其余546 份樣品經(jīng)間接ELISA 和IFA 檢測均為陰性，兩種檢測方法的符合率為96.96%（669/690）。

表3 使用間接ELISA 和IFA 檢測臨床樣品中REV 抗體的結果對比 單位：份

3 討論

RE 是一種重要的致腫瘤性疾病。雖然由REV單獨感染引起的死亡率不高，但REV 可以造成感染禽瘦小，生長遲緩，并誘發(fā)嚴重的免疫抑制，從而給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。目前，REV 感染在世界范圍內(nèi)已非常普遍。本實驗室之前的流行病學調查[6]顯示，REV 在我國流行越來越嚴重，特別是在地方品系雞群中，REV 血清抗體陽性率逐年升高。使用被REV 污染的弱毒疫苗被認為是導致我國REV 流行的一個重要因素[3-5]。目前，尚無針對RE 切實可行的治療措施，也沒有商品化疫苗可以使用。由于REV 可以通過垂直方式傳播，目前主要通過不斷淘汰感染種群以達到凈化目的。因此，建立一個靈敏度高、特異性強的免疫學檢測方法對于RE 的診斷和監(jiān)測具有重要意義。ELISA 方法因操作簡單、快速，敏感性高、特異性強，實驗設備要求簡單等而被廣泛應用于獸醫(yī)臨床血清學檢測。國外REV 抗體ELISA 檢測試劑盒已商業(yè)化生產(chǎn)，但昂貴的價格限制了其在國內(nèi)的大規(guī)模使用。

REV 屬于正反轉錄病毒科γ 反轉錄病毒屬，其基因組是單股正鏈RNA，編碼gag、pol和env3個結構基因以及兩端的長末端重復序列。gag基因編碼1 個多聚蛋白，該蛋白被酶切為5 個結構蛋白，即p12、pp18、pp20、p30 和pp10。P30 是REV的群特異性抗原，在病毒組裝中起重要作用[13]。由于p30 序列相對保守，因此該蛋白可用于REV抗體監(jiān)測。與p30基因相比，env基因在不同毒株中差異較大[14]。REVenv基因編碼病毒囊膜糖蛋白，該蛋白由gp90（surface protein，SU）和gp20（transmembrane protein，TM）組成。gp90 蛋白含有順序和構象抗原表位，是REV 的保護性抗原，能夠激發(fā)感染宿主產(chǎn)生中和抗體[15]。在病毒-宿主相互作用過程中，gp90 與細胞受體結合，引起gp20 構象改變，介導REV 入胞。在真核系統(tǒng)中表達gp90 蛋白所制備的亞單位疫苗，可有效保護宿主免受REV 感染。

由于gp90 是REV 的主要免疫保護性抗原，能夠誘發(fā)機體產(chǎn)生高水平抗體，因此有研究[16-17]建立了基于gp90 蛋白的REV 抗體ELISA 檢測方法。但與商業(yè)化試劑盒相比，基于gp90 蛋白的ELISA 檢測方法靈敏度仍然不足[17]。考慮到p30是REV 的群特異性抗原，理論上基于p30 的檢測方法能提高檢測的特異性。因此，本試驗嘗試將REV 的群特異性抗原p30 和主要免疫保護性抗原gp90 融合表達，并將其作為間接ELISA 方法的包被抗原，以期提高其靈敏度和特異性。Western blot結果顯示，雞REV 單因子血清能夠識別大腸桿菌表達的重組p30-gp90 融合蛋白，證實該重組蛋白可作為ELISA 的包被抗原。隨后，本試驗對基于p30-gp90融合蛋白的間接ELISA方法進行了優(yōu)化，并對該方法的特異性、靈敏度和重復性進行了評價。結果顯示，本試驗所建立的間接ELISA 方法對其他常見禽類病原體的陽性血清無交叉反應；其靈敏度是IFA 的8 倍，是商品化ELISA 抗體檢測試劑盒的2 倍；且本試驗所建立間接ELISA 方法的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%。最后，使用本試驗所建立的方法對收集的690 份臨床血清進行檢測，結果表明，同IFA 相比，p30-gp90 間接ELISA 方法的總體符合率為96.96%。上述結果證實，本方法具有良好的特異性、靈敏度和特異性。

綜上所述，本試驗建立了基于p30-gp90 融合蛋白的REV 抗體間接ELISA 檢測方法。該方法特異性強、靈敏度高、重復性好，可用于RE 臨床診斷和監(jiān)測，為有效防控REV 傳播流行提供了良好的技術手段。