王繼隆，劉 偉，楊文波，李培倫，唐富江，魯萬橋，楊 健，姜 濤

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黑龍江流域漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，黑龍江 哈爾濱 150070；3.中國水產(chǎn)科學研究院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)遙感科學觀測實驗站，北京100141；4.中國水產(chǎn)科學研究院資源與環(huán)境研究中心，北京100141；5.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，長江中下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境評價與資源養(yǎng)護重點實驗室，江蘇 無錫 214081)

大麻哈魚(Oncorhynchusketa)屬溯河洄游性魚類，其廣泛分布于北太平洋及其沿岸的淡水河流中。我國境內(nèi)大麻哈魚分為4個地理種群，即黑龍江、烏蘇里江、綏芬河和圖們江群體。每年春季大麻哈魚幼魚降河進入海洋生活階段，秋季發(fā)育成熟后的大麻哈魚上溯至出生河流產(chǎn)卵繁殖[1]。目前我國對大麻哈魚的研究多集中在回歸群體數(shù)量結構[2]、生物學特征[3-4]、種群劃定[5]等方面，由于研究區(qū)域限制，對其生活史方面的研究非常少見。通過對魚類生活史特征的研究能夠更全面的掌握其生態(tài)習性并能對不同群體進行有效區(qū)分[6-9]，還可為魚類資源保護工作提供科學依據(jù)。

耳石微化學分析技術可以有效反演洄游性魚類的生境履歷，在魚類生活史研究方面的應用較為廣泛。Dou和 Yang 等采用耳石Sr、Ca元素分析研究了刀鱭的生活史特征及生態(tài)類型劃分[10-11]，王繼隆等通過耳石微化學分析首次證實了烏蘇里白鮭具有江海洄游的生活史特征[12]，Sukyung 采用耳石微量元素分析研究了北美、韓國水域大麻哈魚種群鑒定和江海洄游的生活史特征[13]。此外，耳石微化學還應用于魚類標記放流工作中并取得較好效果[14-15]。我國大麻哈魚增殖放流工作已持續(xù)開展三十多年，增殖放流效果評估工作在逐漸開展[16]。大麻哈魚增殖群體和自然野生群體間的鑒別是增殖放流效果評估工作開展的前提和基礎。

目前大麻哈魚增殖放流群體和自然野生群體的鑒別主要依賴所采取的標記方法，因各種方法都具有一定的優(yōu)缺點，尚未形成統(tǒng)一的標記方法。根據(jù)大麻哈魚個體早期生活史的差異而進行群體間的辨別具有較好的應用前景。目前關于我國大麻哈魚生活史方面的研究尚未見報道。因此，本研究采用X射線電子探針微區(qū)分析技術(EPMA)分析大麻哈魚耳石鍶、鈣元素的變化規(guī)律，分析大麻哈魚關鍵生活史特征，同時利用大麻哈魚不同群體間生境的差異性探討不同生活史群組間的辨別方法。這將為大麻哈魚的生活史特征分析及增殖放流工作中群體鑒別提供一種有效的研究方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究大麻哈魚樣本分為4組：自然野生組、人工增殖放流鍶標記組、物理標記組和人工養(yǎng)殖組。其中自然野生組由在綏芬河、烏蘇里江等水域中捕獲的大麻哈魚自然野生個體的回歸群體組成；人工增殖放流鍶標記組由在湯旺河水域放流的鍶標記群體的回歸個體組成，鍶標記方法為在受精卵發(fā)眼后至出膜期間在培育水體中(平列槽中流動水體)添加氯化鍶水溶液(Sr2+初始濃度為30 mg/L)，每隔12 h加入一次，持續(xù)3 d；人工增殖放流物理標記組由在湯旺河、綏芬河水域放流的物理標記群體(剪脂鰭)的回歸個體組成，人工增殖放流苗種的親魚均來自各河流的回歸群體；人工養(yǎng)殖組由人工養(yǎng)殖的大麻哈魚個體組成，大麻哈魚親本采自烏蘇里江回歸群體，經(jīng)人工繁殖的受精卵發(fā)眼后轉運至煙臺東方海洋漁業(yè)公司，受精卵先在淡水中孵化，待幼魚培育至體叉長7～10 cm后轉移至鹽度為28的海水工廠化車間養(yǎng)殖，養(yǎng)殖期間投喂人工餌料。

本研究大麻哈魚樣本共計15尾，其中自然野生組5尾，人工增殖鍶標記組2尾，人工增殖物理標記組5尾，人工養(yǎng)殖組3尾(見表1)。其中大麻哈魚自然野生組及人工增殖組樣本于2016和2018年采捕于綏芬河東寧段、烏蘇里江虎頭鎮(zhèn)江段以及湯旺河湯原段(見圖1)，江河樣本采捕方式為刺網(wǎng)(網(wǎng)目大小10 cm)。對采捕的大麻哈魚樣本現(xiàn)場測量體叉長、稱量體質(zhì)量。人工養(yǎng)殖組大麻哈魚樣本來自于2014和2015年大麻哈魚受精卵轉運至煙臺東方海洋漁業(yè)公司的養(yǎng)殖群體，并于2016年10月采集于該公司的養(yǎng)殖車間。所有實驗樣品帶回實驗室測量、解剖，取出矢耳石，經(jīng)去離子水清洗、室溫干燥后待用。

圖1 樣品采集點Fig.1 Sampling sites

表1 大麻哈魚樣本基本信息Table 1 Basic information of Oncorhynchus keta samples

1.2 耳石微化學方法

元素微化學分析統(tǒng)一選用左矢耳石為實驗材料，使用環(huán)氧樹脂將耳石樣品包埋、固定，用切割機、磨拋機將耳石切割、打磨，精磨至耳石核心區(qū)域，采用有機織布拋光盤拋光，使耳石核心完全暴露且表面無明顯劃痕。將處理后的耳石樹脂塊放入MQ水中超聲清洗5 min，室溫晾干24 h。完全晾干后將樣品置于真空鍍膜機(JEE-420，日本JEOL公司)中蒸鍍碳膜(36A，25S)。采用EPMA(JXA-8100，日本JEOL公司)對樣本進行Sr、Ca元素分析。

定量線分析 標準樣品使用碳酸鈣CaCO3和鈦酸鍶SrTiO3；機器條件為加速電壓15 kV，電子束電流2.0×10-8A，每點駐留時間為15 s。此外分析束斑直徑和間距分別為5和10 μm。檢測時沿著垂直于耳石頭、尾部連線且過耳石核心的直線，從耳石核心至耳石背部邊緣進行耳石Sr/Ca值的定量線分析。

面分布分析 機器條件為加速電壓15 kV，電子束電流5.0×10-7A，每點駐留時間為30 ms；束斑直徑5 μm，像素7 μm×7 μm。

1.3 淡水系數(shù)RC

根據(jù)Jiang等的公式[17]，大麻哈魚的淡水系數(shù)RC=Rf/RT，式中Rf為自耳石核心沿定量分析線方向至對應淡水生境(低Sr/Ca值)區(qū)域結束時的徑長，RT為沿定量分析線從耳石核心至邊緣的耳石徑長。該系數(shù)反映了洄游性魚類早期生活在淡水環(huán)境中的時間占整個生活史時間的比例，也體現(xiàn)了洄游性魚類對淡水生境的依存程度。

2 結果

2.1 大麻哈魚耳石Sr/Ca值的定量線分析

大麻哈魚樣本體叉長范圍為35.3～71.8 cm，體質(zhì)量范圍為359.7～3 901.3 g，年齡范圍為1+～5+齡，樣本的其他基本信息見表1。大麻哈魚耳石樣本定量線分析結果顯示(見圖2)，耳石Sr/Ca值波動明顯，Sr/Ca值范圍為0.6×103～21.5×103。Sr/Ca值顯著變化反映其生境轉換，據(jù)此可將各組大麻哈魚的生活史階段進行劃分(見表2)。大麻哈魚自然野生組的生活史分為四個階段：第一個階段Sr/Ca值平均為4.201×103，為受精卵發(fā)眼期至卵黃囊吸收完前期；第二個階段Sr/Ca值平均為2.577×103，為Sr/Ca值的低值區(qū)，該階段為卵黃囊吸收完至降海前期；第三個階段Sr/Ca值平均為6.154×103，為海洋生活階段；第四個階段Sr/Ca值平均為5.421×103，為溯河洄游至淡水河流生活階段。同理，根據(jù)Sr/Ca值可將人工增殖鍶標記組、人工增殖物理標記組、人工養(yǎng)殖組大麻哈魚生活史分別劃分為6個、4個和3個階段(見表2)?？梢?，根據(jù)耳石微化學特征分析的各組大麻哈魚具有相似的生活史特征，但也存在一定的差異性。

表2 大麻哈魚耳石徑長Sr/Ca值變化及對應生活史階段Table 2 Sr/Ca value of otolith diameter length and corresponding life stages of Oncorhynchus keta

(圖中紅色虛線和數(shù)字表示年輪位置和編號。The red dotted line and numbers in the figure indicate the location and the number of the annual ring.)圖2 大麻哈魚耳石Sr/Ca值定量線分析Fig.2 Fluctuation of otoliths Sr/Ca concentration ratios along line transects from the core (0 μm)to the edge in otoliths of Oncorhynchus keta

根據(jù)大麻哈魚耳石微化學分析結果計算大麻哈魚不同生活階段的耳石徑長參數(shù)。如圖3所示，RT為大麻哈魚耳石核心至邊緣的徑長、Rf1為早期淡水生活階段時的耳石徑長、Rf2為上溯至淡水河流生活階段時的耳石徑長、RL為大麻哈魚卵黃囊吸收完至幼魚降海前期的耳石徑長跨度。結果顯示大麻哈魚自然野生組與其他3組(人工增殖鍶標記組、人工增殖物理標記組和人工養(yǎng)殖組)之間耳石的徑長參數(shù)(Rf1和RL)差異顯著。為了便于表述，下文將上述3組統(tǒng)稱為人工增養(yǎng)殖組。由表3可知，自然野生組：120 μm≤Rf1≤200 μm，20 μm≤RL≤30 μm，0.06≤RC≤0.10；人工增養(yǎng)殖組：240 μm≤Rf1≤470 μm，80 μm≤RL≤200 μm，0.15≤RC≤0.29。可見兩組間Rf1、RL和RC值的范圍無交集，差異顯著，可作為大麻哈魚群組間鑒別的依據(jù)。

根據(jù)大麻哈魚體叉長與耳石徑長的正比例關系，結合耳石徑長參數(shù)可推算各階段的體叉長(見表3)。由Rf1推算大麻哈魚幼魚降海期的體叉長(L0)，自然野生組：33.27 mm≤L0≤47.83 mm；人工增養(yǎng)殖組：75.27 mm≤L0≤165.63 mm?？梢?，人工增養(yǎng)殖大麻哈魚降海期幼魚的體叉長顯著高于自然野生組。

(A為自然野生組，B為人工增養(yǎng)殖組。A stand for wild group,B stand for artificial group.)圖3 大麻哈魚自然野生組與人工增養(yǎng)殖組不同生活階段耳石徑長(距耳石核心的長度)參數(shù)特征Fig.3 Characteristics of otolith length parameters (distance from the core)in different life stages of wild and artificial groups of Oncorhynchus keta

表3 大麻哈魚耳石徑長內(nèi)鍶和鈣微化學及微結構變化Table 3 Fluctuation of Sr and Ca microchemistry and microstructure in otoliths of Oncorhynchus keta

2.2 大麻哈魚耳石Sr含量的面分布

耳石Sr含量的面分析更能直觀的展示魚類個體的生境特征。由圖4可知，大麻哈魚樣本耳石剖面均包含3種顏色：藍、黃、紅，這3種顏色分別代表鍶含量濃度值依次遞增。除耳石鍶標記個體外其余樣本耳石中心區(qū)域均呈現(xiàn)黃色，自核心區(qū)域向外擴展呈現(xiàn)黃色、藍色及黃、紅色區(qū)域等交替出現(xiàn)。說明耳石鍶元素含量先下降，后增加，隨后在高值區(qū)波動。耳石鍶標記組個體在早期標記階段區(qū)域呈現(xiàn)紅色的高鍶環(huán)，這是有別于其他非標記組個體的主要特征。其他區(qū)域鍶含量的變動規(guī)律和非鍶標記群體基本一致。可見，耳石鍶元素面分析的分布規(guī)律和定量線分析中Sr/Ca值的結果一致。

圖4 大麻哈魚耳石鍶含量的面分析(圖片編號同表1)Fig.4 Otolith Sr content of Oncorhynchus keta with X-ray intensity mapping analysis(The picture number is the same as that in table 1)

3 討論

3.1 大麻哈魚生活史特征

對大麻哈魚生活史的研究能更全面的掌握其生態(tài)習性，有助于對其資源的保護。由于研究區(qū)域限制我國境內(nèi)僅能對河流中的大麻哈魚回歸群體和降海幼魚進行調(diào)查，無法了解其海洋階段的生活史。耳石微化學分析為魚類生活史特征研究提供了一種新的有效的研究手段[6,18]。魚類將體內(nèi)吸收的元素沉浸在耳石中而不會被分解，通過耳石元素分析能夠反演魚類生境特征信息[19-20]。其中耳石中鍶元素濃度與水體的鹽度成正相關關系[21-23]，通過耳石鍶元素濃度及Sr/Ca值能夠反演其棲息水體的鹽度[24-27]，分析其關鍵生活史特征。本研究中大麻哈魚自然野生組耳石樣本核心區(qū)Sr/Ca值約為4×103，隨著徑長的增加該值逐漸下降((2～3)×103)，形成Sr/Ca值的低值區(qū)，隨后該值逐漸升高，此后Sr/Ca值在高值區(qū)波動，最后階段呈下降趨勢。這主要因為大麻哈魚受精卵在發(fā)眼期形成耳石核心[28]，在其受精卵發(fā)眼期至卵黃囊吸收完期間，耳石元素主要來源于母體的卵黃囊，卵黃囊吸收完之后耳石中的Sr元素主要受淡水環(huán)境的影響。卵黃囊的形成主要在海洋生活階段，其鍶元素的含量高于淡水環(huán)境。故耳石核心區(qū)的Sr濃度以及Sr/Ca值高于其后的純淡水生活階段[14]。大麻哈魚幼魚降海進入咸水后Sr/Ca值逐漸升高，在海洋生活階段大麻哈魚Sr濃度及Sr/Ca值在高值區(qū)波動，這主要是由不同海域水體環(huán)境以及大麻哈魚自身生理因素的影響所致[13]。

根據(jù)Sr/Ca值定量線分析可將大麻哈魚生活史劃分為早期淡水孵化階段、海洋生活階段、溯河洄游至淡水階段等，結合耳石微結構分析可推測大麻哈魚各生活階段的體叉長等信息以及大麻哈魚在各生長階段棲息環(huán)境信息。表2顯示了大麻哈魚自然野生組幼魚降海進入咸水區(qū)的體叉長范圍為33.27～47.83 mm，據(jù)調(diào)查大麻哈魚野生群體降海期幼魚的體叉長為3～4 cm，可見大麻哈魚順水流降河遷移入海期間時間較短，在河流中不做長時間停留。這種現(xiàn)象在大麻哈魚幼魚降海行為的觀察實驗中得到證實[29]。大麻哈魚溯河洄游階段耳石鍶元素受海洋生活環(huán)境的滯后效應和溯河期淡水環(huán)境的雙重影響，在此階段內(nèi)的大部分耳石樣本的Sr濃度及Sr/Ca值呈下降趨勢，但個別樣本由于進入淡水環(huán)境的時間較短，這種現(xiàn)象并不顯著。

大麻哈魚人工增殖鍶標記組個體在其早期淡水孵化階段由于鍶標記的影響，耳石Sr濃度以及Sr/Ca值(約17×103)顯著高于其他未標記組(Sr/Ca值為(2～4)×103)。這也體現(xiàn)了鍶標記組個體具有在高鍶環(huán)境中的生活史。鍶元素在耳石上的沉積具有滯后性[15,30]，本研究中鍶標記的滯后期對應耳石徑長上的距離大概為20 μm。該組個體在鍶標記后的耳石微化學特征和其他組相似，體現(xiàn)了大麻哈魚組間的個體在降海、海洋中的遷移等相似的生活史特征。人工增殖物理標記組個體所劃分的生活史階段以及Sr/Ca值范圍和自然野生組相似。人工養(yǎng)殖大麻哈魚和其他群組相比沒有上溯至淡水河流的生活階段，僅體現(xiàn)其淡水-海水之間生境變化的特征。可見，除鍶標記組之外，其他組間個體的生活史特征相似，但是大麻哈魚耳石徑長參數(shù)(如Rf1和RL)在人工增養(yǎng)殖和自然野生群組個體之間存在顯著的差異，這也體現(xiàn)兩群組間個體早期生活環(huán)境的不同。綜上所述，耳石微化學分析能夠成功反演大麻哈魚的生境履歷，揭示其關鍵生活史特征。

3.2 大麻哈魚不同群組間的鑒別

大麻哈魚人工增殖群體與自然野生群體的鑒別是增殖放流效果評估工作的前提，標記技術在群體鑒別工作中發(fā)揮重要作用。大麻哈魚人工增殖放流苗種的標記方法主要有物理標記(剪脂鰭)、耳石鍶標記和溫度標記等[15-16,31]。其中耳石鍶標記方法安全、高效，在魚類增殖放流工作中應用廣泛[14,32]。本研究中大麻哈魚鍶標記組中的個體通過在流動孵化水體中加入SrCl2·6H2O水溶液(每日兩次)進行鍶標記，Sr2+初始濃度為30 mg/L。分析結果表明大麻哈魚耳石標記區(qū)Sr/Ca值約為17×103左右，雖低于在靜置水體中標記方法的值[15]，但該方法足以將標記和非標記群組有效區(qū)分。鍶標記方法可根據(jù)Sr2+濃度梯度、標記時期及時間跨度的不同而將不同放流批次的群體進行有效的區(qū)分，能夠實現(xiàn)對不同批次、不同地點放流群體辨別的目的。

除鍶標記組外，本文基于耳石微化學分析方法利用自然野生組和人工增養(yǎng)殖組個體在早期淡水孵化環(huán)境的差異來進行群組間的鑒別。人工培育的大麻哈魚受精卵在流水中孵化，水源為地下水，水溫恒定，較自然野生組孵化水體(河流)的水溫高，發(fā)育更快。人工培育大麻哈魚放流時期和自然野生組幼魚降海期(4—5月)基本一致(作者調(diào)查數(shù)據(jù)，未發(fā)表)，故人工增養(yǎng)殖組大麻哈魚卵黃囊吸收完至降海期間的淡水生長階段長于自然野生組。因此，大麻哈魚人工增養(yǎng)殖組耳石徑長參數(shù)Rf1、RL和淡水系數(shù)RC顯著高于自然野生組，據(jù)此可有效區(qū)分兩群組。此鑒別方法不需對放流苗種進行特定的標記，僅利用兩群組間個體早期孵化環(huán)境的不同而進行區(qū)分。但此方法僅能對大麻哈魚自然野生組和人工增養(yǎng)殖組間個體鑒別，不能區(qū)分不同放流批次的個體，且該方法僅適用于大麻哈魚等溯河洄游性魚類，對其他非淡、海水間洄游的魚類并不適用。

本文通過耳石微化學手段分析大麻哈魚不同組間樣本耳石Sr濃度及Sr/Ca值，反演了各組個體的生境履歷。根據(jù)大麻哈魚不同組間個體在淡水孵化階段棲息環(huán)境的差異，采用耳石微化學、微結構分析將自然野生和人工增養(yǎng)殖個體進行有效的區(qū)分。為探究大麻哈魚洄游生活史特征及其生態(tài)意義提供重要參考，為大麻哈魚群體鑒別及增殖放流效果評估工作提供重要的研究手段。